Name: 緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ 細菌エフェクターの可視化法。Pseudomonas syringaeのIII型分泌系を用いて、Nicotiana benthamianaとArabidopsis thalianaの細胞内に分泌されたエフェクターを分割GFPシステムで観察する手法を解説。植物と微生物の相互作用研究に有用です。

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この研究は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省、ICT および DC の将来計画 (NRF 2018R1A2A1A05019892)、(植物分子育種センターからの助成金を資金によって支えられました。PMBC) の EP に農村開発局 (PJ013201) の次世代 Biogreen 21 プログラムの撮影のための共焦点顕微鏡を提供する環境管理センター計装のイメージング センターに感謝いたします。

注: 特に明記しない限り、すべての手順が常温で実行をされます。
1. 植物材料 (4 週間) の準備
<ol><li>(名) 形質転換植物のための準備<ol>
<li>各ポットの土の表面に(名) ベンサミアーナの 2 種をまく、プラスチック製のドームを持つトレイを蓋をして 25 ° C、16/8 h/暗日長サイクル 60% 湿度成長室で発芽する種子を許可します。</li>
		<li>2 週間後を選ぶと各ポットに小さな芽を破棄し、ステップ 1.1.1 の発芽の同じ成長の条件の下で植物を成長を続けます。2 日毎トレイあたりの水の 1 リットルを追加します。 注: ラボ間植物の成長の条件が異なる場合があります。したがって、健全な状態で植物を育てる正規の水まきプロトコルに従います。</li>
		<li>週に新しいトレイに植物を転送し、さらなる成長のための十分なスペースを配置します。4 週齢に潜入する準備ができるまで、手順 1.1.1 で説明した条件の下で植物の成長を維持します。 注: 植物の成長は、ラボ間成長条件によって異なる場合があります。通常、我々 は 4 週齢を見つける(名) 形質転換植物負担約六つの葉。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シロイヌナズナ形質転換植物のための準備<ol>
<li>材料表を参照し、形質転換シロイヌナズナ種子の注文します。</li>
		<li>1 mL の蒸留水に 50 ~ 100 形質転換シロイヌナズナ種子を浸漬し、発芽の発症を同期する暗闇の中で 3 日間の 4 ° C で保存します。</li>
		<li>プラグ工場トレイの土壌表面に 2 ~ 3 種をまくし、プラスチック製のドームとトレイをカバーします。23 ° C、10/14 h/暗日長サイクル 60% 湿度で発芽する種子を許可します。 注: 種子についてをする必要があります。ただし、バッチ内の遺伝子の存在を再確認をお勧めします。この場合、70% エタノール、50% の漂白剤の 2 分間洗浄することにより種子を殺菌する (約 2% 次亜塩素酸) 0.05% を含む 5 分トリトン X-100 に従う二重滅菌蒸留水 (ddH2O) で 5-6 回を洗浄します。滅菌後、3 日間の 4 ° C で分類や形質転換植物を選択する hygromycin B の 25 μ g/L を含む植物発芽メディアにそれらを板します。</li>
		<li>週後に、プラグあたり 1 つだけの工場を残して、ステップ 1.2.3 の使用同じ成長の条件の下で植物の成長を続けます。 注: 4 週古い植物は、 P. 腐感染に使用されました。水植物は植物を健康に保つために毎日。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2.緑膿菌文化 (〜 1 週) の準備
<ol><li>緑膿菌の変換のプラスミドの建設<ol>
<li>材料表を参照し、T3SS ベース エフェクター配信システム ベクター25の目的の vector(s) を注文します。</li>
		<li>25をクローニング部位特異的組換えを使ってエフェクタ配信ベクトルに興味のエフェクター遺伝子を挿入します。 メモ: フルレングス エフェクター蛋白質の細胞内局在を監視する場合は、pBK-GW-1-2 または pBG-GW-1-2 にフルレングスの遺伝子を置きます。PBK-GW-1-4 を選択するもまたは pBG GW 1 4 2 を含む x sfGFP11 の蛍光信号を増加しました。シグナルペプチドを欠けている部分的なエフェクター、場合 pBK-GW-2-2 または pBK-GW-2-4 を使用します。公園らエフェクター配信ベクトル25の詳細についてを参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>P. 腐pv sfGFP11 タグに融合したエフェクターを運ぶプラスミッドを変換します。トマト(Pst)CUCPB5500 標準エレクトロポレーション29を使用します。 注: 必要な場合は、他の緑膿菌種を使用できます。広範囲なベクトル30 sfGFP11 タグのシステムを構築し、エフェクターの遺伝子発現は、緑膿菌などのfluorescens (イーサン)31に匹敵する AvrRpm1 のプロモーターによって規制されています。</li>
	<li>変形菌を 25 μ G/ml ゲンタマイシンや 25 μ G/ml カナマイシン 100 μ g/mL リファンピシンを含む王の B 寒天の表面に優しく します。2 日間の 28 ° C の孵化させなさい。</li>
	<li>使用すると、ベクトルの適切な抗生物質で王の B 液体メディアに 1 つのコロニーを接種して 200 rpm で振とうしながら一晩で 28 ° C 細胞の成長します。</li>
	<li>グリセロール ストックを作る。オートクレーブのグリセロールを最終濃度 50%、-80 ° C でストアに追加します。</li>
</ol>3. (名) ベンサミアーナ(4 日間) で細胞小器官をターゲットとした sfGFP1 10OPTの一過性発現
<ol><li>アグロバクテリウム文化の準備<ol>
<li>(材料の表を参照してください) の細胞小器官をターゲットとした sfGFP1 10OPT plasmid(s) の目的の vector(s) を注文します。</li>
		<li>アグロバクテリウムひずみ GV3101 細胞32plasmid(s) に変換します。2 日間の 50 μ g/mL カナマイシンと 28 ° C で 50 μ g/mL リファンピシン ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天培に細胞を成長します。</li>
		<li>LB 寒天培地の単一コロニーから 5 mL の液体 LB 培地 50 μ G/ml カナマイシンおよび 50 μ G/ml のリファンピシンに細胞を接種します。200 rpm で振とうしながら一晩で 28 ° C 細胞を成長します。</li>
		<li>3,000 x g で 10 分間の遠心分離によって細胞培養上清中のメディアを注ぐし、たての 1 mL にペレットを再懸濁します収穫した浸潤バッファーです。</li>
		<li>600 の吸光度で光学濃度 (OD) の値を取得することによってアグロバクテリウムの量を測定 (Abs 600 nm) の nm。浸潤バッファーと 0.5 に細菌の OD600を調整します。 注: 懸濁液の 1 mL は、2 つのスポットに潜入するのに十分です。</li>
		<li>常温浸透前に 1-5 h の穏やかなロッカーに文化を残します。</li>
		<li>10 μ L チップと潜入する葉の中心に穴を突きます。アグロバクテリウムの懸濁液に潜入するのに 1 mL の無針注射器を使用します。慎重に、ゆっくりと注入する注射器を介して葉の向軸側にステップ 3.1.5 から調製した懸濁液の約 500 μ L。実験的複製に対して、少なくとも 3 つの異なる植物に浸透を繰り返します。 注: 保健及び安全性の理由から、眼の保護は浸透中に着用する必要があります。</li>
		<li>葉の残りの細菌懸濁液を拭き取るし、浸透した領域の境界をマークします。</li>
		<li>2 日間ステップ 1.1.1 の使用同じ成長の条件の下で浸透した植物を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.膿(4 日間) の接種
<ol><li>2 日間の 28 ° C で適切な抗生物質で王の B 寒天にステップ 2.5 のグリセロール ストックから変換された緑膿菌のひずみを連勝します。 注:緑膿菌の健康は非常に重要です。植民地にもなっていない場合、セルを再び連勝または進む前に王の液体培地における細胞に伝達します。</li>
	<li>マンニトール グルタミン酸 (MG) 一晩 200 rpm で振とうしながら 28 ° C で液体培地における緑膿菌細胞の loopful を接種します。</li>
	<li>3,000 x g で 10 分間の遠心分離によって細胞を培養上清中のメディアを注ぐ収穫 10 mM MgCl2でペレットを再懸濁し、0.02 (1 x 107 cfu/mL) に外径600を調整(名) ベンサミアーナ葉と 0.002 (1 x 106cfu/mL)シロイヌナズナの葉.の
</li>
	<li>(名) ベンサミアーナ、sfGFP1 10OPTコンストラクトを運ぶアグロバクテリウムが以前 (ようにステップ 3.1.7) 2 日浸透していた葉の領域に緑膿菌懸濁液を浸透します。SfGFP1 10OPT形質転換シロイヌナズナ、2 つ 4 週齢短い日成長して葉に緑膿菌懸濁液を浸透します。 注: 少なくとも 3 つの植物実験複製が必要です。</li>
</ol>5. sfGFP 共焦点顕微鏡 (1 日) を介して信号の観測
<ol><li>緑膿菌からリーフ ディスクをカット-の葉を接種しました。緑膿菌を浸潤した特定の時間ポイントで画像 40 X を用いた共焦点走査型レーザーによる単一の植物からの 2 つの 2 cm2リーフ ディスク/1.2 NA C アポクロマート水浸対物レンズまたは 63 X/0.8 NA C アポクロマート油浸漬目的。負傷によって殺される死んだ細胞を避けるためには、浸透孔から細胞を観察します。</li>
	<li>488 nm アルゴン レーザーの低消費電力設定で観察を開始します。SfGFP を検出するレーザー力を高めます。 注:、蛍光シグナルを検出するのにレーザー強度の 2-15% を通常使用します。ただし、レーザーの出力と検出設定調整してくださいユーザーの顕微鏡システムに基づいて。ここでは、放出フィルターは 520-550 nm に設定されました。死んだ細胞はしばしば 488 nm レーザー励起下における自動蛍光を発する。したがって、ネガティブ コントロールとして sfGFP11 タグなし同じエフェクターを浸透し、同じ観測条件下で観察する必要があります。さらに、高いレーザー励起はクロロフィルの自家蛍光を引き起こすことができます。したがって、クロロフィルの自家蛍光を誘発しないようにコントロール植物細胞を用いたレーザー光源の強度を調整します。<ol>
<li>細胞壁の counterstaining の 20 mM propidium ヨウ化 (PI) を観測する前に 5-10 分でリーフ ディスクに潜入させます。</li>
		<li>核染色、水で洗浄後 5 分 0.1% パラホルムアルデヒドにリーフ ディスクが水没します。その後、顕微鏡観察の前に 5-10 分でリーフ ディスクに 10 mM PI に潜入します。少なくとも 3 回実験を繰り返します。 注: この手順は重要な膜や核でエフェクターのローカリゼーションを定義する役に立つです。関心のエフェクターは、特定の細胞小器官の局在を示した場合は、エフェクターの局在を確認する特定の細胞小器官のマーカーを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者はある利益相反を開示します。

ここで説明したプロトコルを使用して、感染にホスト植物細胞注入の細菌 T3SS エフェクタータンパク質の正確な局在を監視するため。以前は、分割 GFP システムは哺乳類タンパク質23,36の内局、サルモネラT3E ローカリゼーション、アグロバクテリウムVirE2 配信に T4SS を通じて研究するツールとして使用された、植物は細胞37をです。植物細胞でこのシステムを適用すると、以前の研究は、遺伝子組換えトウモロコシ植物細胞質 GFP1 10 と遺伝子組換え菌を恒常表す経路、GFP11 タグ エフェクター蛋白質を表現を使用します。ただし、トウモロコシ ・米国アルテリシジンシステムは転エフェクター蛋白質の表現のレベルが弱いため高レベルのバック グラウンド蛍光妨げ再構成された GFP シグナル38の検出成功していません。この問題を解決するために sfGFP1 10...

植物は、細菌、真菌、ウイルス、昆虫、線虫のライフ サイクル全体を含む多数の侵入病原体が発生する付着生物です。病菌属やシュードモナス属などのグラム陰性の細菌性病原体、植物の中で傷や気孔、イネなどの自然開口部を介して入力することによって宿主植物に感染する1。正常にホスト植物を植民地化、細菌性病原体は様々 な病原性因子2を開発する進化しています。細菌には、宿主の植物が侵入する、彼らは病原性タンパク質のシリーズを注入-エフェクターとして知られている-病原性を促進するために植物細胞に直接。これらのエフェクターを抑制する植物の免疫を調節するや細菌生存3が発生するホストの細胞プロセスを操作します。
病原細菌は、主にホスト セル4に直接エフェクタータンパク質を提供するのに、T3SS を使用します。T3SS ホスト細胞5の注射部位に内側と外側の細菌膜足場タンパク質の構造から接続する針のようなチャネルを持つ分子注射器に似ています。この T3SS を介したエフェクター (T3E) 分泌メカニズムが人間と同様に植物の様々 なグラム陰性細菌病原体でよく保存されています。代表的な植物病原体、 P. 腐pv の一つ。トマト欠陥 T3SS の通常ある DC3000 hrcC変異は、この突然変異体植物 (エフェクター蛋白質を注入する) による免疫6を完全に抑制するのことができない可能性があります植物の成長を制限しています。宿主細胞への移行、時にエフェクター対象植物防御反応、遺伝子の転写、細胞死、プロテアソーム、小胞の売買、およびホルモン経路7を含め、ホスト細胞システムにとって重要な様々 なホスト蛋白質,8,9,10します。 したがって、宿主細胞のエフェクター蛋白質の局在の追跡は植物の免疫系の変調に関してその機能を理解するための魅力的なターゲットです。
T3Es の局在論のほとんどは、アグロバクテリウム-仲介されたホスト植物9に大きな蛍光タンパク質の過剰発現を採用しています。ただし、他の種で導入された遺伝子の異種表現方法は誤ってローカライズ済みまたは時折機能的な11,12,13に示されています。さらに、いくつかの研究は、細菌のエフェクターがホスト細胞報14,15,16,17の適切なターゲットのための変更を受けることを明らかにしました。したがって、一過性細胞は機能的または定量的病原体感染18時 T3SS によって配信されるエフェクターと同じかもしれない植物の細胞質内のエフェクタを表明しました。また、適切なエフェクターの配信と可視化18,19を破壊するエフェクタータンパク質に大きな蛍光タグ融合かもしれない。したがって、完全に T3E 関数を試金するこれらのアプローチは T3SS 分泌エフェクタのネイティブのローカライズを反映可能性があります。
緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発色団20含まれています中央の鎖を囲む 11 鎖 β バレルで構成されます。ワルドら小さな部品で構成される新規分割 GFP システムを報告 (GFP β ストランドの 11;GFP11) と大規模な相補的なフラグメント (GFP β ストランド 1-10;GFP1-10)21。フラグメント自ら発するかないが、両方のフラグメントは、互いに近接するとき自己集合時に蛍光を発する。蛋白質折りたたみ効率の最適化のため、GFP、すなわちsfGFP と sfGFPOPT、堅牢な折りたたみ変形後分割 GFP システム20,21,22 のため開発されました。最近では、単一のアミノ酸変異亜種 sfGFP1 10 のOPT- sfYFP1 10OPTと sfCFP1 10OPT- をそれぞれ sfGFP11 フラグメントとを黄色とシアン蛍光再構成することができます, 生成された23.さらに、sfCherry、mCherry の派生物を裂くことができる sfGFP23と同じ方法で sfCherry1 10 と sfCherry11 の断片に。
このシステムは、ラベルおよびサルモネラ24.からエフェクタを使用して感染中に HeLa 細胞における T3SS エフェクタを追跡に適応されています。ただし、それは以前最適化されていないホスト植物細菌病原体システムのため。最近では、我々 は植物細胞25にP. 腐から配信される T3Es の細胞内分布を監視する改良された sfGFP1 10OPTに基づく分割 GFP システムを最適化しました。様々 な細胞内コンパートメントに sfGFP1 10OPTを表現する生成された植物形質転換シロイヌナズナの植物細胞で異なる細胞内コンパートメントに T3Es の局在論を容易にするには、25です。 また、さまざまなを運ぶプラスミッド オルガネラ sfGFP1 10オプトインターゲットを絞ったアグロバクテリウム-仲介された一時的な過剰発現と T3SS ベース エフェクター配信用タグ付きの sfGFP11 ベクトルが生成されたも。様々 な形質転換シロイヌナズナラインと関心の T3Es を表現するプラスミッドの種子は、材料表26,27に記載されているソースから取得できます。
次のプロトコルの分割 sfGFP システムを用いたホスト細胞内の細菌によって配信エフェクタの原動力を監視する最適化されたシステムについて述べる.組換え sfGFP11 プラスミドを運ぶ遺伝子組換え菌と sfGFP1 10OPTを発現する植物の感染結果 sfGFP11 タグ エフェクタの宿主細胞に緑膿菌からの配信。したがって、これらの蛋白質は再構成された、特定対象区画に若し。腐の pv。トマトCUCPB5500 ひずみ 18 エフェクタが削除されますは、この株はシロイヌナズナと(名) ベンサミアーナs28低またはない細胞死を示したので使用されました。ただし、すべての材料とここで説明する手順、交換または他の生物学的質問や与えられた実験室の条件の最適化の調査の分割 sfGFP システムに適応するように変更できます。

<table><tbody><tr><td>シロイヌナズナトランスジェニックライン</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &Dinesh-Kumar, S. P. スプリット蛍光タンパク質フラグメントを使用したIII型分泌によるPseudomonas syringaeエフェクターの時空間モニタリング.植物細胞。日本赤十字・赤十字 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>のCS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td>オルガネラ標的 sfGFP1-10OPT プラスミド</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &Dinesh-Kumar, S. P. スプリット蛍光タンパク質フラグメントを使用したIII型分泌によるPseudomonas syringaeエフェクターの時空間モニタリング.植物細胞。29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97392</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP11-tagged T3SS-based effector delivery system</td><td>Park、E.、Lee、HY、Woo、J.、Choi、D.&Dinesh-Kumar, S. P. スプリット蛍光タンパク質フラグメントを使用したIII型分泌によるPseudomonas syringaeエフェクターの時空間モニタリング.植物細胞。29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)</td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba KonczおよびJeff Schell、TL-DNA遺伝子5のプロモーターは、新しいタイプのAgrobacteriumバイナリベクターによって運ばれるキメラ遺伝子の組織特異的発現を制御します。モルゲンジェネ。204,383-396 (1986);ゲンタマイシン(50 ug/ml)およびリファンピシン(50 ug/ml)</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. et al. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III分泌エフェクター遺伝子のレパートリーにおける欠失は、エフェクター間の機能的重複を明らかにしています。PLoSパトグ。5 (4) (2009).;リファンピシン(100 ug / ml)</td></tr><tr><td><ストロング>培地成分</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>植物発芽培地</ストロング></td><td></td><td></td><td>2.165g / Lムラシゲ&を追加スクーグパウダー、ショ糖10g / Lを水に。pH 5.8に調整し、2.2 g / Lのフィタジェルを追加します。.オートカルブ。</td></tr><tr><td>ムラシゲ&ビタミン</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td>を含むSkoog媒体は<td>、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>スクロー</td>ス<td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>LB培地</td><td></td><td></td><td>10 g / Lトリプトン、5 g / L酵母抽出物、10 g / L NaClを水に加えます。固体培地の場合は、15 g/Lのマイクロ寒天培地を加えます。オートクレーブ&nbsp;溶液を55°Cに冷まします。C、必要に応じて抗生物質を追加します。</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>デュチェファ生化学</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ寒天</td><td>デュチェファ生化学</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td><強い>キングスB培地</強い></td><td></td><td></td><td>10 g/L プロテアーゼ ペプトン #2、1.5 g/L 無水 K2HPO4、15 g/L の寒天を水に。オートクレーブ。55°Cまで冷却します。Cおよび滅菌15 ml/Lグリセロール、5 ml/L MgSO4を培地に加えます。必要に応じて抗生物質を追加します。</td></tr><tr><td>プロテオース・ペプトン</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>無水 K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>・デュチェファ・バイオケミー</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td><強>マンニトール-グルタミン酸(MG)液体培地</強力></td><td></td><td></td><td>10 g/Lのマンニトール、2 g/LのL-グルタミン酸、0.5 g/LのKH2PO4、0.2 g/LのNaCl、および0.2 g/LのMgSO4を水に加えます。pH 7 に調整</td></tr>する <tr><td>マンニトール</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>浸透バッファー</td><td></td><td></td><td>10 mM MES (2-(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸)、10 mM MgCl2、150 &micro;Mアセトシリンゴン。pH 5.6;使用前に新しいバッファーを準備してください。</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>100 mM(pH 5.6)のストックを水で調製します。フィルター滅菌します。</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>水に100 mMストックを調製します。オートクレーブ。</td></tr><tr><td>アセトシリンゴン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>DMSOで150 mMのストックを調製します。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡 機器/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>710レーザー走査型共焦点システム</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observer Z1 倒立顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

菌は, 各種の植物病害の最も重要な病原は、植物の免疫システムを破壊する宿主植物細胞にエフェクターのセットを分泌します。感染時に細胞質のエフェクターはタイプ III の分泌システム (T3SS) を介してホスト細胞質に配信されます。植物細胞には、出産後、effector(s) は生存と病原体のレプリケーションのためのホスト細胞プロセスを調整する特定の区画を対象します。蛍光タンパク質を用いた病原性でその機能を理解する宿主細胞のエフェクター蛋白質の局在や細菌から直接注入されるエフェクターのダイナミクスの解明に関するいくつかの研究があったもののT3SS と蛍光タンパク質との間の非互換性のためにチャレンジしております。
ここでは、エフェクター細胞内細菌 T3SS を介して配信の局在に最適化された分割 superfolder 緑の蛍光蛋白質システム (sfGFPOPT) の最新手法について述べる。SfGFP11 (11th β 鎖の sfGFP)-サイトで蛍光発光するターゲット特定のオルガネラ sfGFP1 10OPT (1-10th β 鎖 sfGFP の) リード、T3SS から分泌されるタグのエフェクターを組み立てることができます。このプロトコルは、シロイヌナズナとベンサミアーナ タバコ植物の特定の細胞小器官の腐からエフェクター蛋白質と再構成された sfGFP 蛍光信号を視覚化するための手順を提供します。

GFP の β バレル構造は 11 β ストランドの構成され、2 つのフラグメント、1 10thストランド (GFP1 10OPT) および 11th (GFP11) 繊維に分けることができます。どちらも 2 つのフラグメントを自分で蛍光の自己組織化 sfGFP は近接 (図 1 a) 2 つのフラグメントが存在するとき蛍光を生成できます。このシステムは、sfGFP1 10OPTで-植物シロイヌナズナまたは(名) ベンサミアーナを表現する緑膿菌sfGFP11 タグ付きのエフェクターを運ぶと再接種されます。宿主細胞の細胞質に緑膿菌によって配信タグ sfGFP11 エフェクター細胞質で表される sfGFP1 10OPTに再構成し一緒にターゲット コンパートメント (図 1 b) ...

挑戦している宿主細胞に細菌によって分泌されるエフェクターを監視する蛍光タンパク質ベースのアプローチ。これは蛍光タンパク質とタイプ III の分泌システムとの互換性がないのためにです。ここでは、最適化された分割 superfolder GFP システムはホスト植物の細胞に細菌によって分泌されるエフェクターの可視化に使用されます。

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

この手法は、植物細胞に分泌されるエフェクターと呼ばれるタンパク質を使用して、病原菌が宿主植物細胞の最適な状態をどのように乱すかなど、植物と微生物の相互作用分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細菌のエフェクタータンパク質が、その天然の発現システムを使用して細菌細胞内で発現され、その後、細菌III型分泌システムを介して植物細胞に送達されることです。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、Nicotiana benthamianaおよびArabidopsis thaliana植物を準備します。次に、標準的なエレクトロポレーションを使用して、sfGFP11タグに融合したプラスミドキャリーおよびエフェクター遺伝子をPseudomonas syringae pathovar tomato strainに形質転換CUCPB5500。最適な時点と発現レベル、またはsfGFPの再構成は、エフェクタータンパク質に大きく依存します。接種や観察条件の最適化を推奨します。形質転換した細菌細胞をKing's B Agarプレートの表面に静かに広げます。次に、プレートを摂氏28度で2日間インキュベートします。この後、1つの細菌コロニーをKing's B液体培地にベクターに適した抗生物質を接種します。200rpmで振とうしながら、摂氏28度で一晩インキュベートします。翌日、オートクレーブ滅菌したグリセロールを接種した培地に最終濃度50%まで加えますマイナス80°Cで保存します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、プラスミドをAgrobacterium tumefaciens株GV3101細胞に変換します。補充したLB寒天培地で28°Cで2日間細胞を増殖させます。LB寒天培地からの単一のコロニーを使用して、5ミリリットルの補充された液体LB培地を接種します。次に、200rpmで振とうしながら、細胞を摂氏28度で一晩成長させます。この後、3000 Gで10分間遠心分離し、細胞を回収します。上清を注ぎ、ペレットを1ミリリットルの新しくした浸透緩衝液に再懸濁します。分光光度計を使用して、600ナノメートルの吸光度で光学密度値を測定することにより、アグロバクテリウム細胞の量を決定します。次に、浸潤バッファーを使用して、細菌細胞のOD600を0.5に調整します。培養物を室温で穏やかなロッカーに1〜5時間放置します。葉に浸透するには、10マイクロリットルのピペットチップを使用して、各葉の中央に穴を開けます。針のない1ミリリットルの注射器を使用して、500マイクロリットルのアグロバクテリウム懸濁液を葉の同軸側に慎重に注入します。葉から残っている細菌懸濁液を拭き取り、浸潤領域の境界をマークします。浸潤した植物を摂氏25度、湿度60%の成長

split-green-fluorescent-protein-system-to-visualize-effectors

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Lee、H. ら、 感染中に細菌から送達されるエフェクターを視覚化するための緑色蛍光タンパク質システムの分割。 J. Vis. 経験。...

植物細胞における細菌感染とエフェクタータンパク質送達のモニタリング

この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。...

細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

エレクトロポレーションを使用して、精製された細菌の病原性エフェクタータンパク質を直接生きた真核細胞に挿入しました。タンパク質の局在は、共焦点免疫蛍光顕微鏡法によってモニターされました。この方法により、活性な外因性タンパク質を用いた輸送、機能、タンパク質間相互作用の研究が可能になり、真核細胞における異種発現の必要性を回避できます。...

哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション

タイプIIIの分泌システムを介した宿主細胞へのエフェクターの転座は、グラム陰性菌の間で一般的な病原性戦略です。転座の定量分析のために、β-ラクタマーゼエフェクター融合ベースのアッセイを適用しました。エルシニア感染細胞では、ベータラクタマーゼによるFRETレポーターの変換をレーザー走査型顕微鏡を用いてモニターします。...

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

細菌性病原体とそれらのホスト間の相互作用を調査することは、生物学的研究の重要な領域です。ここでは、BLAM基板を用いたsiRNAの遺伝子サイレンシング中にQ熱リケッチアによってエフェクター転座を測定するために必要な技術を記載しています。...

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;のsiRNAサイレンシング中

ここでは、強化された緑色蛍光タンパク質発現大腸菌を用いたマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するためのプロトコルを提案する.

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。...

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

この記事では、遺伝暗号拡大(GCE)部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識し、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在を画像化するための簡単で明確なプロトコルを提供します。...

遺伝暗号拡張を用いた細菌分泌タンパク質の超解像イメージング

ここでは、感染時の病原菌の臓器全体にわたる検出と蛍光レポーター活性の定量化を可能にする手順について説明します。...

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

学ぶ 細菌エフェクターの可視化法。Pseudomonas syringaeのIII型分泌系を用いて、Nicotiana benthamianaとArabidopsis thalianaの細胞内に分泌されたエフェクターを分割GFPシステムで観察する手法を解説。植物と微生物の相互作用研究に有用です。

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

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