Name: 事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶマウス網膜の解剖と空間的オリエンテーション解析法。眼の解剖学的ランドマークとS-オプシングラデーションを用いて、背側・腹側・鼻側・側頭側の極を正確に同定する標準化プロトコルを解説します。

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ブルターニュは、その技術支援のジェシカ Onyak、リュー親切に私たちは彼 epifluorescent 顕微鏡を使用させるために感謝したいと思います。サポートの確認: NIH R15EY026255-01 とカール ・ Kirchgessner 財団。

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<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ない包括的な標準化されたプロトコルを確認し解剖学的スペースでマウス単離網膜の方向をラベリングされています。プロトコルの詳細ここで標準化することによって、この空白を埋めるしようと深い解剖学的ランドマークを使用する方法について詳しく説明するポイントを確実に参照として識別網膜の方向。このプロトコルの深い解剖学的ランドマークが角膜の火傷22など表面的なランドマークよりマウス網膜の方向付けのためのより正確で信頼性の高いメソッドを提供することが示されています。したがって、網膜の方向の角膜の火傷に頼ってきた研究にあったかもしれないより大きいエラー脈絡裂、腹直筋などのランドマークに頼ってきた研究よりも向き。この不一致は、結果を解釈し、正確な網膜の向きに依存する研究間で比較を行うこの標準化された議定書の意義と必要性を強調表示します。全体的にみて、ビジョン研究者に従うの一般的な方法を提供する標準化されたプロトコルがなくなり、網膜を識別するための標準メソッドを使用が発生するデータ集録の交絡変数の存在向きです。
紹介した方法は、簡単に再現性と実験的プロトコルの多くの種類に適用されます。実際には、このプロトコルの最大の利点の 1 つはその適応性です。データ集録 (テーブルを最適化する実験的パラメーターに最適なランドマークを選択ことができます脈絡裂、s オプシン式と直筋ランドマークすべて発見されている網膜方向22を確実に同定するため1). さらに、郭清の方法はさらに網膜の方向を明確にまとめることができます。網膜のすべての 4 本の棒を方向づけるために s オプシン免疫組織化学と脈絡裂カットを組み合わせることができますたとえば、: 脈絡裂カットによって鼻と一時的な半球を識別でき、s オプシン免疫組織化学を識別することができます腹側と背側の半球。まだ、このプロトコルの適応性は、生理学実験の時間に敏感な性質によって制限可能性があります。ランドマークを識別、角膜のやけど、緩和カットを実行にかかる時間は、体外実験で重要な組織死で起因できる、未満の最適なこれらの郭清の方法のいくつかあります。幸いなことに、深いランドマークを識別し、緩和、解剖に脈絡裂または上直筋解離法に精通するなるとカット迅速に郭清のルーチンの部分になるし、大幅追加しないでください。郭清の長さ。組織の生存率はもはや問題 (図 3 網膜向きのホックを投稿の s オプシン グラデーションを使用してお勧めただし、ここで説明されている手順非常に時間に敏感な実験の時間に追加できることを認識、).S オプシンは、すべての 4 本の棒を特定すること、網膜を方向づけるための効果的な方法のために網膜を染色: 背側と腹側の極に網膜を分割し、可能にするかどうかによって鼻と時間の同定が極 s オプシン染色網膜右または左の目 (図 3) からです。したがって、このプロトコルが実験的パラメーターを満たすことができる正確な網膜方向法の信頼性と再現性のあるセットを提供と考えています。
として、任意の変更された網膜の郭清を伴う、郭清法の有効性は切開と隔離されている組織の品質の精度によって制限されます。解剖時に任意の組織が失われた場合、正確な再建のため、網膜が破損するとあまりにも Retistruct と MATLAB プログラムされません確実に再構築および網膜の方向を設定することができます。したがって、実験データ収集のために使用前に郭清法を実践することが重要です。解剖の種類は、ここで困難ではありませんを説明しながら、特定のランドマークと網膜の方向を識別する再現性の確保に練習されなければなりません。さらに、正しいランドマークと確信させるのにデータ収集を開始する前に解剖学的ランドマークを視覚的に識別する解剖実習が使用されていることが不可欠です。特定の凝固切開装置の精度を確認する方法の 1 つはいずれかの脈絡裂にカットまたは上直筋を切り取って固定マーカーは、したがって、dissectio の精度に依存しないので s オプシン グラデーションにカットの位置を比較(名) 潜在的な dissectors は、カットは図 1に示すように正確なランドマークと再建された網膜の例に再建された網膜を比較することもと図 2。基本的には、潜在的な解剖特定解離型のこのプロトコルで説明されている手順を実行する必要があります、かどうかは上直筋または脈絡膜裂法と結果の妥当性を確立する s オプシン グラデーションを比較、特定のバイナリ。網膜の不正確な方向に切開がランドマークの場所について確認の場合がありますので、デフォルトに影響を与えるデータの収集と解釈。

網膜神経科学の重要なと時々 見落された側面は適切な方向と全体マウント網膜の分析記録の部屋に電気生理学や組織学的のスライドの網膜の方向かどうか。これは、哺乳類の視覚系の調査のための最も広く使用されているモデルは、現在マウスの網膜を含む調査のため特に重要です。マウス網膜空間的に均一ではないが、メラノプシン神経節細胞、過渡 OFF α 神経節細胞、錐体オプシン1,2 などの機能的に異なる網膜細胞型の密度とサイズ グラデーションの最近の発見を明らかに ,3,4,5。その結果、網膜の方向性を決めるための手法がありますセル型オプシン分布2,3,6を含む実験結果方向が方向性のチューニング神経節細胞7,8,9, と網膜変性症10、11,12,13,14 の地形パターン.実際には、報告しないどのように網膜の方向を報告を引き起こす可能性が不一致文献および混乱の研究の間でデータを比較する際。したがって、研究者がこのような研究の結果を正確に解釈できるように網膜の方向を識別する方法を報告することが重要です。
網膜の方向の眼球摘出1,3,12,15,16,17 前に背側、腹側、鼻または一時的な角膜を得点によって識別される一般的 ,18,19外眼筋6,7など目の深い解剖学的ランドマークを染色したり、によって脈絡膜裂20,21, またはまたはs オプシン グラデーション2,3。腹直筋は上直筋、下直筋、内側直筋、外側直筋、いずれかの添付ファイルを二等分深い緩和カットすることによって背側、腹側、鼻と一時的な網膜をそれぞれ識別するために使用できます。ただし、ほとんどの実験では、1 つの直筋を用いたことで網膜22の方向付けのため十分です。目の開発の残骸である脈絡裂は、目の後ろにかすかな水平線として表示できます。この線の両端は、鼻腔またはグローブ23時間極のいずれかで終了します。最後に、s オプシンの発現は非対称マウスの腹側網膜に分散し、s オプシン抗体は免疫組織化学実験1で腹側の網膜を明らかにする使用ことができます。
Stabioらによる最近の仕事22角膜火傷等表面的な眼のランドマークが解剖学的スペース、ヒューマン エラーと角膜のやけどを作る時間と内側を使用する場合に可変性の原因で網膜の方向付けのため信頼性の低いメソッドであることを示した基準点として canthi。対照的に、上直筋、脈絡裂のオプシン グラデーションなどの深いランドマークは網膜22の方向付けのためのより信頼性の高い、正確なランドマークに示されています。しかし、これらの解剖学的ランドマークの同定文献で詳細に説明されていないユニークな解剖の手順が必要です。したがって、このプロトコルの目標は、上直筋、脈絡裂および s オプシン グラデーションを使用してマウス網膜の空間的なオリエンテーションを正確に識別する方法に関する包括的なチュートリアルを提供することです。さらに、我々 は s オプシン免疫組織化学のためのプロトコルと同様に、2 つのオプシンの抗体の有効性の比較を含まれています。
正確な網膜の向きに依存する研究に追加課題の 1 つは、記録室、料理、またはスライドで wholemount 網膜を平らにするために必要な大規模な緩和カットです。これはフラット二次元構造物としてイメージが作成されたとき、何が当然立体構造の解析のための課題を導入できます。それから収集したデータを分析する前に、その立体構造にフラット wholemount 網膜に戻ります Retistruct24と呼ばれるプログラムを使用できます。したがって、このプロトコルのセクションは Retistruct ソフトウェアを使用して、s オプシン immunostained マウス網膜の再構築に必要な手順を強調する専用です。我々 はまた正確に回転とオリエントのマウス網膜のオプシンとステンド グラスを開発した当社のカスタム MATLAB スクリプトを使用するためのプロトコルのセクションを含まれています。

<table><tbody><tr><td>0.1 M リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 エピ蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>クリア ネイルポリッシュ</td><td>該当なし</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コーニング LSE 低速オービタルシェーカー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC処理 24ウェルプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ヤギ Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ウサギ アレクサ594</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>ロバ ノーマル セラム</td><td>ミリポア</td><td>566460</td><td>5.2% (52 &mu;L と 86 &mu;20%トリトンX-100および863のL &mu;ブロッキング溶液1mLに対して0.1M PBSのL)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>2017年現在、商用利用不可</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ or FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>無料利用可能なソフトウェア</td></tr><tr><td>低温 Cautery Ophthalmic Fine Tip Curiousizer</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>少なくともバージョン2007b以降</td></tr><tr><td>マイクロカバーメガネ&nbsp;</td><td>VWRインターナショナル</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスライドトレイVWR</td><td>インターナショナル</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>モイラ超微細鉗子</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜</td><td>ミリポア</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15714-S</td><td>4% (25 &mu;L と 875 &mu;0.1 M PBSのL 1 mLの固定剤)</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>無料ダウンロードソフト version 3.4.3 以降</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Microscope Camera</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/</td><td>A N/</td><td>A 無料で利用可能なソフトウェア&NBSP; Windows 7またはWindows 10と互換性あり</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount スライド マウント メディア</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>使用 1.7% (86 &mu;20% Triton-X の L と 52 &mu;ロバのLノーマルセラムと863&mu;0.1 M PBSのL、ブロッキング溶液1 mL)</td></tr><tr><td>Vannas Spring Dissection Scissors&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP USB顕微鏡デジタルカメラ</td><td>AmScope</td><td>MU500</td>オ<td>リンパス解剖顕微鏡と一緒に使用する</td></tr></tbody></table>

事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

正確かつ確実にマウス単離網膜の空間的なオリエンテーションを識別する視覚神経科学、密度の解析や網膜のセルタイプのサイズ グラデーションなど、多くの研究の重要な方向性のチューニングの方向神経節細胞といくつかの網膜疾患における地形変性パターンの検討。ただし、多くの異なる眼郭清の方法を文献で報告し、マウス網膜における網膜の方向をラベルに使用するがあります。方向のような調査で使用される方法はしばしば見落とされて、報告しないどのように網膜の方向を決定を引き起こす可能性が不一致文献および混乱の研究の間でデータを比較する際。角膜のやけどなど表面的な眼のランドマークが使われませんが最近腹直筋、脈絡裂のオプシン グラデーションなど深いランドマークより信頼性が低いことが示されています。ここでは、正確に分析し、マウス単離網膜の空間的なオリエンテーションを文書化する深い眼のランドマークの使用のため包括的なガイドを提供します。また 2 つのオプシンの抗体の有効性を比較して s オプシン免疫組織化学のためのプロトコルが含まれています。S オプシン グラデーションによると網膜の方向は、Retistruct ソフトウェアによる網膜再建とカスタム コードの回転を必要とするため、私たちはこれらのプログラムの両方を使用するために必要な重要なステップを発表しました。全体的に、このプロトコルの目標は、最も実験的プロトコルに適応できる正確な網膜向きのメソッドの信頼性と再現性のあるセットを提供することです。この作品の包括的な目標は、将来研究のため網膜方向メソッドを標準化することです。

正確かつ確実に直筋を二等分単一緩和カットは、背側の網膜 (図 1) を識別します。脈絡裂正確かつ確実に鼻と一時的な網膜を深い緩和時間と鼻の脈絡裂 (図 2) に沿って識別します。この例では、緩和のカットもしました背側網膜の網膜 (図 2D、垂直の矢印) の背/腹軸を識別するために。将来 dissectors によってレプリケーションの目的のこれらのプロセスの手順を示します。S オプシン免疫組織化学の組み合わせ (図 3 a と3 D)、(3 b, 3 e) Retistruct ソフトウェアによる再建とカスタム MATLAB コード (3 C、3 f) と正確な回転が可能、鼻と時間極これは網膜が右または左目 (図 3) かどうかがわかっている場合と同様に、網膜の腹側と背側半分の id。S オプシン コーン (図 4A ~ D) をラベリング効果の 2 つの一般的に使用される s オプシン一次抗体も比較した: 両方ヤギ アンチのオプシンの一次抗体、ウサギ抗のオプシンの一次抗体に効果的にラベルを付ける同じマウス s オプシン コーン (図 4E)。
緩和カットされた s オプシン再建 immunostained 網膜上識別され、s オプシン勾配によって決定される方位の場所を比較しました。当社のカスタム MATLAB コード (補足資料参照)、網膜のオプシン染色の最高濃度のある腹、真配置、正確に回転しました (直) の 90 ° で 0 ° (鼻の真の鼻背脈絡裂) と時間 (時間的脈絡裂) の 180 ° 真します。角をカット緩和個々 の価値は、網膜を s オプシン グラデーションによると回転した後に ImageJ で角度ツールを使用して決定されました。各緩和カットタイプの平均角度を計算したし、ポーラー プロット (図 6) でプロットしました緩和カット種類ごとの平均値。平均すると、筋肉のカットは上直筋識別 96.3 ± 4.3 ° 背極 (n = 11) (図 6)。鼻の脈絡裂 6.7 ± 5.8 ° 鼻ポールと一時的な脈絡裂示さ 172.0 ± 4.4 ° 時間極 (n = 9;図 6)。
<img alt="眼構造の顕微鏡分析;背側火傷効果;神経解剖学図;研究データ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: 右目の背側の網膜を正確に識別する上直筋を使用しています。(A) 焼灼ペン (白い矢印) で作られた角膜強膜の国境近くの背側角膜火傷の例。上直筋はこのビュー (白い矢印) に表示されますも。全体の例 (B) 除去のマウントされた網膜は、上直筋を二等分して背側網膜に作られたカット。矢印は、上直筋を二等分によって背側網膜に作られたカットを緩和深を示しています。網膜は一次抗体ヤギ抗-s-オプシンと汚れる (材料の表を参照) と二次抗体ロバの反やぎ Alexa 594 (材料の表を参照してください励起: 590 nm; 排出量: 620 nm) (水色)。網膜をテキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡をイメージしました (595 nm)。(C) A 網膜 Retistruct で再建され、MATLAB のカスタム コードを使用して回転 (補足資料を参照してください)、上直筋効くと目に見えるカット (白い矢印)。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="目の発達分析;背側熱傷および脈絡膜裂傷;顕微鏡画像;解剖学的図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2: 脈絡裂を使用して正確に右目の網膜の鼻と時間の極を識別する。(A) 焼灼ペンで作られた角膜強膜の国境近くの背側角膜火傷の例。(B) 脈絡膜裂強膜 (白い矢印) で目の後ろに表示されます。背側の角膜のやけどは時間的脈絡裂から約 90 ° に位置する、このビューに表示も。(C) 脈絡膜裂強膜、角膜強膜の枠線を走行視神経からの目の後ろに表示されます。(D) は網膜に染まったヤギ抗-s-オプシン (材料の表を参照してください) と二次抗体ロバの反やぎ Alexa 594 (材料の表を参照してください励起: 590 nm; 排出量: 620 nm) 脈絡裂カット (水平 (シアン)矢印) 切り (垂直方向)、背側の緩和します。網膜をテキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡をイメージしました (595 nm)。(E) 網膜は Retistruct で再建され、背の緩和カットと鼻で、一時的な脈絡裂カット表示 (白い矢印) カスタム MATLAB コード (補足資料を参照してください) を使用して回転します。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="網膜マッピング図;左右の網膜分析;回転なしと回転した視覚化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: s オプシンのグラデーションを使用して網膜のすべての 4 本の棒を識別する。S オプシンのラベルに immunostained をされており、テキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡を用いたイメージング右目から網膜の例 (A) 解剖 (595 nm)。地形向き、s オプシン グラデーションによって決まりますので、この網膜でカット、任意です。(B) Retistruct A で網膜の再建の結果。S オプシン グラデーションがない正しく並んでいること網膜がカスタム MATLAB コード (補足資料を参照してください) を実行されていないので注意してください。(C) カスタム コードで網膜を回転の結果。網膜は、s オプシン染色の最高濃度は下部にありますように回転し、腹側の網膜として識別されています。網膜は、右の目からは、一時的なポールは位置 90 ° 背極から反時計回りに、鼻ポール位置 90 ° 背極から時計回りに。(D) 網膜の例は左眼のオプシンのラベルに immunostained をされており、テキサス赤フィルターでイメージから解剖 (595 nm)。地形向き、s オプシン グラデーションによって決まりますので、この網膜でカット、任意です。(E) Retistruct と D で網膜をデジタル再構成の結果。S オプシン グラデーションがない正しく並んでいること網膜がカスタム コードによって回転されていないので注意してください。(F) カスタム コードと D で網膜を回転の結果。網膜は、s オプシン染色の最高濃度は下部にありますように回転し、腹側の網膜として識別されています。網膜は、左の眼からは、鼻のポールの位置 90 ° 背極から反時計回りと一時的な棒が位置 90 ° 背極から時計回りに。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="ヤギウサギ抗S-オプシン免疫染色顕微鏡画像;組織学の断面;データチャート" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4: s オプシン コーンをラベルに 2 つのプライマリ s オプシン抗体の比較。(A) A 網膜ヤギ抗のオプシンの一次抗体で染色 (材料の表を参照してください)。 (B) 同じマウスの他の網膜に染まったウサギ抗のオプシン一次抗体 (材料の表を参照してください)。(C) A ヤギ抗のオプシンの一次抗体で染色網膜から代表 (0.1 × 0.1 mm2)Epifluorescent 顕微鏡を用いた 40 倍の倍率で撮影した画像。網膜から (D) の代表的な地域 (0.1 × 0.1 mm2) に染まったウサギ抗-s-オプシン (材料の表を参照)、一次抗体の代替。イメージは、40 倍の倍率で epifluorescent 顕微鏡で撮影されました。(E) 両抗体のラベル s コーンの外側のセグメントの数が同じヤギ抗-s-オプシンとウサギ抗-s-オプシン テスト網膜の染色陽性の錐体の数に差がないので離心率 (n = 2;アドホックの記事ボンフェローニ テストと分散分析p &gt; 0.05)。スケール バー = 1 mm (A B);25 μ m (C ・ D)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="静的平衡解析、イメージングデータとのソフトウェアインターフェースの図、構造と結果を示す。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5: s オプシンと網膜 immunostained を再構築する Retistruct ソフトウェアを使用するための視覚的なガイドします。アウトライン表示で Retistruct で開かれた A (A) 網膜と、「涙」に追加。「涙」のポイントは、スーパーイン ポーズの白い矢印で示されます。この網膜にあるすべてのカットは、します解剖時に網膜の方向をマークする特定のランドマークが使用されていない任意の。重要なボタンの輪郭が赤に。すべての「涙」追加 (B) A 網膜と網膜の端に"D"が付いて背網膜。「網膜の再構築」ボタンが表示されます注意してください。重要なボタンの輪郭が赤に。(C) 網膜の再建のプロセス。再建された網膜の極座標は、シアン (青い矢印のカット位置を明確にする重ね合わせ) でカット、緩和を示す右に表示されます。(D) Retistruct を通じて網膜を実行する最終的な結果。元 wholemount 網膜そのまま左側と右側再建された網膜に表示されます。緩和のカットは、シアン (カット位置を明確にする重ね合わせ白い矢印) で表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="眼筋の方向を示す放射状チャート。上直筋、脈絡膜裂(鼻、側頭)データ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図 6: 上直筋と脈絡膜裂を正確にマウス網膜の向きを使用できます。カットを緩和、上直筋から得られる角度の極座標または脈絡裂は Retistruct と再建されている網膜にカットできます。緩和カットされた s オプシン再建 immunostained 網膜に識別され、s オプシン グラデーションの場所の場所を調べた。カスタムの MATLAB のコードを使用すると、正確に網膜を回転して s オプシン染色の最高濃度が腹側に位置する、真背 (90 ° 上直筋)、真の鼻 (鼻脈絡裂の 0 °)、真の一時的な脈絡膜のための一時的な (180 °裂) 各網膜を求めた。カット アングルは、ImageJ と平均の角度で決定されたそれぞれの個別緩和の値は、緩和の型をカットごとに算出しました。上直筋カット識別 96.3 ± 4.3 ° 背極 (n = 11)。鼻の脈絡裂 6.7 ± 5.8 ° 鼻ポールと一時的な脈絡裂示さ 172.0 ± 4.5 ° 時間極 (n = 9)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>深いランドマーク</td>
			<td>角膜のやけどの場所</td>
			<td>識別される網膜の極</td>
			<td>実験的アプリケーション</td>
		</tr>
<tr>
<td>上直筋</td>
			<td>背側</td>
			<td>背側</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>鼻の脈絡裂</td>
			<td>背側</td>
			<td>鼻</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>一時的な脈絡裂</td>
			<td>背側</td>
			<td>一時的です</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>S オプシン グラデーション</td>
			<td>どれも</td>
			<td>背、腹、鼻、時間</td>
			<td>固定</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 深いランドマーク、網膜の極彼らを識別するとかライブや固定組織のアプリケーションに使用できます。

このプロトコルは、正確かつ確実に東洋の解剖学的領域でマウス単離網膜に深い眼のランドマーク、s オプシン免疫組織化学、Retistruct、およびカスタム コードを使用するため包括的な郭清と分析のガイドを提供します。

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

この解剖プロトコルの目的は、マウス網膜の地形的向きのための直腸筋、脈絡膜裂傷、S-オプシン勾配などの眼の解剖学的ランドマークの使用のための標準化された方法論を提供することです。これらの技術の主な利点は、単離されたマウス網膜の背側、腹側、鼻側、および側頭の極を正確に識別するための信頼性の高い方法を提供することです。まず、角膜強膜の境界付近、および鼻腔と側頭水路の間の角膜背側の点を特定します。加熱した焼灼ペンで角膜に1秒未満触れて、向きの目的で火傷跡を作成します。2番目の目についても繰り返します。背側熱傷の存在により、上直筋の同定が可能になります。核摘出術の場合は、湾曲した鉗子を使用して、眼球を眼窩からそっと押し出し、球体を下からつかみます。次に、グローブをソケットからゆっくりと持ち上げると同時に、グローブがソケットから解放されるまで左から右にゆっくりと動かします。直腸筋が付着したグローブを、解剖培地が入ったシャーレに移します。両目で作業する場合は、どちらの目が左目で、どちらが右目であるかを追跡してください。解剖スコープの下で、背側の角膜熱傷を視覚的に特定し、それに関連する上直筋を特定します。解剖ハサミまたは20ゲージの針を使用して、火傷跡で角膜に穴を開けます。次に、視神経に向かって球体に深い浮き彫りの切り込みを入れて、上筋を二等分します。この切り傷を持つ孤立した網膜がここに見られ、この切り傷を持つ再建された網膜がここに示されている。2セットの鉗子を使用して、網膜の一部が露出するまで穿刺でできた穴をそっと引き裂くことにより、網膜の分離を開始します。次に、強膜が完全に除去されるまで、網膜を強膜から引き離します。網膜が完全に分離されるまで、虹彩、水晶体、硝子体、および残っている構造をすべて取り除きます。背側火傷の存在により、鼻および側頭の脈絡膜裂傷の特定が可能になります。右目で作業する場合、鼻脈絡膜裂傷は火傷の右側にあり、側頭脈絡膜裂傷は火傷の左側にあります。これは、左目での作業とは逆です。脈絡膜裂傷のランドマークを使用して網膜の向きを特定するには、目の裏側にある脈絡膜裂傷を見つけて特定します。目がまだマウスの中にある場合のように、背側の火傷跡が上極に位置するように地球儀を向きます。次に、解剖ハサミまたは20ゲージの針を使用して、最初に背側の火傷がある場所に地球に1つの穴を開けます。次に、背側の角膜火傷が位置する視神経に向かって浅いレリーフカットを行います。次に、視神経に向かって次の2つの深い浮き彫りの切り込みを入れます。1つは、解剖ハサミの刃を目の後ろの側頭脈絡膜裂傷線に合わせ、もう1つは、解剖ハサミの刃を目の後ろの鼻脈絡膜裂傷線に合わせます。これらの切り傷は、ここでは孤立して再構築された網膜に示されています。これらのカットを行った後、2セットの鉗子を使用して、網膜の一部が露出するまで穿刺穴をそっと引き裂きます。解剖ハサミを使用して、網膜が平らになるように網膜に4つの緩和カットを作成します。神経節細胞側を上にして、網膜の各角を鉗子で膜にそっと押し付けて、網膜をニトロセルロース膜に取り付けます。次に、鉗子を使用して、取り付けられた網膜を24ウェルプレートの最初のウェルに含まれる1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドに浸します。24ウェルプレートを室温のオービタルシェーカーに置き、網膜を正確に40分間固定します。固定後、網膜を1ミリリットルの0.1モルPBSで満たされたプレートの2番目のウェルに移し、室温で15分間網膜を洗浄する。洗浄が完了したら、取り付けた網膜を1ミリリットルのブロッキング溶液を含む5番目のウェルに移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、ウサギ抗S-オプシン一次抗体をブロッキング溶液に1〜500の濃度で加え、摂氏4度で3日間インキュベートします。3日間のインキュベーション後、1ミリリットルのPBSを充填した6つのウェルに室温でそれぞれ10分間順次配置することにより、網膜から余分な一次抗体を6回洗浄します。次に、洗浄した網膜を新鮮なブロッキング溶液の入ったウェルに入れ、ロバ抗ウサギAlexa 594二次抗体を添加します。網膜を二次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、前と同じようにPBSで網膜を6回洗浄します。鉗子を使用して、取り付けられた網膜をPBSを含むシャーレに移します。網膜が付着しなくなるまで、鉗子の先端を網膜と膜の間にそっと挿入することにより、網膜をニトロセルロース膜から解放します。ガラス顕微鏡スライドをPBSに浸し、網膜をスライド上に浮かべ、網膜がガラスにくっつくまで鉗子で優しく突いて、網膜をスライドに取り付けます。スライド上の網膜を封入剤で覆い、1.5カバースリップを置きます。スライドをスライドトレイに入れ、室温で1時間放置します。1時間後、スライドトレイを摂氏4度に置きます。スライドを24時間カバースリップした後、マニキュアを使用してスライドの側面をシールし、乾燥を防ぎます。これは、右眼から分離された網膜を免疫染色してS-オプシンを標識し、落射蛍光顕微鏡で画像化した例です。この網膜の切り傷は、地形の向きがS-オプシン勾配によって識別できるため、任意であることに注意することが重要です。取得した網膜の画像は、ReadiStructソフトウェアでデジタル再構成できます。この画像では、元のカットは疑似色の赤です。このプログラムの出力ファイルが網膜を正しく位置合わせしていないことに注意してください。網膜をカスタムマットラボコードに通した後、網膜を回転させて、最高濃度のS-オプシン染色が下部に配置され、腹側網膜として識別されます。この画像は、左目からの網膜を示しています。側頭極は腹側極から反時計回りに90度の位置にあり、鼻極は腹極から時計回りに90度の位置にあります。これらの解剖技術を習得すると、適切に実行すれば、わずか数分でかなり迅速に行うことができます。このビデオを見れば、上直筋、脈絡膜裂傷、またはS-オプシン勾配を目印としてマウス網膜を正確かつ確実に向き合わせる方法についてよく理解できるはずです。

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