細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

この手順の全体的な目標は、蛍光ナノ粒子をトレーサーとして使用して、細胞内細菌による末端リソソーム系のリモデリングを研究することです。これは、最初にヒーラ細胞を8ウェルチャンバースライドに播種し、一晩インキュベートすることによって達成されます。2番目のステップは、細胞にサルモネラ菌とタリカを感染させることです。

次に、感染した宿主細胞のパルスチェイス標識を、金BSAルミネナノ粒子とのインキュベーションによって行います。最後のステップは、共焦点顕微鏡法によって宿主細胞のエンドソーム系の変化を観察することです。最終的に、ナノ粒子の細胞内分布の定量化は、MRSソフトウェアパッケージを使用して行われます。

免疫顕微鏡のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、n人の感染細胞が分析されることです 方法を使用して、テリカの細胞内ライフスタイルへの洞察を提供できる。ただし、Gaia種、Ella Prolia、結核菌などの他の細胞内病原体にも適用できます。また、micro feh、細胞株、初代細胞などの他の宿主細胞タイプにも適用できます。

10ナノメートルの金ナノ粒子またはNPSの合成には、溶液Aと溶液Aを調製 B.To 溶液の2つの溶液が必要であり、160ミリリットルのミリQ水に2ミリリットルの塩化金水溶液を加えます。溶液Bを調製するには、8ミリリットルの1%クエン酸三ナトリウム二水和物と160マイクロリットルの1%タンニン酸を32ミリリットルのミリQ水に加えます。溶液AとBを摂氏60度に温め、攪拌しながら混合します。

約15分後すぐに濃い青色が観察されます。この時点で、溶液の色は赤になります。溶液を摂氏95度に加熱します。

摂氏95度に5分間保持し、溶液を室温まで冷却します。1.5ミリリットルのeinorチューブに900マイクロリットルの金MPSを追加し、15、000 Gで30分間遠心分離することにより、コーティングとラベリングのための金片を準備します。上清を捨て、ペレットを900マイクロリットルの滅菌済みMQ水に再懸濁します。.

100マイクロリットルのA BSA溶液を加え、800 RPMのボルテックスで30分間混合します。4°Cで60分間、15, 000Gで調製物を遠心分離することにより、余分なBSAを除去する。上清を捨て、金BSA NPSと125マイクロリットルのPBSを再懸濁します。

1モルの重炭酸塩を12.5マイクロリットル加えます。R domine n hydroxy CINエステルまたはNHS溶液は、直前にDMSOで調製されます。15マイクロリットルのR DOMINE N-H-S-D-M-S-O溶液で0.5ミリリットルの金BSA NP懸濁液に使用します。

反応液を室温で2時間インキュベートし、800 RPMで混合し、光に触れないようにします。次に、精製後36〜48時間の期間で5回のバッファー交換を行い、摂氏4度のPBSに対する透析を通じて金BSAルーミンNPSを精製し、10マイクロリットルのBS-A-P-B-Sを金BSAルーミンNPSの各1ミリリットルに追加してNPSを安定させ、15で遊離または放出されたBSAルーミン遠心分離機を除去します。 000GSを摂氏4度で16分間。Resusは、520ナノメートルまたはOD 5 20で光学密度を測定した後、B-S-A-P-B-Sのミリリットルあたり2ミリグラムでペレットを懸濁します。

この実験のための細胞は、永久にリソソーム糖タンパク質ランプ1GFPを発現し、50の密度で細胞を50%二酸化炭素種子を含む雰囲気で摂氏37度で10%胎児の子牛血清とDMEMで培養され、光への曝露を避け、4°Cで金BSAロッドドミンNPSを保管し、50の密度で細胞をシードします。 8ウェルチャンバースライドでウェルあたり000個をインキュベートし、一晩インキュベートします。ヘラ細胞に感染する細菌は、ヒトの胃腸病原体であるサルモネラ菌とタリカ菌です。比較のために、2つの変異株を使用します。

これら3つの菌株はすべて、増強GFPの構成的発現のためのプラスミドを保有しており、各菌株のプラスミドを維持するために適切な抗生物質を含むLBブロスで培養されます。3ミリリットルのLBブロスに細菌の単一のコロニーに適切な抗生物質を接種し、摂氏37度で一晩成長させます。翌日の曝気のために振とう条件下で、各培養物を新鮮なLBブロスで1〜31に希釈し、3時間半成長を続けます。

この手順を開始するには、継代培養細菌のOD 600を測定し、OD 600を0.2に希釈します。PBSの1ミリリットルで、A 12チャンバースライドのヘラ細胞に適切な量の細菌を添加して、100の感染の多様性を達成します。細胞インキュベーターで30分間インキュベートします。

ヘラ細胞をPBSで3回洗浄し、内在化されていない細菌を取り除きます。この時点は、感染後0時間または0時間円周率として設定されます。ゲンタマイシン1ミリリットルあたり100マイクログラムを含む300マイクロリットルの新鮮な培地を細胞に加え、1時間保持します。

1時間後。培地を、1ミリリットルあたり10マイクログラムのゲンタマイシンを含むイメージング培地と交換します。.金BSAルーミンNPSをヘラ細胞に添加して、OD 5 20の最終濃度0.1を得ます。

1時間後に1時間インキュベートします。メディウムを取り出し、PBSで3回洗います。最後に、10%FCSとゲンタマイシン1ミリリットルあたり10マイクログラムを含む300マイクロリットルの新鮮なイメージング培地を追加します。

インキュベーション時間の残りの間、温度制御システムの加湿環境チャンバースイッチを備えた共焦点レーザースキャンやスピニングディスク顕微鏡などの共焦点イメージングシステムを使用して、異なる時点での細胞の高解像度イメージングが達成され、安定するまで待ちます。スキャン倍率、速度分解能、Zステップサイズなどのイメージング設定を最適化します。感染後、指定された時点でGFPおよび金BSAルーミンNPSに適切な励起発光設定を使用してください。

感染細胞を封入したA 12チャンバースライドを顕微鏡ステージに装着し、画像を記録することで、細胞内サルモネラ菌によるエンドソーム系のリモデリングや解析を行います。画像解析ソフトウェアを使用します。データを開くには、[開く] をクリックし、surpass ビューのオブジェクト ツールバーでファイルを選択します。

アイコンをクリックして、新しいサーフェスアイテムを追加します。関心領域または ROI を分析するには、関心領域のみをセグメント化し、ソースチャネルとして [次へ] をクリックします。チャンネル 3 を選択します。

チェックします 滑らか 結果の領域の滑らかさを設定するためのオプション。値を手動で定義するか、自動的に生成された値を受け入れます。しきい値の場合。

しきい値調整の絶対強度オプションを選択します。手動オプションを選択し、表示領域に値を設定します。サーフェスしきい値のプレビューは灰色で表示されます。

[サーフェスの分類]タブで[次へ]をクリックします。結果として得られるサーフェスは、さまざまな基準でフィルタリングできます。デフォルトのフィルターは V 穴の数が 10 より大きいですが、[追加] をクリックして他のフィルターを含めることもできます。

この例では、デフォルトのフィルターを使用してサーフェスの作成を完了します。オブジェクトリストで[完了]をクリックします。アイテムのボリュームのチェックボックスをオフにします。

新しく作成されたサーフェスが表示領域に表示されます。赤で表示されている場合は、[保存] をクリックして統計を Excel ファイルにエクスポートします。このプロトコールによって合成された金NPSは、準球形で、サイズは約10ナノメートルでした。

BSAコーティングとロードミンラベリングは、それらの形態やサイズに影響を与えませんでした。細胞内サルモネラ菌による宿主細胞エンドソーム系のリモデリングを研究すること。Hela細胞は、野生型サルモネラ菌または2つの変異株に模擬感染または感染し、10ナノメートルの金でパルスチェイスされました。

BSAロッドドミンエンドウは非感染細胞で、NPSは後期エンドソームまたはリソソームに均一に分布しています。対照的に、野生型サルモネラ菌に感染した細胞のNPSは、感染後8時間で大部分が再配列されました。サルモネラ菌が誘導するフィラメントまたはふるいの安定化ネットワークが形成され、ほとんどのmpが管状構造内に蓄積していることがわかりました。

変異株は、感染後8時間で明確な振る舞いを示しました。SSAV変異株は、VAEまたはSCVを含むサルモネラ菌の内部に閉じ込められていました。ふるい分けは形成されませんでしたが、mpsの大部分は依然としてsifの遊離後期エンドソームまたはリソソームに位置していました。

サルモネラ菌の細胞質への突然変異株の脱出が起こり、NPSと細菌との関連は観察されませんでした。サルモネラ菌感染のさまざまな段階で末端リソソーム系のアクセシビリティを調べたところ、結果は、すべての場合において、内在化されたNPSのほとんどがSCVまたはSIFに蓄積したことを示していますこの手順に続いて。他の方法としては、頚部伝染顕微鏡が行うことができる。

これにより、一部のナノ感染宿主細胞の超構造や膜コンパートメントなどの追加の疑問に答えることができるかもしれません。このビデオを見れば、蛍光ナノ粒子の調製方法についてよく理解できるはずです。これらは、細胞内サルモネラ菌によって修飾されたホスターコンパートメントを標識するために使用できます。