Name: 細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学ぶ蛍光ナノ粒子を用いた細胞内細菌によるエンドソーム-リソソームシステム再構築の可視化手法。共焦点顕微鏡とMRSソフトウェアでSalmonella enterica感染HeLa細胞の動態変化を定量的に解析する革新的アプローチです。

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この研究は、Sonderforschungsbereich 944 'Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments' と HE1964/18 within priority program 1580 の助成金Zにより、Deutsche Forschungsgemeinschaftによって支援されました。

10nmの金ナノ粒子（ゴールドNPS）15の1の合成<ol><li>溶液Aを準備します160ミリリットルミリQ、または再蒸留水に2ミリリットル1％水溶液塩化金を追加します。 </li><li>溶液Bを準備します32ミリリットルミリQ、または再蒸留水に8ミリリットル、1％のトリクエン酸ナトリウム×2、H 2 Oおよび160μlの1％タンニン酸を追加します。 </li><li> 60℃に溶液A及びBをウォームアップし、攪拌しながら、それらを混合する。すぐに濃い青色を観察します。約15分後に赤色を観察します。その後、95℃まで加熱し5分間保持し、RTに溶液を冷却する。 </li><li>カーボンコーティングされたグリッド上にNP懸濁液のドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡によってNPの大きさや形態を確認してください。 </li></ol>ローダミンN-ヒドロキシエステル（NHS）とBSAとラベリングゴールドNPの2コーティング16 <ol><li> 、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに900μlの30分間15000×gで遠心機を金NPSを追加します。オペアンプtionally月一度に複数のチューブを準備します。 </li><li> 、900μlのペレットに滅菌ミリQ水を再懸濁し、100μlの2mg / mlのBSA / PBSを追加し、上清を捨て、30分間、800rpmでボルテックスに混ぜる。 </li><li>過剰のBSAを除去するために、60分間15000×gで準備を遠心する。 </li><li>上清を捨て、そして125μlのPBS中の金-BSA NPSを再サスペンド、1M重炭酸塩の12.5μlを添加する。 </li><li>使用直前に、金-BSA NPの懸濁液1ミリリットルするローダミンNHS / DMSO溶液30μlを添加、ローダミンNHS / DMSOの10 mg / mlの溶液を調製。光への暴露を避け、800rpmで混合中に室温で2時間（またはO / N）のための反応をインキュベートします。 </li><li> 48時間 - 36の期間にわたって5バッファ変更で4ºCでPBSに対して透析41612-BSA-ローダミンNPSを精製する。 </li><li> NPSを安定させるために、各1ミリリットル金-BSA-ローダミンのNPに200 mg / mlのBSA / PBSの10μlを添加する。 15で、無料またはBSA-ローダミンリリース遠心分離機を削除するには、60分間、000×gで。光への暴露を避け、4℃でOD 520、およびストアを測定する、2 mg / mlのBSA / PBSにペレットを再懸濁する。 </li><li> 、ミリQまたは二重蒸留水でNPを10倍に希釈炭素被覆グリッド上にドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡（TEM）によるNPのサイズ及び形態を確認する。 NOTE：NPの調製のために使用されるすべての材料は、滅菌した操作は、細胞培養フード内または火炎横ベンチを行った。 </li></ol>ヒーラ細胞の3文化<ol><li>永久LAMP1-GFPを発現するHeLa細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むDMEM中で培養し、5％CO 2を含む雰囲気中で37℃で増殖させている。 </li><li> 8ウェルチャンバースライド（Ibidi）においても50,000の密度で細胞を播種し、O / Nインキュベートする。 </li></ol>細菌の4。文化<ol><li>使用サルモネラ·エンテリカ血清型TyphimuriumのNCTC 12023ウィルd軸型（WT）株。比較のために、SIFのキーエフェクターSIFAを欠いSPI2-T3SSとΔSIFAにおける欠損変異株のΔssaVを使用しています。強化されたGFPの構成的発現のためのプラスミドpFPV25.1を保有する菌株を使用してください。 注：細菌株は、50μg/ mlのカルベニシリンおよび/ ​​または50μg/ mlのカナマイシン（ΔssaV、ΔSIFAを追加してルリア-ベルターニの50μg/ mlのカルベニシリン（WT）を添加した培養液（LB）とLB中で日常的に培養され、 ）プラスミドを維持するために必要である。 </li><li>適切な抗生物質で3ミリリットルのLB中の細菌の単一コロニーを接種し、新鮮なLBで1：31に希釈し、3.5時間のために成長を続ける、その後、通気のための条件をとうしながら37ºCでO / Nを育てる。この時点で、培養物を後期対数期に達し、細菌は非常に侵襲的である。 「ローラードラムは「通気試験管培養物をインキュベートするのが便利である。 </li></ol>によるHeLa細胞の感染5。サルモネラとゴールド-BSA-ローダミンNPは、チェース·ラベリングパルス（スキームについては図1を参照） <ol><li>継代培養した細菌のOD 600を測定し、OD 600に希釈= 0.2mlの1 PBS（〜3×10 8 cfu / mlで）、多数のを達成するために、8ウェルチャンバースライド中のHeLa細胞への細菌の適切な量を追加100の感染（MOI）。 </li><li> （この時点を0時間感染後、0時間のπとした）の非内在化細菌を除去するためにPBSで3回洗浄し、細胞インキュベーター中で30分間インキュベートする。 100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培養液の300μl添加し、1時間維持する。その後、インキュベーション時間の残りのための10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培地で培地を交換してください。 </li><li> 1時間、100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する培地とのインキュベーション後、培地を同時（30mMのHEPES、pH7.4で、FCS、L-グルタミン、フェノールレッド、および炭酸水素ナトリウムなしイーグルMEM）培地を撮像して置換されている10μg/ mlのゲンタマイシンをntaining。金BSA-ローダミンNPはOD 520 = 0.1の最終濃度を得るために、HeLa細胞に添加される。 NOTE：金BSA-ローダミンNPはまた、感染の前に、または種々の時点のπで細胞に添加してもよい</li><li> 1時間のインキュベーション後、培地を除去し、PBSで3回洗浄し、インキュベーション時間の残りの10％のFCSおよび10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な画像形成媒体の300μlを添加する。 注意：インキュベーションの時間は、使用のNPおよび細胞株の濃度に依存して変化し得る。 RAW264.7マクロファージに関しては、十分な内在許可OD 520 = 0.05の濃度のNPとその30分のインキュベーションを観察した。 </li></ol> 6.イメージング<ol><li>共焦点レーザー走査（CLSM）またはスピニングディスク共焦点イメージングシステムの異なる時点での高分解能イメージングのための加湿環境チャンバーと（SD）顕微鏡を使用する。 </li><li>温度Cに切り替えontrolシステム、それが安定するまで待ちます。そのような倍率、スキャン速度、分解能、ZスタックなどGFPのために適切な励起/発光の設定を使用し、金-BSA-ローダミンNPのような画像の設定を最適化します。このプロトコルのために、512×512ピクセルの400 Hzのスキャン速度、分解能および0.25μmのZ-ステップサイズを使用。それぞれ、Arレーザ（488 nm）をHeNeレーザー（543 nm）を用いて、GFPと金-BSA-ローダミンエキサイト。セルの形状を観察するための明視野（BF）のチャンネルを含める。他の顕微鏡システムおよび感染条件については、設定に応じて調整されなければならない。 NOTE：BFチャネル信号の光源がフォトマルチプライヤ（PMT）検出器で検出されたのと同じArレーザを使用する。 </li><li>指示された時点のPIでは、顕微鏡ステージと記録画像に感染した細胞を含む8ウェルチャンバースライドをマウントします。 </li></ol>画像の7.分析<ol><li>顕微鏡画像解析ソフトウェアを使用して（参照サルモネラによるエンド-リソソームシステムの再構築を分析する。 「開く」をクリックし、ファイルを選択してデータを開きます。 注：あるいは、このようなImageJのかFIJIなどのオープンソース·ソフトウェア·パッケージは、定量的画像解析に使用することができる。 </li><li>アイコンにビューを突破クリックのオブジェクトツールバーで<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg">新しい表面アイテムを追加します。上をクリック<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg"> （次）。 </li><li>関心領域（ROI）を選択し、セグメントROIを分析する。表示エリアには、画像に重ね矩形ボーダー部にROIを表している。対応するX軸、Y軸、Z-フィールドに値を入力するか、直接ROIのサイズと位置を変更するために、プレビューの長方形の矢印をクリックしてください。クリック<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src> = "/ファイル/ ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /&gt;（次へ）。 </li><li>ソースチャネルとして、セレクトチャンネル3（ゴールド-BSA-ローダミンNPのための信号）。結果の面積の滑らかさを設定するには、円滑なオプションをチェックします。手動で値を定義するか、自動的に生成された値を受け入れます。しきい値の、絶対強度オプションを選択します。 </li><li>閾値調整のために、手動オプションを選択して、値を設定します。視域では、表面閾値プレビューは灰色で表示されている。 </li><li>タブ分類表面に得られた表面は、様々な基準によってフィルタリングすることができます。デフォルトのフィルタは「&gt; 10ボクセルの数」、および他のフィルタは、「追加」をクリックして含めることができている。フィルタリングが必要でない場合は、[削除]ボタンをクリックして、すべてのフィルタを削除します。クリック<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg"> （次）。 </li><li>サーフェス作成を完了するには、上をクリック/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/&gt;（仕上げ）を。オブジェクトのリストで、現在、アイテム·ボリュームと新しい作成表面について、未チェックボックスが表示領域に表示されます。 </li><li>統計情報をエクスポートします。さて、突破ビューで被験者の色は、その面積に応じて紫から赤に変わる。そして、「プロット番号エリア」テーブルには、統計情報（ 例えば、ID番号とオブジェクトの面積）を示している。クリックでExcelファイルに面1のすべての統計情報をエクスポート<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg"> （保存）。 </li></ol>

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利益相反は宣言されていません。

哺乳動物細胞のエンドリソソーム系は、栄養吸収、ホルモン媒介性シグナル伝達、免疫監視、および抗原提示17を含む重要な生理的過程を制御する。これまで、種々のマーカーは、エンドサイトーシス経路および追跡調査を標識するために使用されてきた。例えば、リソトラッカープローブは、選択的に低い内部pHの細胞区画に蓄積し、効果的にナノモル濃度18に住んで細胞を標識することができリソソーム標識に分子プローブ（ライフテクノロジーズ、米国）が開発した蛍光acidotropicプローブ、である。しかしながら、細胞とリソトラッカープローブの長時間のインキュベーションは、リソソームpHの上昇を誘導し、リソソーム19の潜在的な生理学的変化をもたらし得る。フルオロフォアで標識されたデキストランのようないくつかの大きな生体分子は、また、しばしば、エンドソーム/リソソームの標識に使用される。しかし、低光安定性、短い循環寿命、およびp定着時OOR保持が長期の生細胞イメージングでアプリケーションを妨げると相関顕微鏡は16,19を研究。ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソ...

金属などのNP、量子ドット、ポリマーのNP、シリカNPは、カーボンドットを含む、蛍光ナノ粒子（NPは）、過去数十年の間、1,2-かなりの注目を集めている。従来の有機染料に比べて、蛍光性NPは、このような強力な信号強度、光退色に対する抵抗性及び生体適合性の高い3,4のような望ましい化学的、光学的および機械的特性を示す。これらの利点は、それらの細胞内のセンシングと生細胞イメージングのための選択の方法にする。さらに、電子密度の高いNPの様々な生細胞の組み合わせは、光学顕微鏡（LM）とEM 5と超微細構造レベルでのより高い分解能でトラッキングすることができ、相関顕微鏡分析のためのそれらの使用を容易にする、電子顕微鏡（EM）から見える。例えば、金NPは、効率的に感受性の診断のための生細胞におけるバイオセンサーとして、ならびに免疫標識6の分野で使用される長い時間であった。最近のStudiesは、異なるサイズおよび形状を有する金NPが容易に大きな電位が細胞内小胞輸送の追跡およびエンドリソソーム系標識7,8を申請しているため、細胞株の大様々な取り込みおよび日常エンドソーム経路を介して輸送され得ることを示す。 そのようなサルモネラ·エンテリカ 、 赤痢菌およびリステリアなどの微生物病原体は、非食宿主細胞9に侵入するために異なるメカニズムを開発しました。内在化された後に、病原体のいずれかのサイトゾルに局在または膜結合区画に隔離は、それらのホスト環境で広範囲に相互作用して、自分の生存10を優先するように、これらを調節する。例えば、 サルモネラ·エンテリカは、細胞内ファゴソーム区画内に存在し、複製し、感染11上にサルモネラ含有液胞（SCV）と呼ばれる。成熟SCVエンドサイトーシス経路で連続的相互作用を受けてゴルジ装置に向かうトラフィック、およびサルモネラ誘発フィラメント（SIF）などの大規模な管状構造の形成を誘導するが、ネキシン細管ソート、 サルモネラ、分泌キャリア膜タンパク質3（SCAMP3）細管など誘発。12-14。これらの細菌性病原体が宿主細胞の経路を操作する方法勉強する感染症を理解するために不可欠です。 ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソーム系を標識するために流体トレーサーとして使用し、ヒトの胃腸病原体サルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌（ サルモネラ ）と病原体の相互作用を研究するためのモデル菌として使用したエンドサイトーシス経路をホストします。 WT サルモネラまたは突然変異株を感染させた非感染細胞と細胞の細胞内の金BSA-ローダミンNPを、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で画像化した。その後IMARISソフトウェアはサルモネラ感染がエンドソーム/リソソームの極端な再配列を誘導したことを示す、NPの分布を定量した。この方法の説明に続いて、類似の実験は、内在化NPの長期の運命を追跡し、真核細胞のエンドサイトーシス経路上の様々な外因性物質または内因性因子の影響を調査するために設計することができる。

<table><tbody><tr><td>塩化金</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>タンニン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td></td><td>Σ C8532</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-ローダミン</td><td>ピアス</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>Σ D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>ロス</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8 ウェル チャンバー スライド</td><td>イビディ</td><td>80826</td><td>組織培養処理済み、滅菌</td></tr><tr><td>イマリス ソフトウェア</td><td>ビットプレーン</td><td>バージョン 7.6</td><td>さまざまな構成が利用可能</td></tr></tbody></table>

細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

望ましい化学的、光学的および機械的特性を有する蛍光ナノ粒子（NPが）、細胞内小器官を標識するための有望なツールである。ここでは、真核細胞のエンド-リソソームシステムにラベルを付け、細胞内病原体サルモネラ·エンテリカによりホスト細胞経路の操作を監視するために金-BSA-ローダミンNPSを使用する方法を紹介します。 NPは容易に後期エンドソーム/リソソームにHeLa細胞によって内在して局在していた。 サルモネラ感染症はSalmonella-誘起膜構造における小胞およびNPの蓄積の再配置を誘導した。我々は、共焦点顕微鏡画像の定量分析のためのIMARISソフトウェアパッケージを展開。非感染細胞内のオブジェクトの数とそれらのサイズ分布は、WT サルモネラによってエンドリソソーム系の非常にリモデリングを示す、 サルモネラ感染細胞におけるものとは異なっていた。

金NPは、クエン酸、タンニン酸による塩化金酸の還元を介して、十分に確立された方法により作製した。 図2Aに示すように、合成された金NPは、約10nmのサイズを有する形状に準球形であった。 BSA-コーティングおよびローダミン標識は、それらの形態や大きさ（ 図2B）に影響しませんでした。 これは、金NPは容易に種々の哺乳動物細胞により取り込まれ、エンドサイトーシスシステム7で終わったことが報告されている。以前の研究によれば、明るい赤色の蛍光シグナルは、細胞によるNPの効果的な内部移行を示す、金BSA-NPはローダミン（ 図3、WT 5時間のπ）で1時間のインキュベーション後にHeLa細胞において観察された。赤の信号のほとんどは、NPのが後期エンドソームまたはリソソーム中に閉じ込められたことを示し、緑のシグナルと共局在が認められた。しかし、後期エンドソーム/リソソームにおけるNPの一様分布とは異なり、非感染細胞（ 図3、モック）で...

この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

この手順の全体的な目標は、蛍光ナノ粒子をトレーサーとして使用して、細胞内細菌による末端リソソーム系のリモデリングを研究することです。これは、最初にヒーラ細胞を8ウェルチャンバースライドに播種し、一晩インキュベートすることによって達成されます。2番目のステップは、細胞にサルモネラ菌とタリカを感染させることです。次に、感染した宿主細胞のパルスチェイス標識を、金BSAルミネナノ粒子とのインキュベーションによって行います。最後のステップは、共焦点顕微鏡法によって宿主細胞のエンドソーム系の変化を観察することです。最終的に、ナノ粒子の細胞内分布の定量化は、MRSソフトウェアパッケージを使用して行われます。免疫顕微鏡のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、n人の感染細胞が分析されることです 方法を使用して、テリカの細胞内ライフスタイルへの洞察を提供できる。ただし、Gaia種、Ella Prolia、結核菌などの他の細胞内病原体にも適用できます。また、micro feh、細胞株、初代細胞などの他の宿主細胞タイプにも適用できます。10ナノメートルの金ナノ粒子またはNPSの合成には、溶液Aと溶液Aを調製 B.To 溶液の2つの溶液が必要であり、160ミリリットルのミリQ水に2ミリリットルの塩化金水溶液を加えます。溶液Bを調製するには、8ミリリットルの1%クエン酸三ナトリウム二水和物と160マイクロリットルの1%タンニン酸を32ミリリットルのミリQ水に加えます。溶液AとBを摂氏60度に温め、攪拌しながら混合します。約15分後すぐに濃い青色が観察されます。この時点で、溶液の色は赤になります。溶液を摂氏95度に加熱します。摂氏95度に5分間保持し、溶液を室温まで冷却します。1.5ミリリットルのeinorチューブに900マイクロリットルの金MPSを追加し、15、000 Gで30分間遠心分離することにより、コーティングとラベリングのための金片を準備します。上清を捨て、ペレットを900マイクロリットルの滅菌済みMQ水に再懸濁します。.100マイクロリットルのA BSA溶液を加え、800 RPMのボルテックスで30分間混合します。4°Cで60分間、15, 000Gで調製物を遠心分離することにより、余分なBSAを除去する。上清を捨て、金BSA NPSと125マイクロリットルのPBSを再懸濁します。1モルの重炭酸塩を12.5マイクロリットル加えます。R domine n hydroxy CINエステルまたはNHS溶液は、直前にDMSOで調製されます。15マイクロリットルのR DOMINE N-H-S-D-M-S-O溶液で0.5ミリリットルの金BSA NP懸濁液に使用します。反応液を室温で2時間インキュベートし、800 RPMで混合し、光に触れないようにします。次に、精製後36〜48時間の期間で5回のバッファー交換を行い、摂氏4度のPBSに対する透析を通じて金BSAルーミンNPSを精製し、10マイクロリットルのBS-A-P-B-Sを金BSAルーミンNPSの各1ミリリットルに追加してNPSを安定させ、15で遊離または放出されたBSAルーミン遠心分離機を除去します。 000GSを摂氏4度で16分間。Resusは、520ナノメートルまたはOD 5 20で光学密度を測定した後、B-S-A-P-B-Sのミリリットルあたり2ミリグラムでペレットを懸濁します。この実験のための細胞は、永久にリソソーム糖タンパク質ランプ1GFPを発現し、50の密度で細胞を50%二酸化炭素種子を含む雰囲気で摂氏37度で10%胎児の子牛血清とDMEMで培養され、光への曝露を避け、4°Cで金BSAロッドドミンNPSを保管し、50の密度で細胞をシードします。 8ウェルチャンバースライドでウェルあたり000個をインキュベートし、一晩インキュベートします。ヘラ細胞に感染する細菌は、ヒトの胃腸病原体であるサルモネラ菌とタリカ菌です。比較のために、2つの変異株を使用します。これら3つの菌株はすべて、増強GFPの構成的発現のためのプラスミドを保有しており、各菌株のプラスミドを維持するために適切な抗生物質を含むLBブロスで培養されます。3ミリリットルのLBブロスに細菌の単一のコロニーに適切な抗生物質を接種し、摂氏37度で一晩成長させます。翌日の曝気のために振とう条件下で、各培養物を新鮮なLBブロスで1〜31に希釈し、3時間半成長を続けます。この手順を開始するには、継代培養細菌のOD 600を測定し、OD 600を0.2に希釈します。PBSの1ミリリットルで、A 12チャンバースライドのヘラ細胞に適切な量の細菌を添加して、100の感染の多様性を達成します。細胞インキュベーターで30分間インキュベートします。ヘラ細胞をPBSで3回洗浄し、内在化されていない細菌を取り除きます。この時点は、感染後0時間または0時間円周率として設定されます。ゲンタマイシン1ミリリットルあたり100マイクログラムを含む300マイクロリットルの新鮮な培地を細胞に加え、1時間保持します。1時間後。培地を、1ミリリットルあたり10マイクログラムのゲンタマイシンを含むイメージング培地と交換します。.金BSAルーミンNPSをヘラ細胞に添加して、OD 5 20の最終濃度0.1を得ます。1時間後に1時間インキュベートします。メディウムを取り出し、PBSで3回洗います。最後に、10%FCSとゲンタマイシン1ミリリットルあたり10マイクログラムを含む300マイクロリットルの新鮮なイメージング培地を追加します。インキュベーション時間の残りの間、温度制御システムの加湿環境チャンバースイッチを備えた共焦点レーザースキャンやスピニングディスク顕微鏡などの共焦点イメージングシステムを使用して、異なる時点での細胞の高解像度イメージングが達成され、安定するまで待ちます。スキャン倍率、速度分解能、Zステップサイズなどのイメージング設定を最適化します。感染後、指定された時点でGFPおよび金BSAルーミンNPSに適切な励起発光設定を使用してください。感染細胞を封入したA 12チャンバースライドを顕微鏡ステージに装着し、画像を記録することで、細胞内サルモネラ菌によるエンドソーム系のリモデリングや解析を行います。画像解析ソフトウェアを使用します。データを開くには、[開く] をクリックし、surpass ビューのオブジェクト ツールバーでファイルを選択します。アイコンをクリックして、新しいサーフェスアイテムを追加します。関心領域または ROI を分析するには、関心領域のみをセグメント化し、ソースチャネルとして [次へ] をクリックします。チャンネル 3 を選択します。チェックします 滑らか 結果の領域の滑らかさを設定するためのオプション。値を手動で定義するか、自動的に生成された値を受け入れます。しきい値の場合。しきい値調整の絶対強度オプションを選択します。手動オプションを選択し、表示領域に値を設定します。サーフェスしきい値のプレビューは灰色で表示されます。[サーフェスの分類]タブで[次へ]をクリックします。結果として得られるサーフェスは、さまざまな基準でフィルタリングできます。デフォルトのフィルターは V 穴の数が 10 より大きいですが、[追加] をクリックして他のフィルターを含めることもできます。この例では、デフォルトのフィルターを使用してサーフェスの作成を完了します。オブジェクトリストで[完了]をクリックします。アイテムのボリュームのチェックボックスをオフにします。新しく作成されたサーフェスが表示領域に表示されます。赤で表示されている場合は、[保存] をクリックして統計を Excel ファイルにエクスポートします。このプロトコールによって合成された金NPSは、準球形で、サイズは約10ナノメートルでした。BSAコーティングとロードミンラベリングは、それらの形態やサイズに影響を与えませんでした。細胞内サルモネラ菌による宿主細胞エンドソーム系のリモデリングを研究すること。Hela細胞は、野生型サルモネラ菌または2つの変異株に模擬感染または感染し、10ナノメートルの金でパルスチェイスされました。BSAロッドドミンエンドウは非感染細胞で、NPSは後期エンドソームまたはリソソームに均一に分布しています。対照的に、野生型サルモネラ菌に感染した細胞のNPSは、感染後8時間で大部分が再配列されました。サルモネラ菌が誘導するフィラメントまたはふるいの安定化ネットワークが形成され、ほとんどのmpが管状構造内に蓄積していることがわかりました。変異株は、感染後8時間で明確な振る舞いを示しました。SSAV変異株は、VAEまたはSCVを含むサルモネラ菌の内部に閉じ込められていました。ふるい分けは形成されませんでしたが、mpsの大部分は依然としてsifの遊離後期エンドソームまたはリソソームに位置していました。サルモネラ菌の細胞質への突然変異株の脱出が起こり、NPSと細菌との関連は観察されませんでした。サルモネラ菌感染のさまざまな段階で末端リソソーム系のアクセシビリティを調べたところ、結果は、すべての場合において、内在化されたNPSのほとんどがSCVまたはSIFに蓄積したことを示していますこの手順に続いて。他の方法としては、頚部伝染顕微鏡が行うことができる。これにより、一部のナノ感染宿主細胞の超構造や膜コンパートメントなどの追加の疑問に答えることができるかもしれません。このビデオを見れば、蛍光ナノ粒子の調製方法についてよく理解できるはずです。これらは、細胞内サルモネラ菌によって修飾されたホスターコンパートメントを標識するために使用できます。

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Zhang, Y., et al.細胞内細菌によるエンドリソソーム系のリモデリング研究への蛍光ナノ粒子の応用J. Vis.

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