NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリン レベル移動 (FRET) バイオ センサー
2019年1月12日
ジベレリン認識センサー 1 (GPS1) は最初蛍光共鳴エネルギー移動に基づくバイオ センサー ジベレリン植物生長ホルモン高時空間解像度の携帯電話のレベルを測定するため。このプロトコルは視覚化し、シロイヌナズナの胚軸と根の遺伝的コード化 nlsGPS1 バイオ センサーを用いた細胞ジベレリン レベルを定量化する手法について報告します。
この方法は、成長調節フィトホルモンの分布に関する植物開発分野の主要な質問に答えることができます。.ジベレリンを検出する例えばnlsGPS1の遺伝的にコードされたFRETバイオセンサーを用いることによって、細胞液におけるシロイヌナプシス組織における重要な化合物の動的分布を測定することができる。一般的に、FRETバイオセンサーを分析するには、意図メトリックイメージングと比較してノイズと追加の分析ステップを増加させるレシオメトリックイメージングが含まれるため、この問題に新しい個人は苦労します。
まず、約20種の殺菌したシロイヌナズナの種を1/2のムラシゲとスクーグまたはMS寒天広場プレートにまきます。プレートを細孔外科テープで密封し、成層のために摂氏4度で1〜3日間のインキュベーションのためにアルミニウム箔で包みます。ルートイメージングの場合、示された条件下で3日間垂直方向の成長チャンバーにプレートを移します。
暗く成長した低血糖の場合は、発芽を同期させるために1〜4時間の光パルスのためにプレートを成長チャンバーに移します。その後、アルミニウム箔でプレートを包み、3日間垂直に成長室に置きます。定常状態の測定のために、きれいな顕微鏡のスライドに50マイクロリットルの模擬溶液を加え、3つの核局在性ジベレリンの知覚センサー1かnlsGPS1をスライドに静かに置く。
その後、きれいなカバースリップの各コーナーに真空グリースを落とし、苗の上に滑りをカバーするために穏やかに置きます。慎重に必要に応じて、任意の気泡を除去するために余分な模擬溶液を追加します。ジベレリン4またはGA4処理の前に、真空グリースで満たされ、1ミリメートルの直径の開口部を備えた修正された200マイクロリットルピペットチップを装備した20ミリリットルのシリンジを使用して、きれいなガラススライドに長さ3.5センチメートルの幅を均一に重ねています。
長方形の中央に50マイクロリットルの模擬溶液を加え、きれいな鉗子を使用して、コチレドンの下側で苗を発現するnlsGPS1を持ち上げ、慎重にモック溶液に移します。真空グリースの長方形の中央に実演したように、真空グリースで覆われたカバースリップを置き、苗を邪魔することなく慎重に余分な模擬溶液で貯水池を満たします。その後、エキサイティングなCFPとYFP用の適切なレーザーを搭載した共焦点顕微鏡で苗の画像を取得し、Forster共鳴エネルギー移動イメージングを行います。
治療用のGA4の場合は、顕微鏡ステージからスライドを取り外し、タイマーを20分間セットします。カバースリップの右側からモック溶液を直ちに取り外し、1/4MS液体の17マイクロモルGA4をカバースリップの左側に17マイクロリットルを添加し、すべてのモック溶液が交換されるまで取り替えます。次に、ガラススライドを顕微鏡ステージに戻し、さらに10分間待ってから、後のGA4処理画像を取得します。
目的の組織のタイムコースを設定するには、200マイクロリットルの模擬溶液をibidi付着スライドの灌流チャネルの中心に追加し、実証したようにnlsGPS1苗をモック溶液にそっと配置します。鉗子を使用して、鉗子の裏側を使用して苗の上にカバースリップをそっと置き、粘着スライドの周囲に粘着性のある材料と強い結合を形成するまで、カバースリップの外側の端をそっと押します。次に、2つの0.8ミリメートル内径エルボーエルルアーコネクタと0.8ミリメートルのシリコーンチューブの内側の直径の部分を使用して、粘着性スライドを模擬溶液で満たされた20ミリメートルのシリンジに接続し、スライドを流出溶液を収集するための出口容器に接続します。
気泡がないことを確認するためにチャンバーに十分な溶液を分配するために、プランジャーを静かに押し落とし、プログラム可能なシリンジポンプに注射器をロードします。次に、ポンプを起動してタイムコースを開始します。時間経過中のGA4治療の場合、ポンプを一時停止して灌流を停止し、注射器を含むモックバッファーをGA4で補充された4分の1のMS液体で満たされた注射器に交換します。
3D 画像解析の場合は、ファイルを IMARIS 画像解析ソフトウェア プログラムにインポートし、サーフェス ウィザードを開きます。バックグラウンド減算を 3 ミクロンに設定し、しきい値をデフォルトに設定します。核のセグメンテーション中は、近いバックグラウンドレベルのシグナルを持つ物体の信号対雑音の配給がレシオメトリック画像解析には低すぎるため、薄暗い蛍光を有する多くの核を含めないように注意してください。
次に、YFP 放出を使用して作成されたサーフェスに基づいて、CFP および FRET 放出チャネルをマスクします。XT平均強度比拡張を使用して、ドナー励起アクセクサ放出の比率を、ドナー励起ドナー放出で割った値を、2つのチャネル内の個々の表面の平均強度値の間で計算する。nlsGPS1 の放出比率で個々のサーフェスを色分けするには、統計情報を使用して色分けを選択し、平均強度比を統計タイプとして設定します。
統計アイコンの下で、テーブルから個々の値の比率をエクスポートし、データをグラフィカルに表現するためにスプレッドシートに値をコピーして貼り付けます。シロイヌナズナのルートでは、nlsGPS1の放出比勾配は、有糸学および除算ゾーンにおける低GA4レベルと後期伸長帯の高いGAレベルを示す。対照的に、発光比勾配はnlsGPS1の無応答根では観察されず、内因性GA4勾配はアーティファクトではないことを示唆している。
nlsGPS1発光比勾配は、コチルドンの低レベルと、低コチルの急速に伸びる基底領域における典型的なフックおよび高レベルの暗成長した低コチルでも形成される。これに対して、nlsGPS1非応答性低コチルでは発光率勾配は認められない。さらに、外因的に供給されたGA4は、内因性および外因性GAパターニングを研究するためにnlsGPS1を使用できることを示す、シロイヌナズナの分裂ゾーンと比較して伸び帯に優先的に蓄積する。
さらに、GA4処理nlsGPS1苗の経時解析は、除算ゾーンと比較して根伸びにおける外因性GA4のより速い蓄積を明らかにする。この手順を試みる間、イメージングパラメータを一定に保ち、サンプルの灌流中のドリフトと焦点変化の問題を最小限に抑えるために、定量イメージング中に飽和ピクセルを避けることを忘れないでください。この手順に従って、ルートチップ型制御拡散装置で成長するイメージングルーツのような、異なる速度で成長するシロイナズナプシスの根先端のGA勾配がどのように変化するか、または開発後のストレスに応じて、この技術は、植物の成長分野における研究の道を開き、追加のアラビナプソピスタリアの組織および器官におけるジベレリンの動的分布を探求する道を開いた。
概要
この記事では、植物のジベレリンフィトホルモンを測定するための新しいFörster共鳴エネルギー移動（FRET）ベースのバイオセンサー、Gibberellin Perception Sensor 1（GPS1）を紹介します。この方法により、アラブイデプシスのハイポコタイルと根の先端におけるジベレリンレベルの高い解像度の可視化と定量化が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 植物生物学
- フィトホルモンシグナリング
- 細胞イメージング技術
背景
- ジベレリンは植物の成長調節フィトホルモンです。
- それらの分布を理解することは植物の発達を研究する上で重要です。
- FRETバイオセンサーはホルモンレベルを測定するための動的な方法を提供します。
- 以前の方法では、GPS1が提供する時空間分解能がありませんでした。
研究の目的
- 植物組織におけるジベレリンレベルのリアルタイム測定の方法を開発すること。
- アラブイデプシスにおけるジベレリンの分布を可視化すること。
- 植物の成長調節の理解を深めること。
使用された方法
- アラブイデプシスの苗における遺伝的に符号化されたnlsGPS1バイオセンサーの利用。
- FRETシグナルを分析するための比率イメージング。
- ジベレリンレベルをイメージングするための共焦点マイクロスコピー。
- ジベレリン分布の動的な変化を評価するための時間経過実験。
主要な結果
- nlsGPS1はアラブイデプシスの根とハイポコタイルにおけるジベレリンレベルの勾配を明らかにします。
- ハイポコタイルの伸長ゾーンで高いジベレリンレベルが見つかりました。
- 外因性のGA4処理はバイオセンサーのジベレリン変化への感度を確認しました。
- 結果は、nlsGPS1バイオセンサーがジベレリンダイナミクスを研究するのに効果的であることを示唆しています。
結論
- GPS1バイオセンサーはジベレリン分布を調査するための貴重なツールです。
- この方法は植物発生生物学の研究を進めることができます。
- 結果は植物のフィトホルモンシグナリングのより深い理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Monitoring dynamic phytohormone gradients at cellular resolution supports mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular signaling to phenotypic outcomes. The nlsGPS1 FRET biosensor enables quantitative, spatiotemporal mapping of gibberellin dynamics, providing predictive confidence in target pathway modulation. This approach aids in translational biomarker alignment and preclinical model validation for growth-regulatory pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gibberellin signaling dynamics in living tissues to clarify target engagement and pathway activity.
- Operational Value: Provides ratiometric readouts that reduce variability and support reproducible target validation assays.
- Predictive Value: Facilitates dose-response characterization of gibberellin-modulating compounds with subcellular resolution.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescence ratio outputs suitable for high-content screening of gibberellin biosynthesis or signaling inhibitors.
- Quantitative Output: Enables ratiometric imaging that corrects for expression level and environmental artifacts, improving assay robustness.
- Scalability: Compatible with microfluidic perfusion systems for time-course compound exposure studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports evaluation of gibberellin pathway modulation in plant-based preclinical models of growth dysregulation.
- Translational Continuity: Links cellular hormone flux to tissue-level phenotypes, aiding in biomarker-driven go/no-go decisions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target gibberellin modulation versus off-target effects.
Pipeline & Workflow Integration
The nlsGPS1 biosensor integrates into discovery workflows from target validation through lead optimization by providing real-time, quantitative feedback on pathway modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gibberellin-dependent mechanisms in growth and development pathways.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for compound libraries targeting hormone biosynthesis or perception.
- Analytics: Delivers ratiometric FRET measurements that allow comparison of intracellular gibberellin levels across conditions and time points.
- Translational Research: Connects subcellular hormone dynamics to organ-level responses in Arabidopsis, supporting extrapolation to complex systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform for longitudinal studies of phytohormone flux in genetic or chemical perturbation models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in phytohormone signaling by providing direct, real-time readouts of cellular gibberellin levels.
- Operational Value: Enhances reproducibility through ratiometric imaging that normalizes for biosensor expression and environmental variables.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by linking compound treatment to quantifiable changes in target pathway activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gibberellin pathway modulators based on validated target engagement in relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and FRET imaging techniques for accurate ratiometric analysis.
- Dependent on stable transgenic expression of nlsGPS1 in Arabidopsis lines for consistent biosensor performance.
- Necessitates careful control of imaging parameters to avoid pixel saturation and maintain signal-to-noise ratio during time-course experiments.
- Involves analytical steps to segment nuclei and compute intensity ratios, requiring validated image analysis pipelines (e.g., Fiji or IMARIS).
- Limited to gibberellin perception; does not distinguish between bioactive and inactive forms or downstream signaling events.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Plant Growth and Sample Preparation
2:09
Gibberellin4 (GA4) Treatment
3:45
Tissue of Interest Time Course Setup
5:09
3-D Image Analysis
6:36
Results: Representative Endogenous and Exogenous GA Gradients in Arabidopsis Roots and Dark-grown Hypocotyls
7:58
Conclusion
