Name: 形態変化を特徴付けるプロトコルクロストリジウム・ディフィシル抗生物質治療に対する反応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学ぶ走査型電子顕微鏡を用いたClostridioides difficileの形態変化解析法。抗生物質の殺菌作用と細菌の表現型変化を詳細に観察し、感染性疾患治療薬の選択と効果評価に役立つ技術です。

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これらの実験は、Merck and Co.およびSummit, PLCからの研究助成金によってサポートされています。

異なる環境または臨床源からC.ディフィシルを単離する<ol><li>環境分離物：0.85％NaClで軽く濡らした滅菌済み綿ゲージを使用して、関心領域（床、ドア、ハンドル、棚など ）の表面を拭きます。 8滅菌手袋を着用し、綿棒を滅菌済みのチューブに入れてください。 </li><li>臨床分離株（便）：接種ループを使用してセフォキシチン - サイクロセリン - フルクトース寒天（CCFA）上に10〜100mgの臨床便検体をプレートし、厳重な嫌気条件下で48〜72時間インキュベートする。さらなる分析のために、 CryovialsにC.difficileストックの分離したコロニーを-80℃で保存する。 7,9,10 </li><li> 0.05％タウロコール酸ナトリウムを含むブレインハートインフュージョン（BHI）ブロスの環境スワブサンプルを濃縮し、37℃の嫌気性チャンバーに入れます5日間。 10,000×gで1mLの培養液を遠心分離し、100μLのエタノールにペレットを再懸濁する。 </li><li>再懸濁した細胞（50μL）をシクロセリン・エキシチン・フルクトース寒天（CCFA）プレート上にプレートし、37℃で40〜48時間嫌気性チャンバーでインキュベートする。さらなる分析のために、 CryovialsにC.difficileストックの分離したコロニーを-80℃で保存する。 </li><li>ラテックス凝集試薬またはPCRを用いて疑わしいクロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）コロニーを試験する。 </li></ol> C.ディフィシルの培養およびキネティクス手順の殺傷<ol><li> 37℃で48時間、嫌気性チャンバー内の血液寒天プレート上の精製された環境的または臨床的C.ディフィシレ株を増殖させる。 </li><li>接種ループで1つの単離コロニーをとり、15 mLチューブで5 mL BHI培地に移し、37℃の嫌気性チャンバーで24時間増殖させます。 </li><li>前培養1：100を約10 6コロニー形成単位0.1％タウロコール酸ナトリウムおよび適切な濃度の抗生物質（T0）を補充した新鮮な予備還元BHIS（BHI + 5g / L酵母抽出物および1％L-システイン）中でのs（CFU）/ mL。 </li><li>各時点（T0、T6、T24、T48）でピペットを用いて1mLのサンプルを採取し、少量（100μLを連続希釈したもの）を血液寒天プレート上に撒き散布する。細胞を37℃の嫌気性チャンバー内で48時間血液寒天プレート上で増殖させ、得られたコロニー数をカウントしてCFUを決定する。 </li></ol>走査型電子顕微鏡のための試料の準備<ol><li>マイクロ遠心チューブの各時点から1 mLの細胞を集め、10,000 xgで10分間遠心分離します。上清を捨て、PBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 10,000xgで10分間再度サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。 1mLの4％パラホルムアルデヒドで細胞を再希釈し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>サンプルを再び1分間10分間遠心分離する。0,000xgで上清を捨てる。細胞を蒸留水で2回洗浄し、100μLの蒸留水で再希釈する。溶液の濁度に応じて容量を調整する。 注：複数の連続希釈を行うことは良い考えです。 </li><li>カバースリップにラベルを貼り、40μLのサンプルを加えます。フローフード内で15分間インキュベートして液体を蒸発させ、細胞をカバーグラスに接着させる。液体がまだ残っている場合は、ブロワーを使用して液体を取り除いてください。 </li><li>机上のスパッタリング装置に細胞をラベルしたカバースリップを置き、テープを剥がします。スパッタリング装置に純金を固定します。機械をオンにし、低圧（50mTorr）でスパッタリングを開始する。 80nmで30秒間被覆し、20nmの金コーティングとなる。 </li><li>コーティングされた細胞を走査電子顕微鏡に移す。 </li></ol> 4.走査電子顕微鏡上のC.ディフィシレ細胞の画像化<ol><li>走査電子顕微鏡（SEM）を適切に通気するコンピュータソフトウェアのベントボタンを押す。 </li><li>カーボンテープを使用して、コーティングされたカバーガラスを金属ステージに固定します。 SEMが通気されると、ドアは容易に開くはずです。金属ステージをねじ込むことでSEMチャンバーに固定します。 </li><li>コンピュータソフトウェアのPUMPボタンをクリックします。 SEMが &quot;Vac OK&quot;と表示されているときにSEMを使用できます。 </li><li> DetectorタブのSE検出器をクリックします。電圧を表示するボタンをクリックしてビームをオンにします。電圧を上げる前に、より低い電圧（5 kV）でイメージングを開始します（最大15 kV）。ビームがオンになった後に画像が表示されます。 </li><li>トラッキング機能を使用して、コーティングされたカバースリップの画像を描く領域を見つけます。領域を拡大し、棒状の構造を見つける。これらはクロストリジウム・ディフィシルである。 </li><li>システムを較正するために、画像を拡大して焦点を合わせる。これは、複数の作業距離（15,9および5 mm）で行う必要があります。 5mmの作動距離で画像。 </li><li>あなたのスイッチを入れて高解像度のイメージングモードを開始し、非点収差の焦点合わせと最適化を開始します。 </li><li>高倍率でピントを合わせ始める。これを行うには、粗くて細かいフォーカストグルを使用します。非点収差も同様に調整して、より鮮明な画像を得る。 <ol><li>高倍率で非点収差を調整する。これを行うには、非点収差トグル（微妙な/粗いフォーカストグルに似ています）を調整し、コンピュータソフトウェアをデジタルズームして画像を明瞭に確認します。 </li></ol></li><li>スロースキャン機能を使用して高品質の画像を収集します。収集した画像を解析に使用する.TIFFファイルとして保存します。分析中に測定が行われる場合は、データバーが選択されていることを確認してください。 </li><li>角度を変えて画像を収集する（手動で角度をSEMで直接回転させることで最大52°まで）角度のついた画像はより深い情報を示す傾向があります。 </li><li>撮影されている細胞に応じてビーム電圧を変更します。これは、ほとんどの場合、5〜15 kVの間で行います。 </li&gt; <li>イメージングが完了したら、ビームをオフにし、作動距離を20 mmに上げます。その後、チャンバを通気することができ、ステージを取り外すことができる。さらに分析するために、すべての画像をドライブにコピーします。 </li></ol> 5.画像処理と解析<ol><li>自由に利用できるソフトウェアFIJI（http://fiji.sc）をコンピュータにダウンロードしてインストールします。 </li><li> FIJIで画像ファイルを開きます。 </li><li>ライン機能を使用して、スケールバーを正確にトレースします。 </li><li> FIJIプログラムのAnalyzeタブをクリックし、最後にSelect Scaleを選択します。スケールバーに基づいて既知の距離の設定が必要なウィンドウが表示されます。長さの単位も変更し、[OK]をクリックします。 </li><li>プログラムが距離に対して校正されたので、ライン関数を使用してセルの長さを測定します。長さを取得するには、line関数を使用して、セル全体をトレースします。 [分析]タブを再度選択し、[測定]をクリックします。長さはappでなければならない以前に示されたユニットの耳。 </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWGは、Merck & Co.およびSummit, PLCから過去および現在の研究支援を受けています。

現在の研究の目的は、C.difficileを単離し、抗生物質の薬理学的作用のより完全な特徴付けのための手段として走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて抗生物質感受性を試験するためのハイスループット法を作製することであった。本明細書で概説したプロトコールを用いて、抗生物質治療に対する細胞の表現型応答を画像化することにより、薬物の薬理学的作用についての洞察を明らかにすることができた。合計で、このプロトコールのイメージング部分は、細胞を収集した後、約2時間の時間を要するが、典型的な殺傷動力学研究単独よりもはるかに差別的であり得る。 SEMを使用することを学ぶことは技術的に要求されることがありますが、サンプルの準備は比較的簡単で高速です。我々は、ここに概説されたこれらのプロトコルが、抗生物質治療の薬理学的作用を評価する客観的アプローチを提供すると考えている。 tの類似点を考慮して抗生物質殺傷曲線（ 図2 ）では、細胞の薬理学的治療に対する応答に違いがあるかどうかを調べようとした。 SEMを用いて、本発明者らは、メトロニダゾールが薬剤のsupraMIC濃度で細...

Clostridium difficileはグラム陽性の胞子形成細菌であり、米国では毎年約50万の感染を引き起こし、最高レベルのリスクである疾病防除センター（CDC）による脅威レベルの緊急の病原体と考えられています。 1過去10年間に、クロストリジウム・ディフィシレ（C.difficile）に対する抗菌剤の開発が著しかった。 インビトロ研究は、薬物開発プロセスの必要な要素です。伝統的に、 インビトロ感受性および時間殺滅試験は、将来の動物および他のインビボ研究を検証するために使用される。 これらの方法は殺傷作用を評価するために重要な役割を果たすが、薬理学的治療に対する細胞の表現型応答を捕捉しない。スタンドで走査型電子顕微鏡（SEM）を組み込むことにより動力学研究を殺すと、抗生物質の直接的効果のより完全な特徴付けが可能である。ここでは、SEMを抗生物質治療の有効性をプロファイルする手段として使用する方法を提示する。

<table><tbody><tr><td>綿ガーゼ&nbsp;</td><td>お手入れ</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>50 mLチューブ</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion(BHI)&nbsp;</td><td>基準</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>アルファ エーザー</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>基準</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>タウロコール酸ナトリウム</td><td>アルファ エーザー</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>嫌気性チャンバー</td><td>コイ</td><td></td><td>ビニール嫌気性チャンバー</td></tr><tr><td>サイクロセリンセフォキシチン フルクトース寒天 (CCFA) プレート</td><td>嫌気性 システム</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天プレート</td><td>ハーディ診断</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>ラテックス凝集試薬</td><td>オキソイド</td><td>DR1107A</td><td>C. diff テストキット</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ギブコ</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>J.メルビンフリードブランド</td><td>7525M</td><td>75 x 25mm</td></tr><tr><td>フローフード</td><td>Labconco</td><td>クラスIIタイプA2&nbsp;</td><td>バイオセーフティキャビネット</td></tr><tr><td>卓上スパッタリング機</td><td>デントン真空</td><td>デスクII</td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td>プラスチックコア</td><td>05072-AB</td><td>SPI 両面接着カーボンテープ</td></tr><tr><td>ゴールド</td><td>デントン真空</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375インチ直径 x .002"厚手の金箔</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

形態変化を特徴付けるプロトコル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;抗生物質治療に対する反応

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

嫌気性細菌に向けられた新薬開発による抗生物質作用の評価は困難で技術的に要求される。可能なMOAについての洞察を得るために、抗生物質曝露に伴う形態学的変化を走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて視覚化することができる。 SEMイメージングを伝統的なキル曲線と統合することで、薬物行動への洞察が向上し、医薬品開発プロセスが進歩する可能性があります。この前提を試験するために、既知の異なるMOA（バンコマイシンおよびメトロニダゾール）を有する薬物を用いて、曲線を殺し、SEM研究を行った。 C. difficile細胞（R20291）を抗生物質の存在下または非存在下で48時間まで増殖させた。 48時間間隔で、複数の時点で細胞を収集して、抗生物質の有効性を判定し、SEMで画像化した。以前の報告と一致して、バンコマイシンおよびメトロニダゾールは、コロニー形成単位（CFU）カウンターによって測定して、24時間の処理後に有意な殺菌活性を有したティン。 SEMイメージングを用いて、メトロニダゾールは、対照およびバンコマイシンと比較して、細胞長（各抗生物質について細胞長の&gt; 50％の減少; P &lt;0.05）に有意な効果を有することが判明した。薬物治療に対する表現型応答はこれまでにこのように報告されていないが、イメージングおよび測定の汎用性および信頼性ならびに他の実験化合物に対するこの技術の適用を実証する薬物のMOAと一致する。

クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）は胞子形成細菌であるため、機能的分析の前に栄養細胞と胞子細胞との形態学的相違を決定することが不可欠である。 図1は、増殖曲線および胞子細胞の指数期の間に捕捉された栄養細胞の代表的な画像を示す。図示のように、栄養細胞は長くて滑らかな棒状の構造であるのに対し、胞子は粗い外形を有する小さい楕円形の構造である。機能的には、栄養細胞は急速に増殖および分裂し、毒素を分泌することによりクロストリジウム・ディフィシレ感染の病原性の原因となるが、胞子は通常はほとんど活性がなく休眠する。したがって、抗生物質はほとんどが栄養細胞に対して活性であり、胞子は、DNAでコアを保護するいくつかの層および生理学的活性の欠如のために、薬物治療に通常耐性がある。これらの事実のために、形態学的分析のうちの1つは栄養細胞に焦点を当てている。 11,12 <p class="jove_content" fo:keep-togeth...

抗生物質の有効性は、最も一般的には殺傷速度論研究を実施し、コロニー形成単位(CFU)を測定することによって決定されます。走査型電子顕微鏡(SEM)をこれらの標準的な方法に統合することで、異なる抗生物質間で治療の薬理学的効果を区別することができます。

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

この微生物イメージング法の全体的な目的は、薬理学的治療による表現型への影響をより詳細に判別するための手段を提供することです。したがって、本手法は感染症の分野で非常に有用です。具体的には、特定の抗生物質による形態学的影響と、それがどのようにC.Difficileを死滅させるかを検証します。この手法の主な利点は、高解像度イメージングとin vitro細胞培養技術を組み合わせることで、薬剤による殺菌作用の詳細な展望を提供できる点にあります。この手法の意義は、Clostridium difficile感染症（略称CDI）の治療へと広がる可能性があります。その理由は、本手法が、抗菌薬がCDIの治療にどのように有益であるかを特定するための手段を提供し得るためです。この手法は薬理作用に関する知見を得られるだけでなく、混合培養モデルやin vivo動物実験などの他の系にも適用可能です。一般的に、C.difficileの培養と走査電子顕微鏡の操作は困難であるため、この新しい手法の導入に苦労する方が多いと考えられます。私たちは、異なる抗生物質の作用機序を区別しようとしていた際に、初めてこの手法を考案しました。本日ご紹介する研究チームについて説明します。Jahangir Alam氏は教授であり微生物学者です。彼は、本日皆さんが見学するすべての研究室活動を統括しています。Tasnuva Rashidは、研究室の大学院生です。彼女は日々の微生物学的な実験の多くを担当しています。Eugenie Bassereはポストドクトラルフェローです。彼女はTasnuvaに多くのスキルを教え、ラボでの補助も行っています。Brad Endresは、このラボのもう一人のポストドクターです。彼はLong Changの助けを得て、多くの顕微鏡観察を行う予定です。滅菌手袋を着用し、あらかじめ滅菌された綿ガーゼを用いて、床、ドア、ハンドル、棚など、目的とする箇所の表面を拭き取り、環境分離株を調製します。その後、拭き取りに使用したガーゼを滅菌チューブに入れます。サンプルごとに手袋を交換してください。臨床分離株を調製するには、接種ループを使用して10〜100 mgの臨床糞便検体をセフォキシチン・シクロセリン・フルクトース寒天培地（CCFA）に塗抹し、厳格な嫌気条件下で48〜72時間培養します。分離されたC.Difficileのストックコロニーは、今後の解析のためにクライオバイアルに入れ、-80 °Cで保存します。環境スワブ検体は、0.5% sodium taurocholateを含むBrain Heart Infusion（BHI）ブロスで濃縮し、嫌気チャンバー内にて37 °Cで5日間培養します。培養液 1 mL を 10,000 ×g で遠心分離し、100 µL のエタノールを用いてペレットを再懸濁します。再懸濁した細胞 50 µL を CCFA プレートに塗布し、嫌気チャンバー内にて 37 °C で 40 ～ 48 時間培養します。単離した C.difficile のコロニーをクライオバイアルにストックし、今後の解析のために -80 °C で保存します。ラテックス凝集試薬またはPCRを用いて、C.difficileが疑われるコロニーを検査します。精製した環境由来または臨床由来のC.difficile株を、嫌気チャンバー内にて37°Cで48時間、血液寒天培地で培養します。接種ループを用いて単一の独立コロニーを回収し、15 mLチューブに入れた5 mLのBHI培地へと転移させます。その後、嫌気チャンバー内で37°C、24時間培養します。ナトリウムタウロコール酸と適切な濃度の抗生物質を添加した、新しく還元済みのBHISを用いて、前培養液を100倍に希釈し、約10⁶ CFU/mLにします。ピペットを使用して、各タイムポイントで1 mLのサンプルを採取し、少量のアリコートを血液寒天培地に塗抹または塗布します。プレートを嫌気チャンバー内で37°C、48時間インキュベートし、得られたコロニー数を数えてCFUを決定します。各タイムポイントから1 mLの細胞をマイクロ遠心チューブに回収し、10,000 ×gで10分間遠心分離します。上清を捨て、PBSを用いて細胞を洗浄します。サンプルを再度遠心分離し、上清を除きます。次に、1 mLの4%パラホルムアルデヒドを用いて細胞を再懸濁し、室温で1時間インキュベートします。再度サンプルを遠心分離して上清を除いた後、蒸留水で細胞を2回洗浄し、最後に100 µLの蒸留水で細胞を再懸濁します。溶液の濁度に応じて液量を調整します。カバーガラスにラベルを貼った後、サンプルを40 microliters滴下します。フローフード内でカバーガラスを15分間静置し、液体を蒸発させて細胞をガラスに接着させます。液体がまだ残っている場合は、ブロワーを使用して除去します。カバーガラスをデスク型スパッタリング装置にセットし、テープで固定します。スパッタリング装置に純金を用意します。次に、装置の電源を入れ、低圧でスパッタリングを開始します。80 $\mu\text{A}$で30秒間コーティングし、金コーティングを20 $\text{nm}$にします。イメージングを開始するには、まずコンピュータソフトウェアのVentボタンを押し、SEMを適切にベントしてください。細胞のコーティング後、走査電子顕微鏡（SEM）へ移します。カーボンテープを使用して、コーティング済みのカバーガラスを金属ステージ上に固定します。SEMのベントが完了すると、ドアを簡単に開けることができます。金属ステージをねじ込んでSEMチャンバーに固定します。次に、ソフトウェアのPumpボタンをクリックします。システムの読み取り結果が正常になれば、SEMが使用可能な状態になります。Detectorタブで、SE検出器をクリックします。電圧が表示されているボタンをクリックして、ビームをオンにします。電圧を上げる前に、低電圧でイメージングを開始してください。ビームをオンにすると画像が表示されます。トラッキング機能を使用して、撮影するコーティング済みカバーガラス上の領域を探します。その領域をズームし、Clostridium difficileを示す桿状構造を見つけます。システムのキャリブレーションを行うには、ズームインして画像のおおよそのフォーカスを合わせ、Z軸を作動距離にリンクさせます。この操作は、15 mm、9 mm、5 mmなど、複数の作動距離で実施する必要があります。その後、超高解像度イメージングモードに切り替えてください。粗調節および微調節のフォーカス切り替えスイッチを使用して、高倍率でのピント合わせを開始します。乱視矯正スイッチを調整して画像をより鮮明にし、コンピュータソフトウェアを用いて画像をデジタルズームし、鮮明度を確認してください。低速スキャンを使用して、高品質な画像を収集します。解析時に測定を行う場合はデータバーを選択した状態で、収集した画像をtiffファイルとして保存します。SEMのステージを傾けて様々な角度から画像を収集し、より多くの奥行き情報を明らかにします。スロースキャン画像を収集する前に、フォーカスと非点収差を最適化してください。イメージングが完了したら、ビームをオフにし、作動距離を20 millimetersまで上げます。次に、チャンバーをベントしてステージを取り出します。画像を処理し、Fijiで画像ファイルを開きます。直線機能を使用して、スケールバーを正確にトレースします。「Analyze」タブをクリックし、「Select Scale」機能を選択します。スケールバーに基づいた既知の距離を設定するためのウィンドウが表示されます。長さの単位も変更し、OKをクリックします。最後に、細胞の長さを測定するために、ライン機能を用いて細胞全体をトレースします。再びAnalyzeタブを選択し、measureをクリックします。長さは、前述の単位で表示される必要があります。これらの画像は、増殖曲線の対数増殖期にキャプチャされたC.difficileの栄養細胞および胞子細胞を示しています。栄養細胞は細長く滑らかな桿状構造であり、一方で胞子は表面が粗い小さな楕円形の構造をしています。この図に示されているように、コントロール細胞は増殖し定常状態（プラトー）に達しますが、抗生物質のバンコマイシンおよびメトロニダゾールで処理した細胞は、総CFUが検出限界まで減少し、殺菌効果があることが示されました。このように、バンコマイシンとメトロニダゾールは、超MIC濃度においてC.difficileの殺菌に有効であることが実証されました。C.difficileのイメージングにおけるSEMの有用性を示すため、薬剤処理前後の細胞をイメージングし、形態がどのように変化したかを検討しました。バンコマイシンの場合、一部の細胞壁に影響が見られ、メトロニダゾール処理した一部の細胞はサイズが小さくなっていました。細胞サイズに影響があったかを確認するため、Fijiプログラムを用いて細胞の長さを解析しました。この画像に示されているように、コントロール群では栄養細胞のサイズに多少のばらつきがありますが、ほとんどは長さが約6 µmです。しかしながら、このグラフに示されているように、細胞長はメトロニダゾール処理した細胞では影響を受けていましたが、バンコマイシン処理した細胞では影響を受けていませんでした。一度習得すれば、この手法は2日以内に完了させることができます。この手順を行う際は、コーティングおよびイメージングの前に、サンプルが固定され完全に乾燥していることを確認することが重要です。この手順に従うことで、細菌が抗生物質治療にどのように反応するかなど、さらなる疑問に答えるための追加的な手法を実施することができ、例えば抗生物質の作用機序の理解についてより深い知見を得ることが可能です。この技術には大きな可能性があり、微生物学分野の研究者がClostridium difficileの生理学および薬理学をさらに深く探究するための道を開くことになるでしょう。本日のビデオをご視聴いただき、ありがとうございました。本ビデオを通じて、C.difficile細胞の培養および特性解析の方法、C.difficileに対する抗菌薬の殺菌キネティクスの評価方法、そして高解像度顕微鏡を用いてその殺菌パターンに伴う形態学的変化を評価する方法を習得できたことと思います。Clostridium difficileを取り扱う際は、十分な注意を払い、あらゆる防護策を講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶ走査型電子顕微鏡を用いたClostridioides difficileの形態変化解析法。抗生物質の殺菌作用と細菌の表現型変化を詳細に観察し、感染性疾患治療薬の選択と効果評価に役立つ技術です。

形態変化を特徴付けるプロトコル

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