Name: Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学ぶ大伏在静脈の脱細胞化と再細胞化プロトコル。Triton-X 100などの洗浄剤を用いた灌流法とバイオリアクターを使い、末梢血と内皮培地で再細胞化する組織工学の革新的手法です。

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我々 は、実験で使用される血管を提供するヘルプについては教授アンダース Jeppsson を感謝したいです。本研究は、融資 SSH に LUA アルフ付与によって。

組織を使用し、本稿のプロトコル ヨーテボリ大学の倫理ガイドラインに従います。
1. ティッシュの準備・
<ol><li>手術用鉗子、はさみを使用して取得した大伏在静脈から周囲の組織をカットします。 注: 大伏在静脈は、血管外科医による人間の下肢から解剖しました。このペーパーで使用される大伏在静脈は、バイパス手術後の未利用部分です。</li>
	<li>血流中に漏れを防止するには、縫合鉗子と彼らの両端にすべての側枝を縛る。</li>
	<li>リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) の 40 mL を含む 50 mL のチューブに静脈をしてください。余分な血液を削除する PBS 2 - 3 回を変更することにより、静脈を洗います。-80 ° C で凍結による静脈を格納します。</li>
</ol>2. Decellularization のセットアップと Recellularization バイオリアクターの準備
注: は、はさみを使用して、表 1に示すように、シリコン チューブをカットします。
<ol><li>
Decellularization セットアップ 1 (トリトン X-100 灌流、洗浄)
	<ol>
<li>2 L にチャンバー (プラスチック製の浴槽)、管 A図 1 aに示すように、すべての 3 つの小品をテープします。 注: テープの端が商工会議所 (洗剤の入口) の底に触れる 1 つの壁に 1 つの管と静脈の長さに応じて間に 5-10 cm の距離で反対側の壁には、他の 2 つの管。これらのチューブの少なくとも 5 cm は、商工会議所の床 (静脈の入口と出口) にも録音必要があります。</li>
		<li>洗剤の流入管に管 B 管 F 管 C 続くシリーズの接続男女別ルアー コネクタを使用して、最終的に静脈入口に。場所 F、蠕動のカセットに挿入するチューブ ポンプ私です。</li>
		<li>別チューブ C に乗り、静脈の出口に 1 つの端を接続します。商工会議所 (洗剤アウトレット) 直上の 45 cm は下ホース コンセント付きのガラス瓶にもう一方の端を置き、それを確保するためのテープします。チューブ G に乗り、ガラス瓶のホース コンセントに一方の端をプッシュし、静脈チャンバーにもう一方の端を配置します。 注: セットアップを完了 (赤矢印)、商工会議所、及び流れ方向 (白い矢印) の写真は、図 1 aのとおりです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization セットアップ 2 (TnBP の灌流)
	<ol>
<li>1 L のガラス瓶を持ってし、管瓶の底に触れるまで、瓶にチューブ C (洗剤入口) の一方の端を配置します。</li>
		<li>管 F の半分の深さ (静脈の入口) まで瓶に C. 場所管 C のもう一方の端をチューブで後にもう一方の端を接続します。蠕動ポンプのカセットに F 管を置く私。</li>
		<li>管 D を取るし、静脈の入口 (洗剤コンセント) から 45 cm の高さで置かれた下ホースで半分の深さとガラス瓶の中にもう一方の端まで瓶 (静脈の出口) に 1 つの端に置きます。確保するために洗剤の入口と出口の管をテープします。</li>
		<li>磁性攪拌器に 1 リットルのガラス瓶を置き、磁石が我慢してボトル。</li>
		<li>チューブ G に乗り、ガラスの瓶のホース口に片方の端をプッシュし、1 L のガラス瓶にもう一方の端を配置します。 注: 画像の完全なセットアップ (赤矢印)、商工会議所および流れの方向 (白い矢印) は図 1 bに示すように。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization セットアップ 3 (DNase の灌流)
	<ol>
<li>250 mL の瓶を取るし、蠕動性ポンプ II のカセット チューブ C のイス チューブの中間領域の両端に配置。 注: チューブの一方の端は液入口、静脈の流入する管のもう一方の端を接続します。静脈の出口はソリューションで無料になっています。</li>
		<li>37 ° C でポンプを含む全体のセットアップを場所します。セットアップを完了し、流れ方向の写真を図 1に示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recellularization バイオリアクター
	<ol>
<li>準備ができた保つすべての部品図 2 aに示すように。</li>
		<li>図 2 bに示すように 4 ポート キャップを取ると各ポートに挿入、H (静脈の出口) をチューブ、チューブの私 (メディア入口)、J (静脈の入口) をチューブします。4番目のポート (マスコミ) 管 H のもう一方の端に挿入します。 メモ: 4 ポート キャップの上からのビューは、図 2に示されています。簡単にハサミで鋭いポイントに端をカット、チューブの挿入。</li>
		<li>U 形に J ・ チューブのもう一方の端を曲げ、縫合糸でそれを縛る。H & j. チューブの内側の両端に削減コネクタを接続します。</li>
		<li>250 mL ガラス瓶の中にフラット ベース 60 mL チューブを置き、図 2 Dに示すように管に上記したセットアップを配置します。図 2 eのように、K、E、および K の管シリーズに接続します。静脈の入口に 1 つ管 K と別の管 K メディア入口に接続します。 注: セットアップ、及び流れ方向の回路図は、図 2 階に見られます。</li>
		<li>バイオリアクターをオートクレーブで滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 溶液の調製
<ol><li>解決策 1 (10 x 水): 1 L の純水には 2 g のアジ化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 18.6 g を追加。塩が溶けるまでかき混ぜます。</li>
	<li>解決策 2 (1 x 水): 100 mL の溶液 1 を取るし、純水の 900 mL を追加。</li>
	<li>解決策 3 (トリトン X-100 x 5): 純水 950 mL に EDTA の 9.3 g、1 g、アジ化ナトリウムのトリトン X-100 の 50 mL を追加。溶解するまで攪拌します。</li>
	<li>ソリューション 4 (トリトン X-100 x 1): 200 mL の溶液 3 を取るし、純水の 800 mL を追加。</li>
	<li>解決方法 5 (1 x TnBP): 990 溶液 2 mL を 10 mL のピペットと TnBP の 10 mL を追加。</li>
	<li>解決策 6 (40 Kunitz 単位/ml DNase): ダルベッコ リン酸バッファー食塩 CaCl2と MgCl2を含む 50 ml DNaseI の追加 2,000 Kunitz ユニット。新鮮な準備し、すぐに使用します。</li>
	<li>解決策 7 (PBS): は、純水の 3 L にリン酸カリウムの 0.72 g、リン酸ナトリウムの 4.32 g 0.6 g の塩化カリウムの塩化ナトリウム 24 g を追加します。溶解するまで攪拌します。7.4 に pH を調整します。滅菌オートクレーブで PBS の 1 L とは別々 に保管します。</li>
	<li>ソリューション (0.1% 過酢酸) 8: 7 の無菌溶液の 50 mL に酢酸の 50 μ L を追加。新鮮な準備し、すぐに使用します。</li>
</ol>4. 内皮媒体の作製
<ol><li>L-グルタミンの 5 mL の 5 mL 対策、AB 血清の 50 mL と 500 mL 無菌フードの下で MCDB131 中に牛胎児血清を除く EGM 2 成長因子キットのすべてのコンポーネントを追加します。</li>
</ol>5. 伏在静脈の decellularization
<ol><li>室温で-80 ° C からひと伏在静脈を解凍します。-80 ° C で再度凍結し、再び室温で解凍。</li>
	<li>はさみを使用して 2 mm の生検をカットし、室温で 24-48 h のホルムアルデヒドで修正します。縫合糸と男性と女性のルアーロック コネクタの棘に静脈の両端を結ぶ。</li>
	<li>Decellularization セットアップ 1 に静脈を接続し、解決策 2 の 1 L を入力します。35 mL/分で 15 分空のセットアップの内容のために灌流します。</li>
	<li>解決策 4 の 1 L を追加し、セットアップの内容を空に 4 h 35 mL/分での灌流します。</li>
	<li>500 mL の溶液 2 を追加し、5 分設定の内容を空の灌流します。この手順を繰り返します。灌流セットアップ 1 から静脈を切断し、灌流セットアップ 2 に接続します。</li>
	<li>解決策 5 の 1 L を加えてかくはんオン 35 mL/分で 4 時間灌流します。 注: 解決方法 5 は回転かくはんおよび灌流全体で後曇りに見えます。</li>
	<li>灌流セットアップ 2 から静脈を切断し、5-10 分の超純水の 4 変化で静脈の外側と内側のシリンジに 10 mL のピペットを洗います。</li>
	<li>灌流セットアップ 3 静脈に接続ソリューション 6 の 50 mL を追加して、4 h、セットアップの内容を空にして、セットアップから静脈を切断の 37 ° C 室 10 mL/分で灌流します。</li>
	<li>接続静脈灌流セットアップ 1、解決方法 2 の 1 L を記入の 35 mL/分ステップ 5.9 4 回 (合計 5 サイクル) を繰り返しステップ 5.4 で一晩を灌流しました。手順 5.2 で示されたとして再度生検を取る。 注: スキップのステップ 1 と 3 のサイクルで 5.8 の 2 番目の部分。</li>
	<li>セットアップの内容を空にします。解決方法 2 の 1 L を記入し、灌流 35 mL/分変更ソリューションで 24 h の 12 h. 後 2 空のセットアップの内容。超純水水 1 リットルを記入し、12 h.Empty 後、セットアップの内容変更超純水水 35 mL/分で 24 時間灌流します。解決策 7 の 1 L を記入し、7 後 12 h 35 mL/分変更ソリューションで 24 時間灌流します。</li>
</ol>6. Decellularization の検証
<ol><li>ホルマリン固定ティッシュ プロセッサ標準プロトコルを次の 15 分プロセスの純水で生検を洗浄し、パラフィン22に埋め込みます。</li>
	<li>ミクロトームを使用して 5 つの μ m のセクションをカットし、マイヤーのヘマトキシリンと 0.2% アルコール エオシン (H & E) 染色標準プロトコル22。</li>
	<li>正常組織と比較して脱組織における核の損失を確認する顕微鏡の下でを表示します。</li>
</ol>7. recellularization
<ol><li>50 mL の溶液 8 を含む 50 mL のチューブに置くことで静脈を滅菌します。37 ° C で 1 h のシェーカーで 80 回転/分 (rpm) で扇動します。</li>
	<li>層流 (LAF) 無菌性を維持にキャビネットの下静脈を処理します。対策の滅菌溶液 7 と 500 μ L の 50 mL を含む新しい 50 mL チューブ滅菌用のピンセットを使用して静脈を転送します。12 h. 変更ソリューション 7 間に少なくとも 2 回の上記のように揺り動かします。</li>
	<li>滅菌鉗子を使用して、新しい 50 mL のチューブに静脈を転送し、内皮メディアの 50 mL を追加します。11 h については、上記を揺り動かしなさい。</li>
	<li>キャビネットの LAF の下で滅菌手袋を使用してバイオリアクターを組み立てます。バイオリアクターの静脈入口と滅菌縫合鉗子と出口に静脈を結ぶ。</li>
	<li>バイオリアクターと同じ培地で塗りつぶし、静脈に接続します。50 IU/mL にヘパリンを追加し、37 ° C で 2 mL/分で 1 時間灌流</li>
	<li>ヘパリン コーティング バキュテナー チューブでドナーから 15 25 mL (静脈の長さ) に応じて新鮮な血液を収集し、スティーン ソリューションと 1:1 の希釈します。その後、内分泌腺由来血管内皮増殖因子 (VEGF EG、80 ng/mL)、塩基性繊維芽細胞成長因子 (B-FGF、4 μ L/mL) とアセチル ・ サリチル酸 (5 μ G/ml) を追加します。</li>
	<li>バイオリアクターを 5% CO2と 37 ° C の定温器に移動し、2 mL/分で 48 時間灌流します。</li>
	<li>約 12 時間後、バイオリアクターに移動キャビネット、LAF 血のドロップを取るし、血糖監視装置を用いたグルコースを測定します。レベルが 3 以内のモル/L の場合追加をもたらすブドウ糖 7 9 ミリ モル/L の繰り返しの範囲でこのステップごとの 8-12 h。</li>
	<li>48 時間後キャビネットの LAF にバイオリアクターを移動し、バイオリアクターから血液を排出します。滅菌溶液 7 30 mL を加えて 5 分排水ソリューションを灌流します。30 mL の滅菌溶液 7 を追加し、2 回以上血の赤い色がなくなるまで 5 分繰り返し灌流します。 注: 生検は細胞接着の確認のため撮影できます。静脈を外し、静脈の 5 mm 端をハサミで切って捨てます。5.2 の手順で述べたように、生検を取る、バイオリアクター (オプションの手順) 静脈を再び接続します。</li>
	<li>内皮細胞培地の 30-45 mL を追加し、2 mL/分でインキュベーターで 96 時間灌流します。 注: は、静脈が水没するまでに内皮細胞培地を追加します。</li>
	<li>LAF のキャビネットに、バイオリアクターを移動、recellularized の静脈を切断、はさみを使用して静脈の 5 mm の縁を切って、破棄します。5.2 の手順で述べたように、生検を取る。</li>
</ol>8. Recellularization の検証
<ol><li>セクション 6 の指示に従い、H & E 染色を行います。細胞の存在を顕微鏡でスライドを確認します。</li>
</ol>

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伏在静脈の decellularization はここで説明したテクニックは、臍と乳腺静脈のようなすべての小径静脈にも適用することができます簡単に、シンプルでコスト効果の高い方法です。Decellularization ソリューションとその濃度をこのメソッドで使用されている私たちの以前の結果の6,7からです。にもかかわらず、decellularization の 5 サイクルをお勧めします、特定の静脈でまた気づいた 3 サイクルで完全な decellularization。ただし、再現性のある結果が得られた 5 サイクルを使用しました。このプロトコルを適用すると、我々 はさまざまな長さの静脈を脱 30 cm まで正常に (結果未発表)。45 cm decellularization ソリューションのコンセントを持ち上げると、静脈内 33 mmHg の圧力が作成されます。我々 の経験では、全体の静脈を均一に decellularizing と再現性をもって 5 サイクルの重要なステップとしてこれを気づいた。選ばれた圧力は通常の伏在静脈圧 (5-10 mmHg) の 3 倍以上ですが無能と同じ静脈 (静脈瘤)23です。さらに、この高圧が静脈壁に大きな力を作成し、効率的かつ迅速な細胞の除去に役立つ可能性があります、したがって、我々 は推測します。
TnBP は有機溶剤と水に不溶なので洗剤を曇りになるまで攪拌は重要です。それ以外の場合、洗剤はフロートされます。同じ理由から、ソリューションでは、混合 TnBP を保つために、洗剤の排水チューブは、ホース コンセント付きのガラス瓶の上部に置かれました。TnBP の効率的な除去洗浄水 TnBP 液滴をフローティングの有無によってすべてのサイクルでの使用を見ることができる後の静脈。また、decellularized 組織をまた作り出した DNase ステップをスキップが、decellularized の組織の比較的高い DNA 量の気づいたいくつかの場合、気づいています。高流量・高圧する効率的な DNase 活動の必要がないため低灌流率 (10 mL/分) を使用する場合があります。異なる蠕動性ポンプは、その小さいサイズのセットアップの簡単な処理に役立つように使用されました。我々 はサイクル 2 で decellularization 結果の間にほとんどの細胞の損傷を気づいた、1 と 3 (未発表結果) サイクル中に DNase 処理をスキップしておすすめ。生体力学特性の保存特性解析と細胞外マトリックス蛋白質の定量化が本稿では実行されていないにもかかわらず類似した decellularization プロトコルと私たちの前の経験を示した細胞外マトリックスの構造と蛋白質の7。これらの静脈で予備の定量化実験生産 (未発表) 同様の結果が既に出版された結果はこの自信を強化します。
セル拡張時間が長く、拡張セル、外科的侵襲と不快感で患者の自発の突然変異を回避できると血を使用して recellularization、拡大した骨髄細胞の便利で簡単なプロセスです。Epc を循環からの内皮化も発生、血液内皮細胞培地による血液灌流が続くとその灌流を行ったことが知られているので recellularization の十分であります。このような 2 つの静脈は肝外門脈閉塞7児に移植されたとき、移植の成功の結果から静脈の組織同様のメソッドを使用して設計の安全性を見る。脱細胞外マトリックスにおける成長因子が血液24から Epc を循環の添付ファイルを許可することが推測された.次のようなプロトコルの静脈の recellularization は、VEGF 受容体 2 と分化 (CD) 14 CD45 表現する細胞膜7みながらルーメン上のクラスターの肯定的な細胞を示した。我々 はまた、連続した内皮層観測されないことがすべての場合に特にそのような個人が循環前駆細胞の25の数を減少していることが知られている、古いや病気の患者からの血液を使用する場合を想像します。受信者自身とその血流を仮定するただし、血液が抗原 decellularization のため公開されて、移植だけではなく移植時の炎症性副作用の可能性を減らす可能性がありますの多くをマスク脱血管。さらに、血液灌流は、内腔と順番循環前駆細胞の生体内でrecellularization の急速なプロセスの結果の増加を募集する外膜における増殖因子の増加されたレベルを沈殿できます。
本研究で用いたバイオリアクター デザインの利点は、完全なオートクレーブ、組み立て簡単、費用対効果、取り扱いが容易、損傷の少なくとも可能性です。私たちの経験では長さ 10 cm にアップされた recellularized の静脈、現在設計を使用します。にもかかわらず静脈の最大長さ 25 cm は、バイオリアクター内の"U"形で静脈を保つことによっても recellularized することができます、これは検証する必要があります。バイオリアクター デザインは、静脈の流れの方向は重力に対して人間のこれらの静脈の流れの法線方向であるように設計されていますを示しています。内皮の中のステップの 12 h 灌流は、静脈前提、裏付けし着信 Epc の添付ファイルに対する親和性を高めます。余分なヘパリンおよび灌流 1 時間の加算は血流中にチューブに血栓の形成のリスクを下げます。
必要な血液量は静脈の長さに依存します。私たちは血液量に従う基本的な原則は、静脈が血液に浸漬されることです。45 mL を超える血液ボリュームを処理しながら、時折混合は汚泥の底で細胞蓄積を防ぐ必要があります。我々 は、大量のタンパク質と臓器移植26,27の間に組織の健康を維持するために必要なコンポーネントが含まれているために血液がスティーンのソリューションを追加しました。彼らは強力な血管新生増殖因子28彼らの存在は、Epc29,30,31,32 の分化・増殖、移行を誘導する VEGF および B-FGF の追加は有益です.VEGF の追加量は、Epc の増殖が 80 ng/mL でみた以前未発表の研究結果に基づいています。アスピリンの血小板33内皮層への愛着のチャンスを減らすの活性化を阻害します。継続的な監視とグルコース添加の細胞増殖と赤血球の溶血反応を防止するために有益もなります。
簡単な採血のみが受信者から必要である場合は、以下の技術的な専門知識を必要とする簡単な実行可能なプロシージャとして考えることが。にもかかわらず、開始から終了するここで示されている全体の手順は、20 日間かかります、保存として decellularized の静脈、棚から製品は患者のために 8 日に手順を短縮します。脱静脈のストレージは技術的に recellularization 効率を影響はありませんがそれを評価する必要があります。組織設計の静脈を生成この手順用閉塞静脈、静脈不全免疫抑制を必要とせず下肢静脈瘤につながるとのより良い品質提供を交換、バイパス手術クリニック患者のための生活。

血管の管は脳動脈瘤、頚動脈狭窄症と血管の深刻な問題につながる動脈硬化のようないくつかの臨床条件に必要です。外科医は、機能的な血液供給を復元するのに自家、同種または合成の血管の管を使用します。自家血管の使用はまだ理想的なアプローチと考え、患者の可用性 majorly 制限されています。同種または合成移植などの選択肢には、免疫抑制治療と再手術1、2国に経済的負担など主要な健康の結果につながる貧しい存深遠な問題があります。血管の組織工学は自然の相同性と自家細胞移植を目指します。したがって、受信者の免疫システムは、自己として移植された臓器を認識し、それが現在の代替案と比較してより良い機能可能性がありますこのような移植では、天然タンパク質および元の構成細胞を含まれている、ので。組織は、3膀胱、尿道4気管5、および静脈6,7を正常にクリニックで使用されているように臓器を設計されています。
ティッシュのパーソナライズされた移植片を生産する技術と、続いて decellularization と recellularization ドナーから移植が必要です。Decellularization は、組織や臓器の8,9,10からセルを削除する有望な技術です。特定の物理的、化学的及び酵素法11それらを組み合わせることで、decellularization を実行できます。これらのメソッドの最適な使用率脱組織はネイティブの組織に似た細胞外マトリックスで同じような構造と機能蛋白質を持つことができます。このような臓器は、着信の幹細胞の分化、増殖、移行添付ファイルを強化する固有能力を有しています。
Recellularization は、移植に細胞を播種の動的過程と臨床移植の受信者の幹細胞を使用ことができます。骨髄間葉系幹細胞のような目的のため現在使用など臓器住民3,5,6があります。動物学の研究指向は、胎児人工多能性12,13,14は、間葉系の起源からの幹細胞を使用しています。このプロセスは、バイオリアクター (静脈を保持し、温度、ガス、pH、圧力などの必要な条件を提供しています部屋) 細胞及び培地。Recellularization の課題は、特定の種類と播種戦略全体の組織や器官に達することができる細胞での細胞の必要な番号を取得することです。にもかかわらず、ない完全な組織や器官構造的、機能的は、生成、今まで評価がされて、フィールドおよび最初の結果のいくつかの進歩は今後の可能性15を表示します。静脈の重要な機能は、組織とくびれに役立ちます、また血圧16を保持する強度を提供中の平滑筋層に炎症性細胞の浸潤を制御する内腔内皮にあります。研究では、血管内皮形成吻合または循環血管内皮前駆細胞 (Epc) 血17,18,19からダメージ、中にリダイレクトが発生することを示しています。静脈の recellularization のための戦略は、Epc の循環血液中に存在に依存します。
静脈と動脈のティッシュ エンジニア リングは、異なる decellularization と recellularization 戦略20,21に続くいくつかのグループによって行われました。当社グループも実行し、腸骨と乳腺静脈6、7の decellularization と recellularization の戦略を開発しました。Decellularization は、トリトン X-100、トリ-n-ブチル (TnBP)、リン酸塩と酵素のデオキシリボヌクレアーゼ (DNase) で静脈の動揺によって行われました。骨髄由来内皮細胞や平滑筋細胞6または末梢血7を使用して、recellularization を行った。静脈は肝外門脈閉塞6,7で小児患者の移植で機能の血液供給を提供する臨床約束を示したいずれかのプロトコルによって recellularized。
現在、小径静脈の decellularization、recellularization、汚泥処理の向上かつ容易に性能の同じプロトコルの修正バージョンを開発しました。現在の decellularization プロトコルには、洗剤洗剤撹拌ではなく圧力を使用して静脈の血流が必要な。Recellularization プロトコルには、前処理細胞接着と増殖、生存細胞接着を改善するため血中における成長因子の添加を改善するための追加の手順が含まれます。市販の製品を用いたバイオリアクターのデザインを改善を実現しました。Decellularization とひと伏在静脈の recellularization を実行するための修正されたプロトコルの詳細な説明を提案します。

<table><tbody><tr><td>4ポートキャップ</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>アセチルサリチル酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>アンチアンチ</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>ロンザ</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>血糖モニタリングシステム-フリースタイルライト</td><td>アボット</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマAldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 および MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩二水和物</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161</td><td></td>OB</tr><tr><td>EGM-2成長因子キット</td><td>ロンザ</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>ガラス瓶250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>GL45キャップ付きの任意のボトルを使用できます</td></tr><tr><td>ガラス瓶1L</td><td>VWR</td><td>の2151595</td><td>GL45キャップ付きの任意のボトルを使用できます</td></tr><tr><td>ガラス瓶500ml 底部ホース出口付き</td><td>キンブルチェイスライフサイエンス</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>レオ</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンコーティングバキュテナーチューブベ</td><td>クトンディキンソン</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>ヒトAB血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ25030-024</td><td></td></tr>ル<tr><td>アーメス、1/8インチIDバーブ</td><td>オイナ</td><td>LF-2PP-QC3X5mm</td><td>シリコンチューブル</td></tr><tr><td>アー用内径3/32インチの女性 バーブ</td>・<td>オイナ</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>2X4mmシリコンチューブ用</td></tr><tr><td>内径3/32インチのルアーオス バーブ</td><td>・オイナ</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>2X4mmシリコンチューブ用</td></tr><tr><td>内径1/8インチのルアーオス バーブ</td><td>・オイナ</td><td>LM-2PP-QC</td><td>3X5mmシリコンチューブ用</td></tr><tr><td>ルアーオス 内径5/32インチのバーブ</td><td>・コール・パーマー</td><td>EW-45518-06</td><td>5X8mmシリコンチューブ用</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>ライフ技術</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>酢酸あたり</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ I</td><td>マスターフレックス</td><td>7524-45</td><td>脱細胞化セットアップ 1 および 2.使用されるカセットは7519-75</td></tr><tr><td>蠕動ポンプII</td><td>イスマテック</td><td>ISM941Decellularization</td><td>セットアップ3およびRecellularizationのバイオリアクターのためである。</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>レデューシング コネクタ 1.5mmX2.5mm</td><td>バイオテック</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&nbsp; 制御</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>水素ナトリウム</td>メル<td>ク</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>スティーン溶液</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr>縫<tr><td>合</td><td>糸Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr>トリ<tr><td>-n-ブチルリン酸</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046。OF</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 60ml フラットベース付き</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>チューブ A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>脱細胞化灌流ステップ1および2のために長さ25cmのそれぞれ3個をカット</td></tr><tr><td>チューブB</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>脱細胞化灌流ステップアップのために長さ35cmの1個をカット</td></tr><tr><td>チューブC</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>脱細胞化灌流のために長さ75cmの5個をカットチューブ D</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>脱細胞化灌流のために長さ90cmの1個をカット 2</td></tr><tr><td>チューブE</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>再細胞化灌流のために長さ20cmの1個をカット</td></tr><tr><td>チューブF</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>脱細胞化灌流ステップ1と2のために長さ15cmのそれぞれを2個カット</td></tr><tr><td>チューブG</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>脱細胞化灌流ステップ1と2のために長さ60cmのそれぞれを2個カット</td></tr><tr><td>チューブH</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>長さ15cmのものを1個カットして再細胞化灌流ステップ</td></tr>アップ <tr><td>チューブI</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>長さ20cmの1個をカットして再細胞化灌流ステップアップ</td></tr><tr><td>チューブJ</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>長さ25cmの1個をカット 再細胞化灌流ステップアップ</td></tr><tr><td>チューブK</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>長さ35cm×2個ずつ切開し、再細胞化灌流ステップアップ</td></tr></tbody></table>

decellularization とひと伏在静脈の recellularization 方法

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

ほとんど血管手術中に使用される血管の導管は、しばしば免疫抑制と貧しい開存性によって引き起こされる合併症につながる同種または合成の移植です。ティッシュ ・ エンジニア リングでは、decellularization と recellularization のメソッドを使用して受信者の範囲を含む自然な細胞外マトリックスとパーソナライズされた移植片を生成するための新しいソリューションを提供しています。末梢血の血流によってひと伏在静脈と recellularization の decellularization を実行するための詳細な方法を紹介します。静脈灌 1% 脱だったトリトン X-100, 1% トライ-n-ブチル-リン酸 (TnBP), デオキシリボヌクレアーゼ (DNase) の 2,000 の Kunitz 単位。トリトン X-100 と TnBP はいた DNase は 4 h の 37 ° C で 10 mL/分で灌流中 35 mL/分 4 時間で灌流。静脈は、純水と PBS で洗浄され、0.1% 過酢酸で殺菌し。再び PBS で洗浄され、内皮細胞培地で前処理します。静脈はバイオリアクターに接続、潅流 50 IU/mL を添加した内皮細胞培地で新鮮な血液とバイオリアクター、スティーン溶液希釈 1:1 を充填して内分泌腺由来を追加 1 h. Recellularization のヘパリンを行った血管血管内皮成長因子 (80 ng/mL)、塩基性繊維芽細胞成長因子 (4 μ L/mL)、アセチル ・ サリチル酸 (5 μ g/mL)。汚泥はインキュベーターに移動し、2 mL/分で 48 時間 3-9 ミリ モル/l. 間の血糖値を維持しながら灌流後、PBS で洗浄、内皮細胞培地でいっぱいインキュベーターで 96 時間潅流する静脈がだったと。トリトン X-100, TnBP DNase と治療は、大伏在静脈を 5 サイクルで脱。Decellularized 静脈は通常と recellularized の静脈 (明るい赤) と対照をなして白く見えた。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色脱静脈ではなく通常でのみ、核の存在を示した。Recellularized の静脈では、H & E 染色は静脈の内腔の細胞の存在を示した。

通常静脈の総形態は光赤 (図 3 a)。進歩的な decellularization サイクルで赤い色が失われる (2、図 3Bのサイクル; 3、サイクル図 3)、5番目のサイクルでそれは薄く、白 (図 3 D) に見えます。血液灌流 (図 3E) と内皮細胞灌流 (図 3 f) recellularized 静脈色の明るい赤に見えます。Decellularization 治療の 5 サイクルは、H &amp; E 染色 (図 4 b) で青い核が見られなかったと、静脈からセルを削除されました。対照的に、いくつかの核は、通常の静脈 (図 4 a) に見られました。内腔側に取り付けられている細胞の存在は、H &amp; E 染色 recellularized 静脈血 48 h (図 4、黒矢印) と 96 時間 (図 3 D、黒矢印) 内皮細胞培地による血液灌流後に見られます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> 図 1: Decellularization の灌流セットアップの組立します。A)トリトン X-100 の組み立てられた decellularization 設定 1 を表示中の写真を洗浄します。白い矢印表示ソリューションの流路と赤矢印入り江とコンセントの静脈とソリューションを示しています。B) TnBP 潅流の組み立てられた decellularization 設定 2 の図。同様に、decellularization セットアップ 1 のようにソリューションの流路を示す白い矢印と赤い矢印を示す入口および出口静脈および解決のため。C)デオキシリボヌクレアーゼ灌流の組み立てられた decellularization 設定 3 を示す画像。白い矢印表示ソリューションの流路を示し、静脈およびソリューションの入り江が赤い矢印を表す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> 図 2:準備と recellularization のバイオリアクターの組立します。A)バイオリアクターを組み立てるために必要な表示材料の画像します。B)静脈入口と出口 (白い矢印) と管 H、I および j. の配置に接続するコネクタ (赤矢印) を減らすことの配置 4 ポート キャップの内側の写真ポイントH 管の自由な端は、メディアを戻すバイオリアクターに配置されます。C)出入りそれぞれチューブを 4 ポート キャップの上部から見ることができます。D)組み立てのバイオリアクターを示す画像。E)蠕動性ポンプと全体バイオリアクター セットアップを示す画像。K チューブは、バイオリアクターから蠕動性ポンプへの接続を拡張します。F)全体バイオリアクター灌流システムの略図。オレンジの矢印は、フローの方向を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> 図 3: Decellularization と recellularization の間に静脈の形態学を総します。A)通常静脈の総形態の色で明るい赤に見えます。色は decellularization サイクル数の増加とともに失われたB) 2 サイクルとC) 3 サイクルします。D)で 5 サイクル、静脈に見える淡い白。E 灌後静脈) 48 h と F の血) 96 h の内皮細胞培地で色でもう一度明るい赤に見えます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> 図 4:脱と recellularized の静脈のキャラクタリゼーション。ヘマトキシリンとエオシン染色の像A) 通常の静脈に多く青い核が含まれていますが、彼らは欠席でB)脱静脈。静脈と recellularized でC)血 48 h とD)内皮細胞培地 96 h、内腔の細胞 (黒矢印) の添付ファイルがついた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、洗剤と recellularization を末梢血および内皮細胞中の灌流による伏在静脈 decellularization のためのプロトコルについて述べる。

Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

この方法では、伏在静脈組織工学の詳細な手順を説明しています。また、簡単な装置を用いた脱細胞化セットアップや再細胞化のためのバイオリアクターの作製も実演します。この技術の主な利点は、再細胞化に簡単な血液サンプルが必要なため、痛みを伴う骨髄採取や時間のかかる細胞培養手順が不要になることです。Triton-X 100の灌流および洗浄には、脱細胞化セットアップを1台ご用意ください。2リットルのチャンバーに、3つのチューブすべてをテープで固定しますA.1つのチューブを、洗剤の入口のチャンバーの底端が接触する壁にテープで固定します。他の2本のチューブを反対側の壁にテープで固定し、静脈の長さにもよりますが、その間に5〜10センチの距離を空けます。これらのチューブの少なくとも5センチメートルもチャンバーの床にテープで固定する必要があります。オスとメスのルアーコネクタを使用して、洗剤のインレットチューブをチューブBに接続します。次に、チューブBをチューブFに接続し、チューブFをチューブCに接続します。次に、チューブFをペリスタルティックポンプのカセットに入れます。別のチューブCを取り、一方の端を静脈の出口に接続します。もう一方の端を、チャンバーから45センチメートル上に配置された下部ホース出口を備えたガラス瓶に入れ、テープで固定します。これは洗剤の出口として機能します。次に、チューブGの一方の端をガラス瓶のホース出口に押し込み、もう一方の端を静脈チャンバーに入れます。次に、テキストプロトコルで詳しく説明されているように、TnBP灌流用の脱細胞化セットアップ2を準備します。また、本文に詳述されているように、DNAの灌流のための脱細胞化セットアップ3を準備し、摂氏37度に配置します。再細胞化バイオリアクターを準備するには、チューブHを4ポートキャップの1つのポートに挿入して、静脈の出口として機能します。2番目のポートに、メディアインレットとして機能するチューブIを挿入します。そして、3番目のポートに、静脈の入口にチューブJを挿入します。次に、チューブHのもう一方の端を4番目のポートに挿入して、メディア出口として機能します。レデューシングコネクタをチューブHの内側の端に接続し、J.BendチューブJのもう一方の端をU字型に曲げ、縫合糸で結びます。次に、ベースが平らな60ミリリットルのチューブを250ミリリットルのガラスに入れます。次に、チューブKの一方の端を静脈の入口に接続し、もう一方の端をチューブEに接続します。次に、準備したキャップセットアップをボトル内のチューブに入れます。最後に、オートクレーブでバイオリアクターを滅菌します。テキストプロトコルに詳述されているように、ヒトの伏在静脈で2回の凍結融解サイクルを行い、その後、ハサミで長さ2mmの生検を切断します。生検をホルムアルデヒドで室温で24〜48時間固定します。静脈の両端をオスとメスのルアーコネクターのバーブに縫合糸で結びます。静脈を脱細胞化セットアップ1に接続し、チャンバーに1リットルの溶液2を充填します。次に、毎分35ミリリットルで15分間灌流し、セットアップの内容物を空にします。次に、1リットルの溶液4を加え、毎分35ミリリットルで4時間灌流します。内容物を空にし、500ミリリットルの溶液2を加え、5分間灌流し、再び内容物を空にします。灌流セットアップ1から静脈を切断し、灌流セットアップ2に接続します。次に、1リットルの溶液5を加え、攪拌機をオンにし、毎分35ミリリットルで4時間灌流します。灌流セットアップ2から静脈を切断し、20ミリリットルの超純水で静脈の外側を2回洗浄します。次に、注射器を使用して、20ミリリットルの超純水で静脈の内部を5〜10分間2回洗います。テキストプロトコルで説明されているように灌流セットアップ3で灌流した後、静脈を灌流セットアップ1に接続します。1リットルの溶液2を満たし、毎分35ミリリットルで一晩灌流します。核物質を完全に除去するために、灌流プロセスを4回繰り返します。灌流後、セットアップを空にし、1リットルの溶液2を満たし、毎分35ミリリットルで24時間灌流します。24時間後、セットアップを再び空にし、1リットルの超純水を入れます。毎分35ミリリットルでさらに24時間灌流します。最後に、同じ条件を使用して、溶液7を使用して灌流を繰り返します。テキストプロトコルに記載されているように脱細胞化を確認した後、50ミリリットルの溶液8を含む50ミリリットルのチューブに静脈を入れて滅菌します。摂氏37度で1時間、シェーカーで毎分80回転で攪拌します。無菌性を維持するために層流キャビネットで作業し、滅菌鉗子を使用して、500ミリリットルの滅菌溶液7を含む新しい50ミリリットルのチューブに滅菌静脈を移します。前と同じように静脈を12時間攪拌し、その間に少なくとも2回溶液7を交換します。滅菌鉗子を使用して、静脈を新しい50ミリリットルのチューブに移し、50ミリリットルの内皮培地を追加し、11時間撹拌します。次に、滅菌縫合糸と鉗子で静脈をバイオリアクターの静脈入口と出口に結び付けて静脈を接続し、キャップのセットアップを250ミリリットルのボトルに締めます。バイオリアクターに同じ内皮培地を充填します。ヘパリンを1ミリリットルあたり50単位ずつ添加し、インキュベーター内で毎分2ミリリットルで1時間灌流します。ドナーから15〜25ミリリットルの新鮮な血液をヘパリンコーティングされたバキュテナーチューブに収集し、スチン溶液で1対1に希釈します。その後、内分泌腺由来の血管内皮増殖因子、塩基性線維芽球増殖因子、および微妙なサリチル酸を追加します。バイオリアクターから内皮培地を空にした後、血液をそれに加え、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターで毎分2ミリリットルで48時間灌流します。約12時間後、層流キャビネットで作業し、バイオリアクターから一滴の血液を除去し、血糖モニタリング装置を使用してグルコースを測定します。レベルが1リットルあたり3ミリモル未満の場合は、ブドウ糖を追加して1リットルあたり7〜9ミリモルの範囲に収めます。インキュベーターに48時間戻った後、層流キャビネット内のバイオリアクターから血液を排出します。30ミリリットルの滅菌溶液7を加え、5分間灌流し、溶液を排出する。血の赤い色が失われるまで、このプロセスを繰り返します。最後に、30〜45ミリリットルの内皮培地を加え、インキュベーター内で毎分2ミリリットルで96時間灌流します。再細胞化した静脈を層流キャビネット内のバイオリアクターから切り離し、ハサミを使用して静脈の5ミリメートルの端を切り取り、廃棄します。以前と同様に生検を行い、ホルムアルデヒドに入れ、テキストプロトコルに記載されているように再細胞化の検証を行います。正常な静脈の全体的な形態は、色が真っ赤に見えます。赤色は進行性の脱細胞化サイクルで失われ、5サイクルの治療後、淡い白に見えます。末梢血と内皮培地の灌流によって再細胞化された静脈は、再び鮮やかな赤色に見えました。ここに示されているのは、多数の青色核の存在を示す正常静脈の代表的なヘモトキシリンおよびエオシン染色画像です。しかし、脱細胞化した静脈のヘモトキシリンおよびエオシン染色では青色の核は見られませんでした。血液と内皮培地で灌流した再細胞化静脈では、ヘモトキシリンとエオシンの染色で内腔に細胞付着の存在が示されました。この動画を見れば、界面洗剤による伏在静脈の脱細胞化や、末梢血や内皮培地による再細胞化の方法がよく理解できるはずです。Triton-X 100、TnBP、およびDNAの圧力下での灌流を用いたこの脱細胞化技術は、ヒト伏在静脈からの核の除去に成功し、再現性がありました。この技術は完了するまでに20日かかりますが、脱細胞化した静脈をアフターシェルフ製品として保存すると、手順にかかる時間が8日に短縮されます。レシピエントの末梢血を用いた静脈の再細胞化は、臨床的に関連性があると考えられる。同様のプロトコルで再細胞化された静脈は、手術後に機能的な血液供給を提供することにより、臨床移植に有望であることを示しました。わずかな変更を加えるだけで、このプロトコルはあらゆる静脈タイプに使用でき、すべての血管手術のクリニックでパーソナライズされたグラフトとして使用できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ大伏在静脈の脱細胞化と再細胞化プロトコル。Triton-X 100などの洗浄剤を用いた灌流法とバイオリアクターを使い、末梢血と内皮培地で再細胞化する組織工学の革新的手法です。

Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法

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