ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

この手順の全体的な目標は、ウイルスとウイルスベクターを研究するための3次元肝臓モデルを開発することです。この方法により、マウスまたはラットモデルのげっ歯類細胞とは生理機能が異なるヒト細胞を用いた血管新生三次元系における生物学的プロセスの研究が可能になります。さらに、生きた動物での実験を回避し、長期的には動物の構成要素を完全に置き換えることを目的としているため、動物福祉を改善するための一歩です。

この手法は、遺伝子導入のためのウイルスベクターの研究のために開発されましたが、感染性バイタルウイルスの研究や、がん研究などの他の研究分野にも応用できます。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるViola Rohrsです。動物福祉のために、本研究では余剰動物のみを使用し、他の動物実験のために犠牲にしました、つまり

、肝臓の足場を得るために追加の動物は必要ありませんでした。まず、肝細胞株Hep G2を増殖させます。10%のウシ胎児血清と2ミリモルのグラチン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含む培地30ミリリットルのT175ボトルに1,500万個の細胞を播種します。4日間の培養後、培養条件でトリプシン溶液を5分間曝露して細胞をほぐし、収穫します。

その後、細胞を300Gで3分間スピンダウンします。次に、それらを4ミリリットルのPBSに再懸濁し、細胞数を取得します。各ボトルからは約4,500万個の細胞が得られるはずです。

ラットの肝臓ECMを再細胞化するには、6億個の細胞が必要です。ECMを再細胞化するには、まず、肝臓増殖チャンバー、増殖システム、培地のリザーバー、およびバブルトラップを含むバイオリアクターシステムを設定します。再細胞化の手順には、2つの重要なステップがあります。

1つは、プロフュージョンシステムに気泡が閉じ込められないようにすることです。2つ目は、システム全体を無菌状態に保つ必要があるということです。まず、バイオリアクターシステムのこれらのコンポーネントを摂氏121度で15分間滅菌します。

次に、チューブと滅菌された増殖チャンバーに培地を充填します。次に、脱細胞化したラットの肝臓の足場を肝臓増殖チャンバーに入れます。次のステップは、チューブクリップを使用して、カニューレ挿入された門脈をプロフュージョンシステムに接続することです。

次に、バイオリアクターシステムをインキュベーターにセットし、蠕動ポンプに接続します。次に、150ミリリットルのサプリメント入り培地で5日間にわたって足場を平衡化します。流量を毎分1.25ミリリットルに設定します。

5日後、バイオリアクターシステムをポンプから外し、滅菌フードに移します。肝臓の足場をメディア回路から外します。次に、3億個のHep G2細胞を含む5ミリリットルの培地をシリンジにセットし、気泡の形成を避けて門脈を介して細胞を注入します。

その後、ポンプを運転せずに細胞をECMに再充填するのを1時間待ちます。1時間後、ポンプを毎分1.25ミリリットルで始動します。10分後、圧力を毎分2.5ミリリットルに上げます。

さらに20分後、ポンプを毎分3.75ミリリットルの動作速度に設定します。ポンプをフルスピードで30分後、ポンプをオフにし、さらに3億個の細胞を追加し、細胞をECMに1時間増殖させます。1時間後、以前と同様にポンプ速度を段階的に調整することにより、循環を徐々に増やします。

次に、培養物に2週間かけて肝臓を再細胞化させます。一日おきに、50ミリリットルの培地を交換し、使用した培地のサンプルから生理学的パラメータを測定します。AAVベクトルの作成は、テキストプロトコルに要約されている多くのステップを含む複雑な手順です。

ビデオのこのセクションでは、重要な手順の一部を示します。まず、AAVベクターを作製、精製、定量します。AAVベクターをローラーボトルで簡単に作製し、ヨージキサノール勾配遠心分離で精製します。

PD10ゲルろ過カラムでろ過することにより、残留ヨージキサノールを除去します。次に、ゲノムAAV DNAを標準として、QPCRによりAAVベクター濃度を決定します。モデルごとに合計 27 兆個の AAV ベクトルが必要です。

次に、肝臓モデルを形質導入します。まず、注射器に5ミリリットルのPBSを装填した27兆個のベクターを取得します。フェノールレッドは、ミリリットルあたり5マイクログラムで添加できます。

次に、肝臓を培地回路から切断し、ベクターをシステムに注入します。注入したら、ポンピングせずにシステムを1時間インキュベートします。次に、前述のように流量を徐々に増やします。

その後、形質導入された肝臓を6日間にわたってインキュベートするので、1日おきに培地を50ミリリットル交換します。メスを使用して、各肝葉から厚さ約50センチメートル、長さ1.5〜2センチのサンプルをスライスします。スライスを4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースで4°Cで90分間インキュベートします。

その後、サンプルをPBSで3回、1回の洗浄につき1分間洗浄します。洗浄後、サンプルを8%スクロースで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを固定媒体を含むクライオモールドにロードします。

気泡の持ち込みを避けてください。ロードしたら、サンプルを固定用メディウムで完全に覆い、摂氏マイナス80度に置きます。凍結したら、クライオトームを使用してサンプルから10ミクロンのクライオ切片を調製します。

必要に応じてサンプルを染色し、再細胞化を確認します。遺伝子発現解析には、4mm生検パンチを用いてサンプルを採取します。再細胞化を評価するために、凍結切片をヘマトキシリンとエオシンで染色しました。

形質導入された2つの肝臓と、再細胞化されているが形質導入されていない1つの対照肝臓からの葉は、すべてHep G2細胞で再増殖されました。RNA発現とベクター力価は、各肝臓モデルからの28回のパンチ生検から定量化されました。2つの形質導入肝臓モデルでは、細胞あたり55および90のベクターゲノムが測定されましたが、これは遺伝子サイレンシングを誘導するのに十分なベクターです。

予想通り、対照群ではゲノムは測定されませんでした。EmGFPの発現をRT-PCRとウェスタンブロッティングで解析しました。ほとんどの生検では、EmGFPのmRNA発現とEmGFPのタンパク質発現が示されました。

クライオ切片の免疫固定により、モデルの再細胞化が成功した場所ではどこでも、EmGFPの発現も見られることが示されました。これは、AAV遺伝子の発現が良好であることを示しています。次に、AAVを介したヒトシクロフィリンBのノックダウンを定量的RT-PCRで解析した。

ヒトシクロフィリンBの平均ノックダウンは、形質導入された2つの肝臓の全葉で70〜90%でした。開発後、この技術は、研究者が血管新生の三次元臓器系におけるウイルスとウイルスベクターの分布を研究する道を開きました。このような研究は、現在の遺伝子導入技術を改善し、新しい抗ウイルス戦略の開発に役立つでしょう。