緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

挑戦している宿主細胞に細菌によって分泌されるエフェクターを監視する蛍光タンパク質ベースのアプローチ。これは蛍光タンパク質とタイプ III の分泌システムとの互換性がないのためにです。ここでは、最適化された分割 superfolder GFP システムはホスト植物の細胞に細菌によって分泌されるエフェクターの可視化に使用されます。

この手法は、植物細胞に分泌されるエフェクターと呼ばれるタンパク質を使用して、病原菌が宿主植物細胞の最適な状態をどのように乱すかなど、植物と微生物の相互作用分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細菌のエフェクタータンパク質が、その天然の発現システムを使用して細菌細胞内で発現され、その後、細菌III型分泌システムを介して植物細胞に送達されることです。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、Nicotiana benthamianaおよびArabidopsis thaliana植物を準備します。

次に、標準的なエレクトロポレーションを使用して、sfGFP11タグに融合したプラスミドキャリーおよびエフェクター遺伝子をPseudomonas syringae pathovar tomato strainに形質転換CUCPB5500。最適な時点と発現レベル、またはsfGFPの再構成は、エフェクタータンパク質に大きく依存します。接種や観察条件の最適化を推奨します。

形質転換した細菌細胞をKing's B Agarプレートの表面に静かに広げます。次に、プレートを摂氏28度で2日間インキュベートします。この後、1つの細菌コロニーをKing's B液体培地にベクターに適した抗生物質を接種します。

200rpmで振とうしながら、摂氏28度で一晩インキュベートします。翌日、オートクレーブ滅菌したグリセロールを接種した培地に最終濃度50%まで加えますマイナス80°Cで保存します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、プラスミドをAgrobacterium tumefaciens株GV3101細胞に変換します。

補充したLB寒天培地で28°Cで2日間細胞を増殖させます。LB寒天培地からの単一のコロニーを使用して、5ミリリットルの補充された液体LB培地を接種します。次に、200rpmで振とうしながら、細胞を摂氏28度で一晩成長させます。

この後、3000 Gで10分間遠心分離し、細胞を回収します。上清を注ぎ、ペレットを1ミリリットルの新しくした浸透緩衝液に再懸濁します。分光光度計を使用して、600ナノメートルの吸光度で光学密度値を測定することにより、アグロバクテリウム細胞の量を決定します。

次に、浸潤バッファーを使用して、細菌細胞のOD600を0.5に調整します。培養物を室温で穏やかなロッカーに1〜5時間放置します。葉に浸透するには、10マイクロリットルのピペットチップを使用して、各葉の中央に穴を開けます。

針のない1ミリリットルの注射器を使用して、500マイクロリットルのアグロバクテリウム懸濁液を葉の同軸側に慎重に注入します。葉から残っている細菌懸濁液を拭き取り、浸潤領域の境界をマークします。浸潤した植物を摂氏25度、湿度60%の成長室に2日間保管します。

形質転換されたシュードモナス菌株をグリセロールストックからKing's B Agar培地に適切な抗生物質でストリークします。28°Cで2日間インキュベートします。シュードモナス細胞のループをマンニトールグルタミン酸液体培地に接種します。

培養物を200rpmで振とうしながら、摂氏28度で一晩インキュベートします。この後、3000 Gで10分間遠心分離し、細胞を回収します。上清を注ぎ、ペレットを10ミリモルの塩化マグネシウム溶液に再懸濁します。

次に、光学濃度をNicotiana benthamianaの葉の場合は0.02に、シロイヌナズナの葉の場合は0.002に調整します。Nicotiana benthamianaの葉については、2日前にAgrobacteriumが浸潤したのと同じ領域にPseudomonas懸濁液を浸潤させます。トランスジェニックシロイヌナズナについては、シュードモナス懸濁液を生後4週間の短い日帰り栽培の葉2枚に浸透させます。

最後に、シュードモナス菌を接種した葉の葉の円盤を切り取ります。シュードモナス菌の浸潤後の特定の時点で、共焦点レーザースキャンシステムを使用して、単一の植物から2、2平方センチメートルの葉の円盤を画像化します。傷によって死んだ細胞を避けるために、浸潤穴から離れた細胞を観察します。

細菌からの転座エフェクターは、非常に少量しか存在しません。したがって、レーザー出力を上げ、蛍光発光を取得して蛍光シグナルを検出できます。ただし、植物細胞からの自家蛍光による誤ったシグナルの捕捉を避けるために、無理をしないでください。

この研究では、蛍光タンパク質ベースのアプローチを使用して、細菌から宿主細胞に分泌されるエフェクターをモニターします。感染から3時間後のNicotiana benthamianaの葉の共焦点レーザースキャンをここに示します。最適化されたsfGFPをAvrBのみで発現する細胞は、蛍光シグナルを示さない。

しかし、GFPシグナルはAvrB、sfGFP11を含む感染細胞から見られます。これにより、AvrB sfGFP11複合体がサイトゾルで最適化されたsfGFPで再構成され、その後、原形質膜に移行することが確認されます。この手順を試みる際には、植物材料を健康に保ち、活性細胞用の新鮮な細菌培養を準備することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、樹脂血液分析などの他の方法を準備して、植物免疫応答中の植物細胞内の細菌エフェクタータンパク質の誤った翻訳修飾を理解することができます。このビデオを見れば、感染した植物細胞におけるIII型エフェクターの送達を視覚化する方法を十分に理解できるはずです。植物材料とバクテリア培養物は、バイオハザード廃棄物に関する研究所の基準に従って廃棄する必要があり、PPEの着用を忘れないでください。