形態変化を特徴付けるプロトコルクロストリジウム・ディフィシル抗生物質治療に対する反応

この微生物学的イメージング法の全体的な目標は、薬理学的治療の表現型効果を区別するためのより記述的な手段を提供することです。したがって、この方法は感染症の分野で非常に役立ちます。具体的には、特定の抗生物質の形態学的効果と、それがC.Difficileをどのように殺すかを調べます。

この技術の主な利点は、高解像度イメージングとin vitro細胞培養技術を組み合わせて、医薬品の殺傷作用の詳細な見通しを提供することです。この技術の意味は、クロストリジウム・ディフィシル感染症、または要するにCDIの治療にまで及ぶ可能性があります。その理由は、この手法が、抗生物質がCDIの治療にどのように有益であるかを特定する手段を提供する可能性があるためです。

この方法は薬理学的作用に関する洞察を得ることができますが、混合培養モデルやin vivo動物研究など、他のシステムにも適用できます。一般的に、この新しい方法には、C.difficileの培養や走査型電子顕微鏡の操作が難しいため、個人が苦労しています。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、さまざまな抗生物質の作用機序を区別しようとしていたときでした。

本日お会いする研究チームについてご紹介します。ジャハンギル・アラムは教授であり、微生物学者です。彼は、今日見られるすべてのラボ活動を調整します。

Tasnuva Rashidは研究室の大学院生です。彼女は日々の微生物学の多くを行っています。Eugenie Bassereはポスドク研究員です。

彼女は本当にタスヌバに多くのスキルを教え、研究室でも支援しています。Brad Endresは、研究室のもう一人のポスドクです。彼はLong Changの助けを借りて多くの顕微鏡検査を行います。

滅菌手袋を着用して環境分離物を準備するには、滅菌済みの綿ガーゼを使用して、床、ドア、ハンドル、棚などの関心のある領域の表面を綿棒で拭きます。次に、綿棒を滅菌したチューブに入れます。サンプル間で手袋を交換してください。

臨床分離株を調製するには、接種ループを使用して、10〜100ミリグラムの臨床便サンプルをセフォキシチン、シクロセリンフルクトース寒天、またはCCFAにプレートし、厳密な嫌気性条件下でサンプルを48〜72時間挿管します。.C.Difficileストックの単離コロニーは、さらなる分析のためにマイナス80°Cのクライオバイアルに保管してください。脳心臓注入液またはBHIブロスの環境スワブサンプルを05%タウロコール酸ナトリウムで濃縮し、サンプルを摂氏37度の嫌気性チャンバーに5日間置きます。

1ミリリットルの培養物を10, 000倍Gで遠心分離し、100マイクロリットルのエタノールを使用してペレットを再懸濁します。再懸濁した細胞の50マイクロリットルをCCFAプレートにプレート化し、37°Cの嫌気性チャンバーで培養物を40〜48時間インキュベートします。C.difficileストックの単離コロニーをマイナス80°Cのクライオバイアルに保管し、さらなる分析を行います。

ラテックス凝集試薬(PCR)を使用して、疑わしいC.difficileコロニーを検査します。精製した環境または臨床のC.difficile株を、37°Cの嫌気性チャンバー内の血液寒天プレート上で48時間増殖させます。接種ループを使用して、1つの分離されたコロニーを取り出し、15ミリリットルのチューブで5ミリリットルのBHI培地に移します。

次に、摂氏37度の嫌気性チャンバーで24時間培養します。タウロコール酸ナトリウムと適切な濃度の抗生物質を補給した新鮮な還元済みBHISを使用して、培養前を1ミリリットルあたり1〜100〜約10〜6CFUに希釈します。ピペットを使用して、各時点で1ミリリットルのサンプルを採取し、プレートにするか、血液寒天プレートに小さなアリコートを広げます。

プレートを摂氏37度の嫌気性チャンバーで48時間インキュベートし、結果として生じるコロニーの数をカウントしてCFUを決定します。各時点から1ミリリットルの細胞をマイクロ遠心チューブに集め、Gの10,000倍で10分間遠心分離します。上清を捨て、PBSを使用して細胞を洗浄します。

サンプルを再度回転させ、上清を捨てます。次に、1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を再希釈し、チューブを室温で1時間インキュベートします。サンプルを再度回転させ、上清を捨てた後、蒸留水を使用して細胞を2回洗浄してから、細胞を100マイクロリットルの蒸留水で再希釈します。

溶液の濁り度に応じて容量を調整してください。カバースリップにラベルを貼った後、40マイクロリットルのサンプルをカバースリップに加えます。フローフードの下で、カバースリップを15分間インキュベートして液体を蒸発させ、細胞をガラスに接着させます。

液体がまだ存在する場合は、ブロワーを使用して液体を取り除きます。カバースリップを机のスパッタリングマシンに置き、テープで留めます。スパッタリングマシンで純金を固定します。

次に、マシンの電源を入れ、低圧でスパッタリングを開始します。細胞を80マイクロアンペアで30秒間コーティングすると、20ナノメートルの金コーティングに変換されます。イメージングを開始するには、まずコンピュータソフトウェアでベントボタンを押してSEMを適切にベントします。

細胞をコーティングした後、走査型電子顕微鏡(SEM)に移し、カーボンテープを使用して、コーティングされたカバースリップを金属ステージに固定します。SEMが通気されると、ドアは簡単に開くはずです。

金属ステージをねじ込んでSEMチャンバーにロックします。次に、ソフトウェアの[ポンプ]ボタンをクリックします。システムが正常に読み戻されると、SEMを使用できるようになります。

ディテクタのタブで、SEディテクタをクリックします。電圧を表示するボタンをクリックして、ビームをオンにします。電圧を上げる前に、より低い電圧でイメージングを開始してください。

ビームをオンにすると、画像が表示されます。追跡機能を使用して、コーティングされたカバースリップの画像化する領域を見つけます。領域を拡大して、クロストリジウム・ディフィシルを表す棒状の構造を見つけます。

システムをキャリブレーションするには、ズームインし、画像に粗く焦点を合わせ、Zを自由作動距離にリンクします。これは、15 mm、9 mm、5 mm など、複数の作動距離で行う必要があります。その後、超高解像度イメージングモードに切り替えます。

粗いフォーカスと細かいフォーカストグルを使用して、高倍率でピントを合わせ始めます。乱視のトグルを調整して画像をより鮮明にし、コンピューターソフトウェアを使用して画像をデジタルでズームインして画像の鮮明さを確認します。低速スキャンを使用して、高品質の画像を収集します。

収集した画像を後で分析するためにtiffファイルとして保存し、分析中に測定が行われる場合はデータバーが選択されていることを確認します。SEMのステージを傾けることで、さまざまな角度で画像を収集し、より多くの深度情報を明らかにします。フォーカスと乱視を最適化してから、低速スキャン画像を収集します。

撮像が完了したら、ビームをオフにして作動距離を20mmに上げます。次に、チャンバーを通気し、ステージを取り外します。画像を処理し、フィジーで画像ファイルを開きます。

ライン機能を使用して、スケールバーを正確にトレースします。[分析]タブをクリックします。次に、「スケールを選択」機能を選択します。縮尺記号に基づいて既知の距離を設定する必要があるウィンドウが表示されます。

長さの単位も変更し、[OK] をクリックします。最後に、セルの長さを測定するには、line 関数を使用してセル全体をトレースします。[分析] タブをもう一度選択し、[測定] をクリックします。

長さは、前に示した単位で表示されるはずです。これらの画像は、成長曲線の指数関数的段階で捕捉されたC.difficile栄養細胞と胞子細胞を示しています。栄養細胞は、長くて滑らかな棒状の構造です。一方、胞子は、外側が粗い小さな楕円形の構造です。

この図に示すように、制御細胞は成長し、プラトーに達します。一方、抗生物質のバンコマイシンとメトロニダゾールで処理された細胞は、検出限界まで総CFUが減少し、殺菌効果を示しています。実証されたように、バンコマイシンとメトロニダゾールは、超MIC濃度でC.difficileを殺すのに効果的です。C.difficileのイメージングにSEMを使用することの有用性を実証するために、薬物治療の前後に細胞を画像化して、形態がどのように変化したかを決定しました。

バンコマイシンの場合、細胞壁の一部が影響を受け、メトロニダゾール処理された細胞の一部はサイズが小さかった。細胞サイズが影響を受けたかどうかをテストするために、プログラムFijiを使用して細胞長を分析しました。この画像で示されているように、栄養細胞のサイズは対照群の場合に多少異なる場合があります。しかし、ほとんどは長さが約6マイクロメートルです。

しかし、このグラフに示すように、細胞長はメトロニダゾール処理細胞では影響を受けましたが、バンコマイシン処理細胞では影響を受けませんでした。一度習得すれば、このテクニックは2日以内に実行できます。この手順を試行する際は、コーティングとイメージングの前にサンプルが固定され、完全に乾燥していることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、細菌が抗生物質治療にどのように反応するかなど、追加の質問に答えるための追加の方法を実行できます。これにより、例えば、抗生物質の作用メカニズムを理解するための洞察を得ることができます。この技術は大きな可能性を秘めており、微生物学の分野の研究者がクロストリジウム・ディフィシルの生理学と薬理学をさらに探求するための道を開く可能性があります。今日は、このビデオを楽しんでいただけたでしょうか。

ここから得られたのは、C.Difficile細胞を増殖させ、特性評価する方法、C.Difficileに対する抗生物質の殺傷動態を調べる方法、そしてその殺傷パターンに関連する形態学的変化を高レベルの顕微鏡法で評価する方法であることを願っています。クロストリジウム・ディフィシルを扱っている間は、特別な予防策を講じ、すべての保護具を使用する必要があります