Name: ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ三次元肝モデル構築法。HepG2細胞を用いた脱細胞化ラット肝臟の再細胞化とAAVベクター導入により、ウイルス研究と遺伝子治療の応用を動物実験代替で推進する革新的手法です。

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著者は、技術支援を提供してくれたBernd Krostitz氏、プロジェクトへの初期貢献をしてくれたRadoslaw Kedzierski氏、校正と有益なコメントを提供してくれたErik Wade氏、そしてバイオリアクターを提供し、臓器の脱細胞化に関する貴重な経験を共有してくれたHeike Walles教授に感謝しています。また、このプロジェクトへの資金提供とベルリン工科大学による出版にも感謝しています。

注：RLはLandesamtのfürお大事にウントSoziales（LaGeSo）からの器官の外植のための倫理的な承認を得ました。肝臓をウィスター系ラットから外植されました。下大静脈および肝臓の門脈は22 Gカニューレでカニューレを挿入しました。外植された肝臓の脱細胞化するための方法は、以前に記載されている。ここで使用される4,5、細胞外マトリックスは、1％デオキシコール酸ナトリウムでラット肝臓の過度の灌流により得ました。 ラット肝臓の細胞外マトリックス（ECM）の1.再細胞化<ol><li>肝細胞株HepG2の拡大<ol><li>培養ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）10％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、及びペニシリンの2mMのストレプトマイシン、それぞれを補充1640培地中で肝細胞癌細胞株HepG2。 </li><li> T175ボトル中1.5×10 7個の細胞を播種し、37℃、5％CO 2で細胞を成長させます</sub&gt;。 37℃、5％CO 2で5分間トリプシン処理により4日後に収穫細胞。 </li><li> 300×gで細胞をスピンダウンし、4 mlのPBSで再懸濁し、顕微鏡下でノイバウアー室で細胞を数えます。 One T175ボトルは、約4.5×10 7個の細胞が得られます。 注：文化はECMあたり6×10 8 HepG2細胞（4-5×10 8個の細胞それぞれに10×175cm 2の培養フラスコ）を持つラット肝臓ECMの再細胞化のために十分な細胞数が含まれていることを確認してください。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" /> 図1.バイオリアクターシステム。A）このバイオリアクターシステムは、カスタムメイドでした。これは、37℃、5％CO 2で、臓器モデルを維持します。蠕動ポンプの流量を個別に調整することができる。B）肝臓成長チャンバとの接続に配置されています蠕動ポンプ、媒体貯蔵、気泡トラップと圧力センサで構成されて灌流回路にエド。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li> ECMの再細胞化<ol><li>肝灌流チャンバー、灌流システム、媒体のリザーバと気泡トラップを含む、バイオリアクターシステムを設定します。バイオリアクターシステム（121℃、15分）を滅菌します。 </li><li>蠕動ポンプでバイオリアクターシステムを接続し、適切な条件（37℃、5％CO 2）を提供するインキュベーターに置き。バイオリアクターシステム（ 図1）の肝灌流チャンバー内の脱細胞化ラットの肝臓の足場8を配置します。 </li><li>灌流システムにチューブクリップを使用してカニューレを挿入し、門脈と大静脈を接続します 。 （1.1に記載のように）150 mlのRPMI培地で足場の平衡/分1.25ミリリットルの流量で5日間にわたって。 </li><li>メディア回路からの肝臓の足場を外し、5ミリリットルの注射器を使用して、門脈を経由して（5ミリリットル中）3×10 8 HepG2細胞と足場に接種、気泡の形成を回避し、細胞がためにそれらをインキュベートすることによって、ECMを再投入することを可能にしますポンプと足場で1時間はオフ。 </li><li>徐々に10分間1.25 ml /分で開始し、ポンプを調整することで流量を増加させます。 20分間、2.5ml /分、最後に3.75ミリリットル/ 30分間分。 </li><li>繰り返しは、6×10 8の全細胞数に到達するために1.2.4-1.2.5を繰り返します。 </li><li> /分3.75ミリリットルの流量でバイオリアクターシステムを実行します。文化2週間の再細胞化ラット肝。 注：一日おきに新鮮な培地（50ml）で媒体の三分の一を交換してください。このような乳酸デヒドロゲナーゼ活性、培地試料のpHおよびグルコースおよび乳酸の濃度などの生理学的パラメータを測定するための培地をサンプリングします。 </li></ol></li></ol>再細胞化ラット肝の2伝達<ol start="1"><li> AAVベクターの大規模生産<ol><li>前述のように、生成、精製、及びAAVベクターを定量：11 <ol><li>簡潔には、ローラーボトルにAAVベクターを生成し、イオジキサノール勾配遠心分離により、それらを精製します。 PD10ゲル濾過カラム上で濾過することにより、残留イオジキサノールを削除します。標準として、ゲノムのAAV DNAを用いて、qPCRによりAAVベクターの濃度を決定します。 注：本研究で使用される自己相補的、偽AAV2 / 6ベクターは、形質導入効率および内因的に発現する遺伝子のノックダウンのためのshRNA発現カセット（ ヒトシクロフィリンB（hCycB）、 図2）を実証するためのレポーターとしてEmGFPをコードしていました。血清型6（肝臓モデルあたり2.7×10 13 AAVベクター）の偽scAAVベクトルの十分な量を確保。 </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" /> 本研究で使用される自己相補的、偽AAV2 / 6ベクターの図2.地図。ゲノムはAAV2の逆方向末端反復（ITR）で構成され、同様に、CMVプロモーターの制御下EmGFPを符号化するshRNA制御下U6プロモーターの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>肝臓モデルの導入<ol><li> PBSのそれぞれの容量を追加することで、5ミリリットル中に2.7×10 13ベクターゲノムの最終濃度までAAVベクター溶液を調整します。 </li><li>カニューレからチューブを除去することにより、メディア回路から肝臓を外します。門脈のカニューレに5ミリリットルの注射器を接続し、完全なAAVベクター溶液（5 ml）を注入します。 注：Optionallyは、肝臓全体のAAVベクター溶液の分布に従うようにフェノールレッド（5μg/ ml）を加えます。 </li><li>ポンプなしで1時間インキュベートします。徐々に10分間1.25 ml /分で開始し、流量を増加させます。 2.5ミリリットル/ 20分および30分間3.75はml /分分間。文化6日間の再細胞化ラット肝。 注：1.2.7下の注で与えられる媒体の三分の一を交換してください</li></ol></li></ol>再細胞化形質導入ラット肝臓の3評価<ol start="1"><li>ヘマトキシリンおよびエオシン（HE）染色および免疫組織化学的解析<ol><li>メスを用いて、各肝葉からのサンプル（0.5×0.5×1.5〜2センチメートル）を取ります。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）に4℃で1.5時間、+ 4％スクロース溶液（3.1.1）からのサンプルをインキュベートします。 （ 注意 ：PFAは、必ず換気フード内でPFAを維持し、適切な防護服を着用し、有毒で発癌性である）洗浄PBSで3回（洗浄ステップあたり1分）および8％でインキュベート4℃でのスクロース一晩。 </li><li>プラスチックcryomoldsに培地を固定注ぎ、気泡を含まない培地中固定にサンプルを置きます。サンプルが十分に覆われるまで固定培地を追加します。ストアは、さらに使用するまで-80℃でサンプルを組み込み。 </li><li> cryotome 12で凍結切片（10μm）を準備します。ヘマトキシリン+エオシン染色8によって再細胞化を評価します。 （：EmGFPここでは）目的遺伝子のための免疫組織化学染色により形質導入効率を評価します。 </li></ol></li><li>分子生物学的サンプリング<ol><li>生検パンチ（直径4mm）で各肝葉をサンプリング。 EmGFPの導入遺伝子発現の評価のための製造元の指示に従って全RNA、DNAやタンパク質を単離、および8をノックダウンhCycB。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+spheroid+culture+of+human+liver+hepatocellular+carcinoma+cell+line+cells+demonstrate+distinct+global+gene+expression+patterns+and+functional+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Butler, D., Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientists+in+the+dark+after+French+clinical+trial+proves+fatal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal.</a> Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).</li>
<li>Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+penetrate+human+solid+tumor+tissue+in+vivo+more+effectively+than+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Decellularization+of+Rat+Livers+in+an+Oscillating-pressure+Perfusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device.</a> J. Vis. Exp. (102), e53029(2015).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).</li>
<li>Wagner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+three-dimensional+humanized+liver+model+for+the+study+of+viral+gene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors.</a> J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).</li>
<li>Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+gene-based+therapies%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).</li>
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<li>Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+adeno-associated+virus+vectors+for+RNA+interference+applications+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+and+purified+genomic+adeno-associated+virus+DNA+as+a+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard.</a> Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する再構成された3D肝臓はヒト化システムにウイルスベクターを研究するためのモデルを提供します。ヒト肝細胞癌細胞株とラットの肝臓のECMの再増殖は、大規模な生物製剤の研究を可能にする血管新生したシステムを生成します。これらの結果は、概念実証再構成された肝臓モデルを効率的にウイルスベクターを用いて形質導入することができます。 ここに示した実験では、肝臓の一人ひとりローブはAAVベクターによって形質導入されました。しかし、いくつかの予備実験では、単一のローブは、細胞を再増殖しませんでした。血管系の閉塞から細胞破片または他のコンポーネントを防止することが重要です。すべてのローブが灌流できるかどうかをテストするには、このようなフェノールレッドなどの非毒性色素が肝臓モデルを通してフラッシュすることができます。 もう一つの重要な問題は、無菌の肝臓の足場を保っています。エタノールまたは抗生物質による治療がdisadvですがantageous血管系のため、γ線と細胞外マトリックスの照射は、血管を保存し、サンプルを滅菌しました。 再細胞化手順および再増殖の時間に使用される細胞の数は、再現性のある結果が得られるように調整する必要ができるように、また、外植肝臓の大きさは、異なります。 本研究で使用したラットの肝臓は、比較的大きく、細胞および試験試薬（ 例えば、AAVベクター）を大量に必要とします。また、再増殖の手順は、二つ以上の週間かかりました。これは、合理的な努力で行うことができます反復の数を制限します。我々は現在、少数の細胞と少ないテスト試薬の使用を可能にする、ラットの肝臓のボリュームの唯一の約五分の一であり、マウスの肝臓、のためのモデルを確立しています。細胞数の比例スケールダウンが妥当と思われるが、正確な量はfurtで決定する必要があります彼女の実験。 本モデルの別の欠点は、肝細胞HepG2細胞株の使用です。実験は、生理学的に関連性の高いモデルを提供する人工多能性幹細胞から分化した肝細胞の使用を開発することが継続中です。さらに、肝臓は肝細胞、 例えば 、クッパー細胞とsinosoidsに加えて、複数の細胞型で構成されています。私たちは、ECMが複数の細胞型で再細胞化されたときに異なる種類の細胞は、それらの自然環境を再投入することを前提としています。 3D肝モデルは、いくつかの利点を組み合わせます。 in vivoモデル従来の主な欠点は、動物生理学は人間の生理と実質的に異なるということです。ヒト患者の治療の毒性副作用は、したがって検出されないままであってもよいです。この欠点は、より密接にHUの生物学を反映するヒト細胞と3D肝臓モデルを再構成することによって克服することができます男性患者。 肝臓モデルの第2の利点は、動物福祉への貢献です。動物成分を再構成実験のために必要とされるが、余剰動物はそれはすなわち 、追加の動物が必要とされない、他の動物実験のために屠殺し、使用することができるように、このアプローチは依然として、3R原則（置換、還元、改良）の目的を以下アプローチは完全に頻繁にin vivo実験に関連している動物の苦しみを避けることができます。スフェロイドは、3Dシステムで細胞プロセスを研究するための代替ツールです。大規模な物質や生物製剤は、構造体の内側の部分に深く浸透しないように、しかし、スフェロイドは、血管新生されていません。これらの問題は、血管新生した3D肝臓モデルで克服されました。 彼らは、遺伝子治療のための最も有望な候補の一つであるので、ここで説明した実験では、AAVベクターは、調査しましたアプリケーション。以下のような多数の遺伝子治療アプローチが、肝炎ウイルスによるまたはα-1アンチトリプシン欠損症の感染の治療のため、例えば 、肝臓を標的とすることを目指し、3D肝臓はこれらのAAVベクターの開発の過程で使用することができます。また、当然のことながら、他の肝親和性ウイルスベクター、 例えば 、アデノウイルスベクターの研究に適しています。また、例えば、B型またはC型肝炎ウイルスなどの感染性肝炎ウイルスを研究するために使用することができます。例えば、新たな抗ウイルス戦略を設計するために使用することができます。また、3次元臓器モデルは、癌を治療するため、および毒性試験を実施するために新しい細胞増殖抑制治療薬を開発するための有望なツールを表します。長期的には、人工肝臓を移植などの再生医療で使用することができます。まとめると、3D肝臓モデルは、感染生物学および生物医学研究の他の分野でのアプリケーションの広い範囲を提供しています。

現在のほとんどの生物医学研究は、二次元(2D)の細胞培養実験または動物モデルのいずれかに依存しています。これらはその性質上、三次元(3D)です。ただし、これらのアプローチにはいくつかの深刻な欠点があります。2D培養で増殖した細胞は、3D条件下で培養した細胞とは遺伝子発現パターンや細胞生理機能が異なることが示されています。1 動物モデルは、倫理的な懸念と関連しているだけでなく、しばしば人間の生理学をうまくモデル化していません。化合物の明らかな毒性作用の欠如は、ヒトへの最初の投与前に動物モデルで確認する必要がありますが、臨床試験で深刻な、時には致命的な副作用が発生した複数のケースが文書化されています。.2
>jove_content<これらの欠点を克服するために、ヒト化された3D生体外臓器モデルは重要な研究ツールとなっています。適切な条件下で培養すると、細胞は自己組織化してスフェロイドと呼ばれる3D構造になります。しかし、これらのスフェロイドは血管系を欠いているため、低分子化合物、大型生物製剤、ウイルスベクターの分布は同様に制限されます。例えば、アデノウイルスベクターは、ヒト膠芽腫から調製されたスフェロイドの外側の細胞層のみを形質導入しました。3 この問題の解決策は、血管系を含む臓器モデルを使用することです。この目的のために、目的の臓器を動物から摘出することができ、動物の細胞をヒトの細胞に置き換えることができます。界面活性剤またはチョル酸ナトリウムによる処理による動物の肝臓の脱細胞化のための様々な方法が記載されている。4-6 得られた細胞外マトリックス(ECM)には、さまざまな細胞プロセスを調節するサイトカインと成長因子が存在します。7 ヒト細胞を用いた再細胞化の足場として用い、機能的な臓器モデルを得ることができる。
最近の研究では、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの分布と導入遺伝子発現を研究するために、ヒト化された3D肝臓モデルを使用しました。8 AAVベクターは、遺伝子治療用途で最も有望なウイルスベクターに属しています。9 西洋世界で最初に承認された、そして現在までに承認された唯一の遺伝子治療介入は、リポタンパク質リパーゼの転写にAAVベクターを使用する。10名

<table><tbody><tr><td>インキュベーター</td><td>フラウンホーファー</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>フラウンホーファー</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>溝付きフランジ</td><td>デュラン</td><td>2439454</td><td>ガファーによって変更</td></tr><tr><td>Oリング 透明</td><td>デュラン</td><td>2922551</td><td></td></tr><tr><td>クイックリリースクランプ</td><td>デュラン</td><td>2907151</td><td></td></tr><tr><td>フラットフランジ 蓋</td><td>デュラン</td><td>2429857</td><td>ガファーによって変更された</td></tr><tr><td>ねじ山チューブ</td><td>デュラン</td><td>2483802</td><td>ガファーによって変更された</td></tr><tr><td>ねじ山チューブ</td><td>デュラン</td><td>2483602</td><td>ガファーによって変更された</td></tr><tr><td>シリコンシーリングリング</td><td>デュラン</td><td>2862012</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ</td><td>デュラン</td><td>2924013</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ</td><td>デュラン</td><td>2924008</td><td></td></tr><tr><td>開口部デュラン付きスクリューキャップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>開口部付き2922709スクリューキャップ</td><td>デュラン</td><td>2922705</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>VWR</td><td>228-1500</td><td></td></tr><tr><td>チューブコネクタ</td><td>Ismatec</td><td>ISM556A</td><td></td></tr><tr><td>生体適合性チューブ</td><td>Ismatec</td><td>SC0736</td><td></td></tr><tr><td>T175 培養フラスコ</td><td>Greiner bio-one</td><td>660 160</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0940-100</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>cc pro</td><td>S-10-M</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュテック O.C.T.</td><td>Weckert-Labortechnik</td><td>600001</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 180</td><td></td></tr><tr><td>クライオモールド 15 x 15 x 5 mm</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy パンチ 4 mm</td><td>pfm medical</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin miRNA</td><td>Macherey &ナーゲル</td><td>740971.10</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオスピンRNA / DNAバッファーセット</td><td>Macherey &ナーゲル</td><td>740944</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト肝細胞癌細胞株hepg2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

このプロトコルは、3次元（3D）の生成ex vivoで肝臓モデルおよびウイルスベクター系の研究・開発への応用について説明します。モデルは、ヒト肝細胞系と脱細胞化ラット肝臓の細胞外マトリックスを再構築することによって得られます。モデルは、生きている動物と潜在的に有害な実験を交換し、血管新生した3Dセルシステムの研究を可能にします。別の利点は、動物モデルよりも、ヒトの生理に近いモデルのヒト化性質です。 本研究では、アデノ随伴ウイルス（AAVベクター）に由来するウイルスベクターを使用してこの肝臓モデルの伝達​​を実証します。メディアと3D肝モデルを供給する灌流回路は、ベクトルを適用するための簡単な手段を提供します。システムは、肝臓の主要な代謝パラメータのモニタリングを可能にします。最終的な分析のために、組織試料はrecellularizaの程度を決定するために撮影することができ組織学的技術によってます。送達導入遺伝子のウイルスベクターおよび発現の分布は、定量的PCR（定量PCR）、ウェスタンブロット法および免疫組織化学によって分析することができます。基礎研究における遺伝子治療用途の開発のベクトルモデルの多数のアプリケーションでは、新規の抗ウイルス治療薬の開発、癌研究、およびウイルスベクターの研究とその潜在的な副作用を含め、想定することができます。

再細胞化の程度の評価のために、凍結切片を各再細胞化肝臓モデルの各葉から調製しました。切片を次にヘマトキシリンおよびエオシン染色によって分析しました。 図3に見られるように、TLM1、TLM2（形質導入された肝モデル1 +2）とCtrl（形質再細胞化された肝臓モデルの制御ではなく）として示される3つの肝臓モデルの各ローブは、HepG2細胞で再増殖しました。この肝細胞癌細胞株は、15歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から確立されました。肝臓モデルの一部の地域では、より集中的に他のものよりも再細胞化されました。これらの変化の原因を決定することが残っています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" /> 図 3分析肝臓モデルの各ローブの 3 ヘマトキシリンおよびエオシン染色 TLM1 + 2：形質導入された肝臓モデル1および2;再細胞化が、形質導入されていなかったのCtrl：制御肝臓モデル。スケールバー：200μmです。 （参考文献からの許可を得て再印刷。8.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 次のステップでは、肝臓のモデルの導入を評価しました。この目的のために、DNAは、肝臓モデルのそれぞれの28のパンチ生検から調製し、ベクターの力価は、qPCRにより定量しました。平均して、セル当たり55および90に内在ベクターゲノム（VG /セル）は、2つの形質導入された肝臓モデルを測定しました。 2D細胞培養における実験は、30 VG /セルを示している強力なトランスジーン発現およびRNAi媒介性サイレンシングのために十分です。 EmGFPの製造は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングによって分析しました。実際には、レポーターの発現は、それぞれ、mRNAおよびタンパク質レベルに対する生検の80〜90％で検出されました。8形質導入効率の全体像を得るために、凍結切片を免疫組織学的に分析しました。 図4に見られるように、DAPI染色により可視化に成功し、再細胞化された肝臓モデルの領域は、また、EmGFP発現の免疫組織化学的分析に強い蛍光シグナルが得られました。予想されるように、AAVベクターで処理されていない対照肝臓モデルは、任意のEmGFP発現を示しませんでした。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" /> EmGFP式図 4. 免疫組織化学的分析の肝臓モデルを再増殖細胞をDAPI染色（青色）によって可視化しました。 EmGFP発現は免疫化学染色（赤色）で可視化しました。 TLM1 + 2：形質肝臓モデル1及び2を、再細胞化が、形質導入されていなかったのCtrl：制御肝臓モデル。スケールバー：200μmです。 （許可を得て再印刷文献から。 8.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 最後の試験では、hCycBのAAV媒介性ノックダウンは、定量RT-PCRによって分析しました。 hCycBのノックダウンは、70〜90％であることがわかっ2形質導入された肝臓モデル（ 図5）のすべてのローブを渡って平均しました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" /> AAV-形質導入した3D肝臓モデルでhCycBの図5. RNAi仲介ノックダウン。hCycBのサイレンシングは、定量RT-PCRによって決定しました。平均値と標準偏差（SD）は、（それぞれ、TLM1及び2）各形質導入された3D肝臓モデルの全てのサンプルについて計算し、非形質導入コントロールの平均値に標準化した（Ctrlキー。）。 （Rからの許可を得て再印刷エフ。 8.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

脱細胞化したラット肝臓の再細胞化細胞外マトリックスは、ウイルスまたはウイルスベクターの分布と導入遺伝子発現を研究するためのヒト化された3次元ex vivoモデルとして使用することができます。

ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

本手順の全体的な目的は、ウイルスおよびウイルスベクターの研究を行うための三次元肝臓モデルを構築することです。この手法により、マウスやラットモデルのげっ歯類細胞とは生理学的特性が異なるヒト細胞を用いた、血管化された三次元システムにおける生物学的プロセスの研究が可能になります。さらに、生きた動物を用いた実験を回避することで動物福祉を向上させるステップとなり、長期的には動物由来成分を完全に代替することを目指しています。本手法は遺伝子導入のためのウイルスベクターを研究するために開発されましたが、感染性のあるウイルス研究や、がん研究などの他の研究分野にも適用可能です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるViola Rohrsが行います。動物福祉に配慮し、本研究では他の動物実験で犠牲となった余剰動物のみを使用しました。すなわち、肝臓スキャフォールドの作製にあたり、追加の動物は必要ありませんでした。まず、肝細胞株Hep G2を増殖させます。10%胎児牛血清および2 mMのグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含む培地30 mLを用いて、1,500万個の細胞をT175ボトルに播種します。4日間の培養後、培養条件下でトリプシン溶液に5分間さらして細胞を剥離させ、回収します。次に、細胞を300 Gsで3分間遠心分離します。その後、4 mLのPBSで再懸濁し、細胞数を計測します。ボトル1本あたり約45 million cellsが得られるはずです。ラット肝臓ECMを再細胞化するには、6億個の細胞が必要です。ECMを再細胞化するために、まず肝臓灌流チャンバー、灌流システム、培地リザーバー、およびバブルトラップを含むバイオリアクターシステムを構築します。再細胞化の手順には、2つの重要なステップがあります。1つ目は、灌流システム内に気泡が混入しないようにすることです。2つ目は、システム全体を無菌状態に保つことです。まず、バイオリアクターシステムのこれらの構成部品を121 °Cで15分間滅菌します。次に、チューブと滅菌済みの灌流チャンバーに培地を満たします。その後、脱細胞化したラット肝臓スキャフォールドを肝灌流チャンバー内に配置します。次のステップとして、チューブクリップを用いて、カニュレーションした門脈を灌流システムに接続します。次に、バイオリアクターシステムをインキュベーターに入れ、ペリスタルティックポンプに接続します。続いて、添加剤入り培地 150 millilitersを用いて、5日間かけてスキャフォールドを平衡化させます。流量は 1.25 milliliters per minuteに設定してください。5日後、バイオリアクターシステムをポンプから切り離し、無菌フードへ移動させます。肝臓スキャフォールドを培地回路から切り離します。次に、300 million個のHep G2細胞を含む5 mLの培地をシリンジに充填し、気泡が入らないように注意しながら、門脈経由で細胞を注入します。その後、ポンプを停止した状態で、細胞を1時間かけてECMに再定着させます。1時間後、ポンプを1.25 milliliters per minuteで始動させます。10分後、流速を2.5 milliliters per minuteまで上げます。さらに20分後、ポンプを動作速度の3.75 milliliters per minuteに設定します。最大ポンプ速度で30分経過後、ポンプを停止し、さらに3億個の細胞を添加して、細胞がECMに定着するまで1時間放置します。1時間後、前述と同様にポンプ速度を段階的に調整し、徐々に循環速度を上げます。次に、2週間かけて培養液で肝臓を再細胞化させます。1日おきに50 millilitersの培地を交換し、使用済みの培地サンプルから生理学的パラメータを測定してください。AAVベクターの作製は複雑な手順であり、多くのステップが含まれますが、それらはテキストプロトコルに要約されています。このビデオのセクションでは、いくつかの重要なステップを実演します。まず、AAVベクターの作製、精製、および定量を行います。簡潔に説明すると、ローラーボトルを用いてAAVベクターを作製し、ヨジキサノール密度勾配遠心法により精製します。PD10ゲルろ過カラムを用いたろ過により、残留ヨジキサノールを除去します。次に、ゲノムAAV DNAを標準として用い、qPCRによりAAVベクター濃度を測定します。1モデルあたり合計27兆個のAAVベクターが必要です。次に、肝臓モデルに導入を行います。まず、5 mLのPBSに溶解した27 trillion個のベクターをシリンジに充填します。フェノールレッドを5 µg/mLの濃度で添加しても構いません。その後、肝臓を培地回路から切り離し、システムにベクターを注入します。注入後、ポンプを停止させた状態でシステムを1時間インキュベートします。その後、前述の手順に従って徐々に流量を増加させます。その後、導入後の肝臓を6日間にわたってインキュベートし、隔日で培地50 millilitersを交換します。メスを用いて、各肝葉から厚さ約0.5cm、長さ1.5〜2cmのサンプルを切り出します。切り出した切片を、4%パラホルムアルデヒドおよび4%スクロース溶液中で、4°Cで90分間インキュベートします。次に、サンプルをPBSで1回1分間、3回洗浄します。洗浄後、サンプルを8% sucrose溶液中で4°Cにて一晩インキュベートします。翌日、固定剤を入れたクライオモールドにサンプルをロードします。気泡が入らないように注意してください。ロード後、サンプルを固定剤で完全に覆い、-80 °Cで保存します。凍結後、クライオトームを用いてサンプルから10 µmの凍結切片を作成します。必要に応じてサンプルを染色し、再細胞化を確認します。遺伝子発現解析を行う場合は、4 mmの生検パンチを用いてサンプルを採取します。再細胞化を評価するため、凍結切片をヘマトキシリン・エオジン染色しました。導入された2つの肝臓および、再細胞化はされたが導入はされていない1つの対照肝臓からの葉に、すべてHep G2細胞を再定着させた。各肝臓モデルから28箇所のパンチ生検を行い、RNA発現量とベクタータイターを定量化した。導入された2つの肝臓モデルでは、1細胞あたり55および90のベクターゲノムが測定され、これは遺伝子サイレンシングを誘導するのに十分なベクター量である。予想通り、コントロールではゲノムは検出されませんでした。EmGFPの発現をRT-PCRおよびウェスタンブロッティングにより解析しました。その結果、ほとんどの生検検体においてEmGFPのmRNA発現およびタンパク質発現が認められました。凍結切片の免疫染色により、モデルの再細胞化が成功した箇所ではどこでもEmGFPの発現が認められました。これは、AAVによる遺伝子発現が良好であることを示しています。次に、AAVを介したヒトcyclophilin Bのノックダウンを定量RT-PCRにより解析しました。形質導入した2つの肝臓のすべての葉において、ヒトcyclophilin Bの平均ノックダウン率は70%から90%の間でした。本手法の開発により、血管系の整備された三次元臓器システムにおけるウイルスおよびウイルスベクターの分布を研究する道が開かれました。このような研究は、現在の遺伝子導入技術の改善や、新たな抗ウイルス戦略の開発に寄与すると考えられます。

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ヒト細胞株を用いた肝臓器官形成のモデリング、アッサンブロイドの構築、合成組織の設計のためのin vitro培養技術

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