Name: 経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶマウス腸内細菌叢のqPCRによる定量解析法。経口抗生物質投与後の細菌量変化を測定し、微生物叢異常関連疾患の研究に有用です。体重減少を最小限に抑える投与方法も含みます。

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この作品は、英国の医学研究評議会 (グラント P.B. 氏/L008157/1); によって賄われていたR. j. に支えられたマリー キュリー Intra-European フェローシップ (H2020-MSCA-IF-2015-703639);P.M.B。 英国医学研究評議会とキングス カレッジ ロンドン博士研修パートナーシップ ナカオ (氏/N013700/1) から就労によって支えられました。

ここで説明した実験は、6-8 週間特定病原体無料 (SPF) 施設で維持される古い野生型 (C57BL6/J) マウスを使用して行った。すべての動物実験は、College ロンドン王のとフランシス Crick 研究所動物福祉と倫理的なレビュー体とイギリス内務省によって承認されました。任意の動物の手順を開始する前に、適切なアクセス許可がローカルの機関を通じて得られることを確認します。
1. 抗生剤の投与
注: 抗生物質治療の 2 つの代替方法があります: 経口 (ステップ 1.1)、飲料水 (ステップ 1.2) 経由で抗生剤の投与。
<ol><li>経口<ol>
<li>次の濃度でオートクレーブ養生水にそれらを溶解することにより個々 の抗生物質の在庫を準備: アンピシリン 100 mg/mL で、100 mg/mL でゲンタマイシン、ネオマイシン 100 mg/mL で、10 mg/mL にメトロニダゾールと 100 mg/mL でバンコマイシン。フィルターは、0.45 μ m のフィルターを使用して滅菌します。因数と-20 ° C にてストア</li>
		<li>抗生物質のカクテルを準備するには、上記準備株式を混合します。1 mL のボリュームのアンピシリン (5 mg/mL 最終) の 50 μ L、ゲンタマイシン (5 mg/mL 最終) の 50 μ L、ネオマイシン (5 mg/mL 最終) の 50 μ L、メトロニダゾール (5 mg/mL 最終) を 500 μ l 添加、バンコマイシン (2.5 mg/mL 最終) の 25 μ L、325 μ L の水を混ぜます。使用する前に新鮮なカクテルを準備します。</li>
		<li>1 mL の滅菌注射器に抗生物質のミックスを読み込み、任意の気泡を除去しながら適切なゲージ強制経口投与針 (15-20 g のマウス用 20 G) を修正します。</li>
		<li>強制経口投与マウス抗生物質ミックスを 200 μ l 添加します。<ol>
<li>マウスの肩越しに皮膚をしっかりとつかむ、頭頸部、食道をまっすぐに伸ばします。口と咽頭の後方の屋根に沿って餌針の先端球を直接します。軽く食道に伝承し、200 μ L 溶液を注入します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>実験の期間中毎日抗生物質カクテル 1 回を管理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>飲料水の抗生物質 注意: 慎重にマウスの重量を毎日監視飲料水の抗菌薬投与の最初の 2 週間のため。<ol>
<li>オートクレーブ水 1 リットルで次を溶解することにより抗生物質のカクテルを準備: アンピシリン (1 g/L 最終)、ネオマイシン (1 g/L 最終)、メトロニダゾール (1 g/L 最終)、バンコマイシン (0.5 g/L 最終) と人工の 8 袋 (0.75 g) の 0.5 グラムの 1 グラムの 1 グラムの 1 グラム甘味料 (60 g/L 最終)。溶解するまで横に振る。4 ° C でのストア 注: 甘味料は、抗生物質の味を非表示し、マウスの脱水を防ぐために追加されます。甘味料のいくつかのブランドを動作可能性があります、必要な最終濃度各特定ブランドの異なるかもしれません。</li>
		<li>水のボトルに抗生物質カクテルを埋める (~ 100 mL/ボトル) マウス ケージにボトルを置くと。 注: は、茶色のボトルを使用または抗生物質を光から保護するために箔のボトルをカバーします。</li>
		<li>実験の期間週 2 回新鮮な在庫で抗生物質カクテルを置き換えます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 糞便スツール、回腸のコンテンツ、および回腸壁からの収集
<ol><li>重量を量るし、ラベルを 2 mL サンプル コレクションのオートクレーブのチューブ。</li>
	<li>新鮮な糞便のコレクションの落に各マウスを配置し、コレクション チューブで肛門から直接糞を収集します。 注: サンプルは、きれいなオートクレーブのケージにマウスを置き、クリーンな滅菌ピンセットで便のサンプルを収集も入手できます。</li>
	<li>頚部転位続いて CO2窒息とマウスを安楽死させます。</li>
	<li>完全にさらされる腹部とマウスの死骸を置く、70% エタノールで腹部をスプレーします。</li>
	<li>滅菌ピンセットとはさみを使って、任意の内部の組織を傷つけることがなく、腹膜を公開する腹部横切開を作る。腹膜を持ち上げて、切開、腸を公開します。</li>
	<li>鉗子、はさみ (胃大腸) から腸を取り出し、滅菌シャーレに置きます。</li>
	<li>腸間膜動脈と脂肪から鉗子を使用して小腸 (SI) 慎重に。腸を拡張し、きれいな研究室ワイプの上に置きます。</li>
	<li>定規で測定し、SI (盲腸に近い部分) の回腸遠位部の 4 cm カットします。カットし、盲腸に近位小腸の 1 cm を破棄します。回腸の腸内細菌を収集するために使用される左の 3 cm 部分があります。</li>
	<li>2 mL の生殖不能の管に回腸部分 (3 cm) を保持します。腸および補綴チューブにサンプルを直接押し出して腸内容を収集します。このサンプルは、回腸内容から菌を持っています。</li>
	<li>冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 20 mL の注射器を準備し、回腸部分 (流れを破棄) をフラッシュします。</li>
	<li>きれいなペーパー タオルの上に回腸部分を置き、縦はさみでそれを開きます。</li>
	<li>メスと回腸壁の内側をこすり。</li>
	<li>きれいな遠心管に 1 mL の PBS とメスを洗浄することによりメスの任意の細菌を収集します。8,000 × gペレット細菌、上澄みを廃棄し 5 分で回転します。このサンプルは、回腸の壁から細菌を含まれます。 注: 糞便スツール、回腸内容、壁からすることができます凍結し、使用まで-80 ° C で保存します。</li>
	<li>スツールと回腸のコンテンツからのサンプルを含んでいる管の重さし、各サンプルの糞便の重量を取得する (手順 2.1) から空のチューブから重さを引きます。</li>
	<li>スツール、回腸内容、市販のキットを使用して回腸壁サンプルから DNA を抽出します。使用するまで-20 ° c の DNA のサンプルを格納します。</li>
</ol>3. qPCR による腸内細菌叢の定量化
注: この手順を含む標準 (ステップ 3.1) の生成と qPCR セットアップ標準と糞便のサンプル (ステップ 3.2) のためのメソッド
<ol><li>QPCR の標準の生成<ol>
<li>試薬13および表 1に詳細な PCR の状態を使用して細菌文化から抽出したゲノム DNA からの 16S rRNA 遺伝子を増幅するポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用します。</li>
		<li>1.5% の agarose のゲルの PCR の製品を実行し、市販 DNA 抽出キットを使用して DNA バンドを浄化します。</li>
		<li>精製 DNA のフラグメントを使用してクローニング キット (材料表、抗生物質耐性マーカーと青/白の植民地選択のための β-ガラクトシダーゼ (LacZ) 遺伝子融合を含むベクターを使用を参照してください) を縛る DH10 の有能なを変換して大腸菌製造元の指示に従います。アンピシリンに変換プレート (100 μ g/mL) X ギャル (20 μ g/mL) ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天 (10 g/L トリプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、寒天 15 g/L の 10 g/L を 5 g/L)。インキュベート 37 ° C で一晩 (O/N)</li>
		<li>プレートから 1 つの陽性 (ホワイト) コロニーを選択します。100 μ g/mL アンピシリンを含む 5 mL LB 培地に接種して 37 ° C, 250 rpm で揺れで O/N を孵化させなさい。</li>
		<li>O/N 文化から隔離し、製造元の指示に従って商業 miniprep のキットを使用してプラスミッドの浄化します。 注: この段階で、プラスミッドに 16S rRNA 遺伝子のコピーを 1 つだけが含まれていることを確保し、塩基対 (bp) にその長さを決定するプラスミッド挿入をシーケンスすることが重要です。</li>
		<li>一度だけプラスミッドを切る制限の酵素が付いているプラスミッドをリニア化します。</li>
		<li>市販のキットを使用して線形プラスミッドを浄化します。</li>
		<li>260 で吸光度を測定することによってプラスミッドの濃度を決定する nm の吸光度。</li>
		<li>プラスミッドのコピー/μ L14次の数式を使用して、サンプルの数を計算します。 コピーの数= (量* 6.022 × 1023)/(長さ* 1 × 109 * 650) 3.1.8 の手順 (ng/μ L); で得られた DNA 濃度の量が長さbp (挿入) が付いているプラスミッドの長さの合計です。コピー/μ L とコピーの数を取得します。 注: 上記の数式に基づいてオンライン ツールでプラスミッドのコピーの数の簡単な計算を可能にするがあります。</li>
		<li>因数とストア-20 ° C で使用されるまで必要に応じて標準。</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR 標準および糞便サンプルのセットアップ<ol>
<li>QPCR (ステップ 3.1.10) から標準、糞便検体 DNA (ステップ 2.15) と氷 (から市販キット) qPCR 試薬を解凍します。 注: この例で使用する qPCR 試薬には SYBR グリーン qPCR 反応混合物および前方および逆のプライマー (表 2) が含まれます。</li>
		<li>10 からの範囲で滅菌 DNA 無料水の標準を希釈7 102コピー/μ L (10 からシリアル希薄など1/57 102コピー/μ L x 6.4)。希釈糞便サンプルの DNA を 1/2、1/5、1/10.
</li>
		<li>反応プラス 1 (表 2) の総数のためのマスターの組合せの反応を確認します。</li>
		<li>マスター ミックスとテンプレート (標準、サンプルまたは否定的な制御のための水) の 5 μ L のミックス 30 μ L</li>
		<li>384 ウェル光 qPCR プレートの各ウェルに、このミックスの 10 μ L を追加します。3 通の各反応を実行します。</li>
		<li>QPCR 場所をシール、簡潔に遠心し、次のサイクリング条件でプログラム qPCR マシンでプレートを読み込む: 95 ° C、20 分が 95 ° C の 40 のサイクルが続く 15 秒/1 分の 60 ° C。</li>
		<li>CT標準とサンプルの値を取得します。</li>
		<li>(3.1.9 のステップで計算される) としてプラスミッドのコピー数の対数対基準 CTの値をプロットすることによって標準的な曲線を生成します。標準曲線の直系の回帰を実行します。</li>
		<li>CT値 (3.2.2 の手順で得られた) 標準的な曲線で補間することによって糞便の 16S rDNA のコピー数を計算します。 注: 各サンプルの 16S rDNA のコピー番号が修正されるべき (3.2.2 の手順で準備)、サンプルの希釈倍率を考慮した (ステップ 2.15) に溶出した最終巻核酸および糞便サンプル (の計算ステップ 2.14) を取得する数糞便のグラムあたり遺伝子をコピーします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Hand, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+microbiota+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Role of the microbiota in immunity and inflammation.</a> Cell. 157 (1), 121-141 (2014).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで提供実験プロトコル抗生物質の経口投与のマウスおよび糞便細菌の定量化する qPCR による。抗生物質の組み合わせは、両方のグラム陽性およびグラム陰性の細菌、細菌の完全なスペクトルに対する殺菌活性を提供するこのプロトコル (アンピシリン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール バンコマイシンを含む) ターゲットで使用。糞便細菌が大幅減少経口と飲料水の抗生剤の投与5,6,12をロードします。また、どちらの治療法があるマウスの表現型に大きな影響を与える減らされた脾臓のサイズ拡大盲腸など無菌マウスの典型的ないくつかの特徴を開発する際経口法より労働集約的、多分に不快感を引き起こして、抗生物質の投与が必要です特定抗菌薬投与法の選択のおそらく、実験の長さに依存可能性があります、長期的に動物。
飲料水の抗生剤の投与、脱水からマウスを保つために重要な要因は時に抗生物質の混合甘味料添加による注意を取られなければなりません。いくつかのグループは、飲料水 (甘味料添加) なしで抗生剤の投与はすべてマウス実験5の最初の数日以内に最初の体重の 20% 以上を失うと非常に厳しい、急激な体重減少につながる方法を示しています。,6プロトコル、サッカリン系甘味料の使用マスクの水と抗生物質投与後の最初の数日間の重量を失ったマウスで抗生物質の味に十分であるように見えたがその (後すぐにその重みを回復した。図 1)。それにもかかわらず、私たちの実験ではマウスの 5-10% まだ到達の人間エンドポイント > ベースラインの 20% の損失の体重、安楽死に必要な。我々 はまたマウスの脱水を防ぐために完全に失敗したスクラロース ベースの甘味料をテスト (失われたマウスの 100% > 重量の 20%) 一方、他の著者は、甘味料のアスパルテーム ベース5,6と同様の障害を公開しています。これに加え、年齢、遺伝的背景、実験用マウスの一般的な健康状態がある、抗生物質治療中に減量と動物の福利に影響可能性があります彼らとします。したがって、マウス重量および全身状態を注意深く監視は経口抗菌薬投与の最初の 2 週間の間に毎日実行する必要があります。
qPCR メソッドは、糞便の 16S rRNA の定量化のための高速かつコスト効率の高いアプローチを提供します。ただし、いくつかの制限に配慮すべきこの技術を含む: 私) 信頼性の高い高品質規格の要件ii) 設計と qPCR のプライマーの効率iii) 微生物が 16S rRNA 遺伝子のコピー数があるという事実、従って遺伝子コピー可能性があります直接等しくないセル数15。それにもかかわらず、qPCR糞便試料の迅速な分析を可能にする堅牢な敏感な方法です。このメソッドは、便利詳細こことして様々 な治療法の (抗生物質を含む) の糞便細菌負荷の効果を迅速に検証できます。さらに、合計16 の定量化のプロトコルを提供して我々 が rRNA、このメソッドことができます簡単に適応する (特異的プライマー16の設計) によってこのように量的の両方を提供する個々 の細菌種の同定を有効にしてマイクロバイ サイズと組成に関する定性的情報。
要約すると、マウスの糞便細菌の抗生物質による変化を定量化する qPCR 法経口抗生物質による治療の 2 つのプロトコルを実施しています。彼らがマウスの腸内細菌叢を操作し、効果の研究、費用効果の高い迅速かつ信頼性の高いツールとして役立つかもしれないが、これらのプロトコルは、さらに最適化し、個々 の実験のニーズによると他の方法と組み合わせることができます、腸内の恒常性と病抗生物質による治療。

哺乳類の消化管粘膜は、ホストと相利共生の関係を確立する微生物の非常に複雑な混合物によって植民地化されたユニークな環境です。腸の粘膜の防衛システムでは、上皮層とその数と多様性を維持しながら腸内共生生物を制限する免疫細胞の茄多を装備されています。逆に、共生生物が完全に機能する免疫システムの開発のため必要です。ホストと共生細菌間の相互作用は通常有益なその調節不全免疫微生物叢のクロストークは、慢性の炎症性疾患は、このような asinflammatory 腸の開発を支持できることますます明確になっています。疾患、関節リウマチや喘息1,2。
腸内細菌は様々 な要因によって変更できますが、おそらく最も抜本的な変更は、サイズと細菌群集3,4の組成を変更する深刻な抗生物質による治療によって引き起こされます。感染症を治療するための抗生物質の効果は疑わしい、ヒトにおける抗菌薬曝露による微生物叢変化は健康に有害な影響につながることができる免疫防御も変更できます。例えば、ヒトの抗生物質治療は、クロストリジウム ・ ディフィシルのリスクの増加にリンクされている-下痢、喘息、癌3の特定の種類を誘発します。マウスで抗生物質による治療は、影響と抗生物質治療患者の腸地域の長期的な変化を繰り返すし、微生物群集の変化と免疫機能のメカニズムのリンクの調査をなっています。しかし、いくつかのレポートは、マウスを控えるその不快な味5,6によると思われる水を飲むように飲料水広告自由に抗生剤の投与が非常に顕著な体重減少の結果、示されています。したがって、これらのモデルで重度の脱水症の抗生物質内服を併用が免疫細胞機能の抗生物質による治療の効果を識別することを目指して実験の解釈を複雑になります。
サイズと腸内コンパートメント7における微生物群集の組成を探索するいくつかのアプローチを使用できます。次世代シーケンス テクノロジーはしかし、これらのメソッドは比較的高価なこの問題は8、非常に貴重なデータを提供しているし、データの解釈の専門家情報の解析を必要とします。その一方で、伝統的な微生物培養菌種の検出を許可する彼らは低感度を持っている、共生細菌 (特に嫌気性菌) の大部分は非常に困難または不可能で育成するには現在利用可能なメソッドの8。総微生物負荷の高速かつ信頼性の高いカルチャに依存しない測定を提供するよう、定量化と糞便の細菌種の同定のますますの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 技術を使用されています。したがって、qPCR 法は年齢または炎症性腸疾患9,10を含むいくつかの疾患の進行に関連付けられた microbiota の変化の研究に有用証明しました。これに伴い、qPCR メソッドは、糞便の細菌負荷と細菌叢構成10、11,12(抗生物質を含む) さまざまな治療の効果を検証するための高速かつコスト効果の高いアプローチを提供します。
ここでは、qPCR によるマウス、糞便検体の採取、DNA 抽出、基準の作成と糞便中の細菌の定量化に経口抗生物質投与の 2 つの異なるプロトコルの詳細なステップのアカウントを提案します。これらのプロトコルは、マウスの腸内細菌叢を操作し、腸管の恒常性と病で抗生物質による治療の効果の研究の信頼性の高い方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>ネオマイクニン三硫酸塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>N1876</td><td></td></tr><tr><td>メトロニダゾール</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>バンコマイシン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>V2002</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich(メルク)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma-Aldrich (メルク)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>甘味料 Sweet'n Low Sweet'N</td><td>Low</td><td></td> 英国<td>で入手可能な</td></tr><tr><td>Amazon.co.uk X-Gal (5-ブロム-4-クロロ-3-インドイル B-D-ガラクトピラノシド)</td><td>フィッシャー科学</td><td>10234923</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>超高純度アガロース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCRグレードの水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液ミックス</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>with ROX</td></tr><tr><td>TOPO TA cloningTM for sequencing</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Invitrogen)</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp fast DNA Stool mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン Miniprep キット</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel&nbsp; 抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター 0.45 & マイクロ;m</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・イ10460031</td><td></td></tr><tr><td>スワン・モートンTM 炭素鋼滅菌メス刃</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>・サイエンティフィック・11792724</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (20 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL クリスタルクリア・マイクロ遠心チューブ</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 超高回収マイクロ遠心チューブ</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>経口投与針 20 G x 38 mm 湾曲 (pk/3)</td><td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>ステリリン ペトリ皿 50 mm&nbsp;</td><td>科学研究所用品</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>アブソリュートqPCRプレートシール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM光学式384ウェルプレート&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Applied Biosystems)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7TM 7 リアルタイム PCR システム、384 ウェルブロック付き</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Applied Biosystems)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 (Nanodrop 1000)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prism 微量遠心分離機</td><td>Labnet</td><td>C2500</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax サーマルサイクラー</td><td>ラブネット</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

腸内細菌は、人間の健康に中央影響を及ぼします。微生物 dysbiosis は炎症性腸疾患、喘息、関節炎などの多くの一般的な immunopathologies に関連付けられます。したがって、内細菌叢と免疫系のクロストーク機構の解明は、非常に重要です。病原体のクリアランスを支援しながら、抗菌薬の投与は、サイズと人間の健康に影響を持つことができる腸の細菌群集組成の急激な変化を誘導します。マウスで抗生物質による治療は影響と抗生物質の治療を受けた患者から人間の微生物叢の長期的変化を繰り返すし、微生物群集の変化と免疫機能のメカニズムのリンクの調査を実行できます。マウスの抗生物質治療のいくつかの方法が記載されている間それらのいくつかは重度の脱水とデータの解釈を複雑に減量を誘発します。ここでは、主要な減量を引き起こすことがなくマウスの長期の治療に使用できる経口抗菌薬投与の 2 つのプロトコルを提供します。これらのプロトコルは細菌をグラム陽性およびグラム陰性の両方を対象の抗生物質の組み合わせを使用していずれかの自由水を飲むのか、経口投与によるを提供することができます。また、抗生物質による治療の有効性を検証する使用ことができます qPCR による糞便における微生物密度の定量法について述べる.これらのアプローチの組み合わせは、腸内細菌叢の操作とマウスで抗生物質による治療の効果に関する研究の信頼性の高い手法を提供します。

ここでマウスの経口抗生物質による治療の 2 つの代わりとなる議定書を提供します。図 1は、経口 (赤) または飲料水 (青) でも、連続 10 日間の抗生物質を投与したマウスの体重 (それぞれの動物の元のベース ライン重量に関連) の割合を示します。顕著な体重減少が見つかりません抗生物質を受信マウスの経口投与による。しかし、マウスは、飲料水の抗生物質自由で扱われている、彼らは体重 (~ 10%) 抗菌薬投与の最初の数日以内、通常体重の増加はその後 (図 1) を回復します。それにもかかわらず、周りで飲料水の抗生物質を受信マウスの 5-10% に達することができる &gt; 20% 減量、治療の最初の週の内で彼らが安楽死させた場合。
糞便中の細菌の定量化には、qPCR (ステップ 3.2.7) から得られた CT値対 (3.2.2 のステップで計算される) として標準のコピー数のログをプロットすることによって得られる十分な標準的な曲線が必要です。図 2 aは R2値が 0.99827、-3.09 かつ効率の斜面の標準曲線のパフォーマンス基準を満たしている標準曲線から代表的な例を示しています ((-1 + 110% の 10^(-1/slope))*100)。0.99 と PCR 効率 90 ~ 110% の範囲内での R の2 つの値が優先されます。線形範囲内回帰分析により、糞便内 16S rDNA の豊かさの定量化。図 2 bは、糞便スツール、SI 量と SI 壁の 16S rDNA のコピーの数を示しています。図 2 bに 16S rDNA のコピー/g 糞便スツールと si 含有量の糞便サンプルのデータが表示されます。SI 壁データは 16S rDNA コピー (開始材料の量が小さすぎるため、正確な重量を得る)、SI の壁の 3 cm から回復した細菌から得られた数の合計として表示されます。
糞便中の細菌の密度に及ぼす抗生物質の影響を評価するマウスを施した抗生物質経口投与による毎日 10 日間 (1 に 10 日間) (0 日目) 前に便を採取したと抗生物質による治療 (中に別の時点で日 5、10)、7 日 (1 日 17; 抗生物質投与を停止した後、図 3 a)。抗生物質による治療が 16S rDNA のコピー/日 5 と 10、1 週間後 (前処理に匹敵する) 通常のレベルに回復した糞便中の細菌の密度間に検出された糞便の g 数の強い減少を誘導する図 3Bのように、抗菌薬投与 (17 日目) が停止されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg"> 図 1: 抗生物質の管理。マウス経口 (赤) または連続 10 日間の飲用水 (青) の抗生物質を受信しました。プロットは、抗生物質投与 (0 日) 前に、の元の重量を基準にして実験の全期間にわたってマウスの重量を示しています。データは、平均 ± SEM. として表示されます<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg"> 図 2: 標準および糞便の 16S rRNA 遺伝子 qPCR 増幅します。(A) 標準曲線記述子の標準曲線の線形回帰。(B) 糞便サンプルから遺伝子組成の計算。データは、平均 ± SEM. として表示されます<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg"> 図 3: 糞便細菌抗生物質治療中です。経口 (Ab) とで描かれているサンプル コレクションによる抗生物質投与スケジュールの (A) 回路図 *。(B) 16S rDNA 指定された日に採取したマウスから糞便での糞便のグラムあたりのコピーします。データは、平均 ± SEM. として表示されます<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>ボリューム</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>8 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>バッファー 10 X</td>
			<td>2 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>0.4 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>真正細菌 - F プライマー (10 mM)</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>真正細菌 - R プライマー (10 mM)</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq Polimerase</td>
			<td>0.2 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>7.4 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>総容積</td>
			<td>20 Μ L</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマー シーケンス</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>真正細菌 - F プライマー</td>
			<td>5 ' 3' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>真正細菌 - R プライマー</td>
			<td>5 ' 3' ATTACCGCGGCTGCTGGC</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>サイクリング条件</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>5 分</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 倍</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 倍</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>1 分</td>
			<td>30 倍</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>5 分</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: PCR 試薬及び条件。このテーブルは、試薬と qPCR 法で使用する標準の生成のための細菌文化からの 16S rRNA 遺伝子を増幅する PCR サイクリング条件を提供します。プライマー シーケンスが Kruglovらによって初めて公開されました。13。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>ボリューム</td>
		</tr>
<tr>
<td>SYBR グリーン マスター ミックス (2 x)</td>
			<td>17.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>真正細菌 - F プライマー (10 mM)</td>
			<td>0.7 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>真正細菌 - R プライマー (10 mM)</td>
			<td>0.7 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>11.1 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: qPCR マスター ミックス。(最終巻 35 μ L) を示されているボリュームは、qPCR 384 ウェル プレート (5 μ L 分注エラーのための余分のための会計) で 3 通 (各 10 μ L) 上で実行する 1 つのサンプルです。量は、分析するサンプルの数によるとスケール アップがあります。

ここに提供いたします詳しいプロトコル抗生物質の経口投与のマウス、糞便、DNA の抽出および糞便細菌の数量のコレクション qPCR による。

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

本プロトコルは、経口抗生物質投与後のマウスの腸内微生物叢である変化を定量する信頼できる方法を提供する。これは、炎症性腸疾患などの微生物異生症に関連する病理の洞察を提供するクロス微生物叢相互作用の研究に役立ちます。これらの抗生物質治療体制の主な利点は、通常マウスへの経口抗生物質投与に関連する特徴的な体重減少を防ぐことである。経口ギャバジを介して抗生物質治療をプリフォームするには、技術プロトコルに記載されているように準備されたストック溶液を混合することによって抗生物質のカクテルを準備する。50マイクロリットルのアンピシリン、50マイクロリットルのゲンタマイシン、50マイクロリットルのネオマイシン、メトロニダゾール500マイクロリットル、バンコマイシン25マイクロリットル、325マイクロリットルの水をミリリットル混合する体積の場合。任意の泡を排除しながら、1ミリリットルの注射器に抗生物質ミックスをロードし、適切なゲージガベージ針を取り付けます。しっかりとマウスの肩の上に皮膚をつかみ、食道をまっすぐにするために頭と首を伸ばします。口の屋根に沿って咽頭の後ろに向かって、給餌針のボール先端を向けます。その後、穏やかに食道にそれを渡し、溶液の200マイクロリットルを注入します。実験期間中、抗生物質カクテルを1日1回投与します。または、飲料水を介して抗生物質を投与するには、技術プロトコルに記載されているように抗生物質のカクテルを準備します。これはマウスの脱水を防ぐための重要な要因であるため、抗生物質混合物に甘味料を含めることが重要です。抗生物質カクテルをボトル1本につき約100ミリリットルの水筒に充填します。ボトルを光から保護し、マウスケージに入れます。実験期間中、抗生物質カクテルを週に2回新鮮なストックに置き換えます。マウスの体重と一般的な健康状態の注意深いモニタリングは、抗生物質投与を通じて毎日事前に形成されるべきである。サンプルコレクション用に2ミリリットルオートクレーブチューブの重量を量り、ラベルを付けます。新鮮な便サンプルの収集のために、各マウスを抑制剤に置きます。次に、コレクションチューブ内のアヌスから直接便ペレットを収集します。技術プロトコルに記載されているように安楽死を行った後、腹部を完全に露出させたマウスの死体を置き、70%エタノールで腹部領域をスプレーします。殺菌された鉗子およびはさみを使用して、腹部の横断切開を行い、内部組織を損傷することなく腹膜を露出させる。腹膜を持ち上げ、切開して腸を露出させる。鉗子とはさみで腸を取り除き、滅菌ペトリ皿に入れます。慎重に腸間膜動脈や脂肪から離れて小腸をいじめるために鉗子を使用してください。腸を伸ばし、きれいな実験室のワイプの上に置きます。定規の尺度で、小腸の遠位回腸の4センチメートルを切断します。腸の1センチメートルを切断し、盲腸に近い。腸内細菌を収集するために使用されるイリウムの3センチメートルの部分が残されます。2ミリリットルの滅菌チューブの上に回腸部分を保持します。直接腸を押し出し、チューブ内のサンプルを収集することによって腸の内容を収集します。このサンプルは、回腸含有量からの細菌を有するであろう。冷たいリン酸緩衝生理食塩水で20ミリリットルのシリンジを調製し、流れを捨てる回腸部分を洗い流します。滅菌ペトリ皿の上に回腸部分を置き、ハサミで縦に開きます。メスで回腸壁の内側を削ります。きれいな遠心分離管の上にPBSの1ミリリットルでそれを洗浄することによってメスに任意の細菌を収集します。細菌をペレットにするために5分間Gの8000倍で回転する。遠心分離後、上清を捨てる。このサンプルには、回腸壁からの細菌が含まれます。便および回腸からのサンプルを含む管を秤量する。空のチューブから重量を引いて、各サンプルの便の重量を求める。市販キットを使用して、便、イリウム含量、およびイリウム壁サンプルから細菌DNAを抽出します。使用するまで、DNAサンプルをマイナス20°Cで保存します。氷上で市販のキットからqPCR標準、フェカルサンプルDNAおよびqPCR試薬を解凍します。滅菌DNAフリーウォーターの標準を10から7〜10の範囲で希釈し、マイクロリットル当たり2部にします。フェカルサンプルDNAを半分、5分の1、10分の1の濃度に希釈します。その後、反応の合計数に1を加えたマスターミックス反応を行います。30マイクロリットルのマスターミックスとテンプレートの5マイクロリットルを混合し、これは、ネガティブコントロールのための標準、サンプルまたは水のいずれかである。次に、この混合物の10マイクロリットルを384ウェル光学qPCRプレートに各ウェルに加えます。各反応を三重で行います。qPCRプレートと遠心分離機を短時間シールします。次に、技術プロトコルに記載されているとおりにプログラムされている qPCR マシンにプレートをロードします。最後に、標準とサンプルのサイクルしきい値を取得してから、フェカルサンプルの16S rDNAコピー番号を計算します。代表的な結果は、経口ギャージまたは飲料水を介して抗生物質を投与した後のマウスにおける体重減少を示す。経口ギャージによって抗生物質を受けるマウスでは顕著な体重減少は検出されない。マウスが飲料水中の抗生物質で治療されると、治療の最初の数日以内に体重の約10%が緩むが、その後正常な体重増加を回復する。便サンプル中の細菌の定量化には、qPCRで得られたC-T値に対して標準のコピー数の対数をプロットすることによって得られる標準曲線を使用する必要があります。線形範囲内では、回帰分析式により、フェカルサンプル内の16S rDNA量の定量が可能になります。便、小腸の内容および小腸壁試料についてここに示すように。経口抗生物質投与の5日または10日後には、抗生物質処理マウス由来の便サンプル中の細菌の密度が強く低下する。しかし、抗生物質投与が停止した1週間後に正常なレベルに回復したフェース中の細菌の密度。経口のギャバジと飲料水中の抗生物質の投与は、治療されたマウスの便細菌負荷を短時間減少させる。治療期間などの要因を考慮して、実験要件により適した個々の方法を選択する研究者。細菌の定量のためのqPCR法は、特定のプライマーを使用して個々の細菌分類を定量するために変更することができます。これは、マイクロバイオームのサイズと組成に関する定量的および質的な情報の両方を提供します。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Lo, B. C. ほか慢性サルモネラ感染による腸線維症。 J. Vis. Exp.

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非炎症条件下でのマウス pks+大腸菌 の定殖

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マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

学ぶマウス腸内細菌叢のqPCRによる定量解析法。経口抗生物質投与後の細菌量変化を測定し、微生物叢異常関連疾患の研究に有用です。体重減少を最小限に抑える投与方法も含みます。

経口抗生物質による治療後マウス腸内細菌叢の量的なポリメラーゼの連鎖反応に基づく分析

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