Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法
July 27th, 2018
ここでは、洗剤と recellularization を末梢血および内皮細胞中の灌流による伏在静脈 decellularization のためのプロトコルについて述べる。
この方法では、伏在静脈組織工学の詳細な手順を説明しています。また、簡単な装置を用いた脱細胞化セットアップや再細胞化のためのバイオリアクターの作製も実演します。この技術の主な利点は、再細胞化に簡単な血液サンプルが必要なため、痛みを伴う骨髄採取や時間のかかる細胞培養手順が不要になることです。
Triton-X 100の灌流および洗浄には、脱細胞化セットアップを1台ご用意ください。2リットルのチャンバーに、3つのチューブすべてをテープで固定しますA.1つのチューブを、洗剤の入口のチャンバーの底端が接触する壁にテープで固定します。他の2本のチューブを反対側の壁にテープで固定し、静脈の長さにもよりますが、その間に5〜10センチ
の距離を空けます。これらのチューブの少なくとも5センチメートルもチャンバーの床にテープで固定する必要があります。オスとメスのルアーコネクタを使用して、洗剤のインレットチューブをチューブBに接続します。次に、チューブBをチューブFに接続し、チューブFをチューブCに接続します。
次に、チューブFをペリスタルティックポンプのカセットに入れます。別のチューブCを取り、一方の端を静脈の出口に接続します。もう一方の端を、チャンバーから45センチメートル上に配置された下部ホース出口を備えたガラス瓶に入れ、テープで固定します。
これは洗剤の出口として機能します。次に、チューブGの一方の端をガラス瓶のホース出口に押し込み、もう一方の端を静脈チャンバーに入れます。次に、テキストプロトコルで詳しく説明されているように、TnBP灌流用の脱細胞化セットアップ2を準備します。
また、本文に詳述されているように、DNAの灌流のための脱細胞化セットアップ3を準備し、摂氏37度に配置します。再細胞化バイオリアクターを準備するには、チューブHを4ポートキャップの1つのポートに挿入して、静脈の出口として機能します。2番目のポートに、メディアインレットとして機能するチューブIを挿入します。
そして、3番目のポートに、静脈の入口にチューブJを挿入します。次に、チューブHのもう一方の端を4番目のポートに挿入して、メディア出口として機能します。レデューシングコネクタをチューブHの内側の端に接続し、J.BendチューブJのもう一方の端をU字型に曲げ、縫合糸で結びます。
次に、ベースが平らな60ミリリットルのチューブを250ミリリットルのガラスに入れます。次に、チューブKの一方の端を静脈の入口に接続し、もう一方の端をチューブEに接続します。次に、準備したキャップセットアップをボトル内のチューブに入れます。
最後に、オートクレーブでバイオリアクターを滅菌します。テキストプロトコルに詳述されているように、ヒトの伏在静脈で2回の凍結融解サイクルを行い、その後、ハサミで長さ2mmの生検を切断します。生検をホルムアルデヒドで室温で24〜48時間固定します。
静脈の両端をオスとメスのルアーコネクターのバーブに縫合糸で結びます。静脈を脱細胞化セットアップ1に接続し、チャンバーに1リットルの溶液2を充填します。次に、毎分35ミリリットルで15分間灌流し、セットアップの内容物を空にします。
次に、1リットルの溶液4を加え、毎分35ミリリットルで4時間灌流します。内容物を空にし、500ミリリットルの溶液2を加え、5分間灌流し、再び内容物を空にします。灌流セットアップ1から静脈を切断し、灌流セットアップ2に接続します。
次に、1リットルの溶液5を加え、攪拌機をオンにし、毎分35ミリリットルで4時間灌流します。灌流セットアップ2から静脈を切断し、20ミリリットルの超純水で静脈の外側を2回洗浄します。次に、注射器を使用して、20ミリリットルの超純水で静脈の内部を5〜10分間2回洗います。
テキストプロトコルで説明されているように灌流セットアップ3で灌流した後、静脈を灌流セットアップ1に接続します。1リットルの溶液2を満たし、毎分35ミリリットルで一晩灌流します。核物質を完全に除去するために、灌流プロセスを4回繰り返します。
灌流後、セットアップを空にし、1リットルの溶液2を満たし、毎分35ミリリットルで24時間灌流します。24時間後、セットアップを再び空にし、1リットルの超純水を入れます。毎分35ミリリットルでさらに24時間灌流します。
最後に、同じ条件を使用して、溶液7を使用して灌流を繰り返します。テキストプロトコルに記載されているように脱細胞化を確認した後、50ミリリットルの溶液8を含む50ミリリットルのチューブに静脈を入れて滅菌します。摂氏37度で1時間、シェーカーで毎分80回転で攪拌します。
無菌性を維持するために層流キャビネットで作業し、滅菌鉗子を使用して、500ミリリットルの滅菌溶液7を含む新しい50ミリリットルのチューブに滅菌静脈を移します。前と同じように静脈を12時間攪拌し、その間に少なくとも2回溶液7を交換します。滅菌鉗子を使用して、静脈を新しい50ミリリットルのチューブに移し、50ミリリットルの内皮培地を追加し、11時間撹拌します。
次に、滅菌縫合糸と鉗子で静脈をバイオリアクターの静脈入口と出口に結び付けて静脈を接続し、キャップのセットアップを250ミリリットルのボトルに締めます。バイオリアクターに同じ内皮培地を充填します。ヘパリンを1ミリリットルあたり50単位ずつ添加し、インキュベーター内で毎分2ミリリットルで1時間灌流します。
ドナーから15〜25ミリリットルの新鮮な血液をヘパリンコーティングされたバキュテナーチューブに収集し、スチン溶液で1対1に希釈します。その後、内分泌腺由来の血管内皮増殖因子、塩基性線維芽球増殖因子、および微妙なサリチル酸を追加します。バイオリアクターから内皮培地を空にした後、血液をそれに加え、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターで毎分2ミリリットルで48時間灌流します。
約12時間後、層流キャビネットで作業し、バイオリアクターから一滴の血液を除去し、血糖モニタリング装置を使用してグルコースを測定します。レベルが1リットルあたり3ミリモル未満の場合は、ブドウ糖を追加して1リットルあたり7〜9ミリモルの範囲に収めます。インキュベーターに48時間戻った後、層流キャビネット内のバイオリアクターから血液を排出します。
30ミリリットルの滅菌溶液7を加え、5分間灌流し、溶液を排出する。血の赤い色が失われるまで、このプロセスを繰り返します。最後に、30〜45ミリリットルの内皮培地を加え、インキュベーター内で毎分2ミリリットルで96時間灌流します。
再細胞化した静脈を層流キャビネット内のバイオリアクターから切り離し、ハサミを使用して静脈の5ミリメートルの端を切り取り、廃棄します。以前と同様に生検を行い、ホルムアルデヒドに入れ、テキストプロトコルに記載されているように再細胞化の検証を行います。正常な静脈の全体的な形態は、色が真っ赤に見えます。
赤色は進行性の脱細胞化サイクルで失われ、5サイクルの治療後、淡い白に見えます。末梢血と内皮培地の灌流によって再細胞化された静脈は、再び鮮やかな赤色に見えました。ここに示されているのは、多数の青色核の存在を示す正常静脈の代表的なヘモトキシリンおよびエオシン染色画像です。
しかし、脱細胞化した静脈のヘモトキシリンおよびエオシン染色では青色の核は見られませんでした。血液と内皮培地で灌流した再細胞化静脈では、ヘモトキシリンとエオシンの染色で内腔に細胞付着の存在が示されました。この動画を見れば、界面洗剤による伏在静脈の脱細胞化や、末梢血や内皮培地による再細胞化の方法がよく理解できるはずです。
Triton-X 100、TnBP、およびDNAの圧力下での灌流を用いたこの脱細胞化技術は、ヒト伏在静脈からの核の除去に成功し、再現性がありました。この技術は完了するまでに20日かかりますが、脱細胞化した静脈をアフターシェルフ製品として保存すると、手順にかかる時間が8日に短縮されます。レシピエントの末梢血を用いた静脈の再細胞化は、臨床的に関連性があると考えられる。
同様のプロトコルで再細胞化された静脈は、手術後に機能的な血液供給を提供することにより、臨床移植に有望であることを示しました。わずかな変更を加えるだけで、このプロトコルはあらゆる静脈タイプに使用でき、すべての血管手術のクリニックでパーソナライズされたグラフトとして使用できます。
概要
この記事では、洗剤を用いた大腿静脈の脱細胞化の詳細なプロトコルと、末梢血および内皮培地の灌流によるその後の再細胞化について説明します。この方法は単純な血液サンプルを使用することでプロセスを簡素化し、より侵襲的な手順を避けています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 組織工学
- 再生医療
- 血管生物学
背景
- 脱細胞化は組織工学における足場の作成に不可欠です。
- 従来の方法では複雑な細胞培養技術が必要になることがよくあります。
- 再細胞化に血液サンプルを使用すると、患者の不快感を減らすことができます。
- 内皮培地は血管組織の再生に重要な役割を果たします。
研究の目的
- 大腿静脈の脱細胞化のための簡単なプロトコルを確立すること。
- 容易に入手可能な血液サンプルを使用した再細胞化を促進すること。
- 組織工学技術の効率を向上させること。
使用した方法
- トリトン-X 100およびその他の溶液を使用した脱細胞化セットアップの準備。
- 再細胞化プロセスにバイオリアクターの使用。
- 徹底的な脱細胞化とその後の細胞播種を確実にするための灌流技術。
- 再細胞化された組織の実行可能性を評価するためのグルコースレベルのモニタリング。
主要な結果
- このプロトコルは大腿静脈の脱細胞化を成功裏に達成しました。
- 血液および内皮培地による再細胞化が達成されました。
- グルコースモニタリングは再細胞化された組織の代謝活性を示しました。
- この方法は従来の技術と比較して効率的で侵襲性が低いことが証明されました。
結論
- このプロトコルは血管組織工学の有効な代替案を提供します。
- 血液サンプルの使用は再細胞化プロセスを簡素化します。
- この方法は再生医療に潜在的な応用があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Decellularization and recellularization of human saphenous veins enable the generation of patient-specific vascular grafts, reducing reliance on allogeneic or synthetic conduits that carry risks of immunosuppression and poor patency. This approach supports predictive confidence in graft functionality by using autologous peripheral blood, thereby de-risking translational pathways in vascular tissue engineering. The method provides a scalable platform for preclinical evaluation of personalized grafts, aligning with enterprise goals of risk-adjusted advancement in regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular graft biocompatibility and thrombogenicity using autologous blood-derived cells.
- Operational Value: Reduces need for invasive cell sourcing, simplifying hypothesis testing in vascular regeneration models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, decellularized scaffolds with quantifiable extracellular matrix retention for consistent seeding efficiency.
- Operational Value: Supports reproducible perfusion-based recellularization assays using simple blood samples, enabling high-throughput viability screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates luminal endothelialization and metabolic activity via glucose monitoring, supporting functional graft assessment.
- Operational Value: Facilitates preconditioning and maturation in bioreactors, improving readiness for implantation studies.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted prioritization of graft candidates through measurable recellularization outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a reusable platform for vascular graft development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-scaffold interactions and extracellular matrix integrity using decellularized human veins.
- Screening: Enables standardized recellularization assays with perfusion-defined shear stress and nutrient delivery for reproducible endothelial coverage.
- Analytics: Glucose monitoring and histological staining provide quantitative readouts for metabolic activity and cellular attachment, enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects discovery-phase scaffold optimization to preclinical validation through autologous cell seeding and functional maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for generating patient-specific vascular grafts across multiple vein types, reducing dependency on custom cell culture.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in graft functionality by demonstrating endothelialization and metabolic activity in recellularized veins.
- Operational Value: Standardizes decellularization and perfusion workflows, improving reproducibility across runs and laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage development by enabling autologous graft testing prior to clinical use.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantifiable recellularization metrics and graft patency indicators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, perfusion systems, and sterile cell handling.
- Dependent on bioreactor infrastructure, peristaltic pumps, and controlled incubation environments.
- Necessitates standardization of perfusion parameters, solution formulations, and glucose monitoring protocols.
- Adaptation to other vein types may require optimization of decellularization cycles and recellularization conditions.
- Practical limitations include the 20-day timeline for full processing and the need for aseptic maintenance throughout.
