事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド

この解剖プロトコルの目的は、マウス網膜の地形的向きのための直腸筋、脈絡膜裂傷、S-オプシン勾配などの眼の解剖学的ランドマークの使用のための標準化された方法論を提供することです。これらの技術の主な利点は、単離されたマウス網膜の背側、腹側、鼻側、および側頭の極を正確に識別するための信頼性の高い方法を提供することです。まず、角膜強膜の境界付近、および鼻腔と側頭水路の間の角膜背側の点を特定します。

加熱した焼灼ペンで角膜に1秒未満触れて、向きの目的で火傷跡を作成します。2番目の目についても繰り返します。背側熱傷の存在により、上直筋の同定が可能になります。

核摘出術の場合は、湾曲した鉗子を使用して、眼球を眼窩からそっと押し出し、球体を下からつかみます。次に、グローブをソケットからゆっくりと持ち上げると同時に、グローブがソケットから解放されるまで左から右にゆっくりと動かします。直腸筋が付着したグローブを、解剖培地が入ったシャーレに移します。

両目で作業する場合は、どちらの目が左目で、どちらが右目であるかを追跡してください。解剖スコープの下で、背側の角膜熱傷を視覚的に特定し、それに関連する上直筋を特定します。解剖ハサミまたは20ゲージの針を使用して、火傷跡で角膜に穴を開けます。

次に、視神経に向かって球体に深い浮き彫りの切り込みを入れて、上筋を二等分します。この切り傷を持つ孤立した網膜がここに見られ、この切り傷を持つ再建された網膜がここに示されている。2セットの鉗子を使用して、網膜の一部が露出するまで穿刺でできた穴をそっと引き裂くことにより、網膜の分離を開始します。

次に、強膜が完全に除去されるまで、網膜を強膜から引き離します。網膜が完全に分離されるまで、虹彩、水晶体、硝子体、および残っている構造をすべて取り除きます。背側火傷の存在により、鼻および側頭の脈絡膜裂傷の特定が可能になります。

右目で作業する場合、鼻脈絡膜裂傷は火傷の右側にあり、側頭脈絡膜裂傷は火傷の左側にあります。これは、左目での作業とは逆です。脈絡膜裂傷のランドマークを使用して網膜の向きを特定するには、目の裏側にある脈絡膜裂傷を見つけて特定します。

目がまだマウスの中にある場合のように、背側の火傷跡が上極に位置するように地球儀を向きます。次に、解剖ハサミまたは20ゲージの針を使用して、最初に背側の火傷がある場所に地球に1つの穴を開けます。次に、背側の角膜火傷が位置する視神経に向かって浅いレリーフカットを行います。

次に、視神経に向かって次の2つの深い浮き彫りの切り込みを入れます。1つは、解剖ハサミの刃を目の後ろの側頭脈絡膜裂傷線に合わせ、もう1つは、解剖ハサミの刃を目の後ろの鼻脈絡膜裂傷線に合わせます。これらの切り傷は、ここでは孤立して再構築された網膜に示されています。

これらのカットを行った後、2セットの鉗子を使用して、網膜の一部が露出するまで穿刺穴をそっと引き裂きます。解剖ハサミを使用して、網膜が平らになるように網膜に4つの緩和カットを作成します。神経節細胞側を上にして、網膜の各角を鉗子で膜にそっと押し付けて、網膜をニトロセルロース膜に取り付けます。

次に、鉗子を使用して、取り付けられた網膜を24ウェルプレートの最初のウェルに含まれる1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドに浸します。24ウェルプレートを室温のオービタルシェーカーに置き、網膜を正確に40分間固定します。固定後、網膜を1ミリリットルの0.1モルPBSで満たされたプレートの2番目のウェルに移し、室温で15分間網膜を洗浄する。

洗浄が完了したら、取り付けた網膜を1ミリリットルのブロッキング溶液を含む5番目のウェルに移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、ウサギ抗S-オプシン一次抗体をブロッキング溶液に1〜500の濃度で加え、摂氏4度で3日間インキュベートします。3日間のインキュベーション後、1ミリリットルのPBSを充填した6つのウェルに室温でそれぞれ10分間順次配置することにより、網膜から余分な一次抗体を6回洗浄します。

次に、洗浄した網膜を新鮮なブロッキング溶液の入ったウェルに入れ、ロバ抗ウサギAlexa 594二次抗体を添加します。網膜を二次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、前と同じようにPBSで網膜を6回洗浄します。

鉗子を使用して、取り付けられた網膜をPBSを含むシャーレに移します。網膜が付着しなくなるまで、鉗子の先端を網膜と膜の間にそっと挿入することにより、網膜をニトロセルロース膜から解放します。ガラス顕微鏡スライドをPBSに浸し、網膜をスライド上に浮かべ、網膜がガラスにくっつくまで鉗子で優しく突いて、網膜をスライドに取り付けます。

スライド上の網膜を封入剤で覆い、1.5カバースリップを置きます。スライドをスライドトレイに入れ、室温で1時間放置します。1時間後、スライドトレイを摂氏4度に置きます。

スライドを24時間カバースリップした後、マニキュアを使用してスライドの側面をシールし、乾燥を防ぎます。これは、右眼から分離された網膜を免疫染色してS-オプシンを標識し、落射蛍光顕微鏡で画像化した例です。この網膜の切り傷は、地形の向きがS-オプシン勾配によって識別できるため、任意であることに注意することが重要です。

取得した網膜の画像は、ReadiStructソフトウェアでデジタル再構成できます。この画像では、元のカットは疑似色の赤です。このプログラムの出力ファイルが網膜を正しく位置合わせしていないことに注意してください。

網膜をカスタムマットラボコードに通した後、網膜を回転させて、最高濃度のS-オプシン染色が下部に配置され、腹側網膜として識別されます。この画像は、左目からの網膜を示しています。側頭極は腹側極から反時計回りに90度の位置にあり、鼻極は腹極から時計回りに90度の位置にあります。

これらの解剖技術を習得すると、適切に実行すれば、わずか数分でかなり迅速に行うことができます。このビデオを見れば、上直筋、脈絡膜裂傷、またはS-オプシン勾配を目印としてマウス網膜を正確かつ確実に向き合わせる方法についてよく理解できるはずです。