Name: モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ 移動する単一分子FRETプローブの二次元時空間解析法。蛍光顕微鏡を用いてFRET効率と分子位置の時間変化を測定し、生細胞内の分子力や構造動態、結合動態を解明する。

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この研究は、オーストリア科学基金(FWF)プロジェクトP30214-N36、P32307-B、ウィーン科学技術基金(WWTF)LS13-030によって支援されました。

<ol><li>McKinney, S. A., Déclais, A. -C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li>
<li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li>
<li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li>
<li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α.</a> Nature Communications. 9 (1), 235(2018).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li>
<li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonance+energy+transfer%3A+Methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li>
<li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecular+f%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-molecular förster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492(2021).</li>
<li>Malkusch, N., Dörfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li>
<li>Lee, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li>
<li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li>
<li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer%3A+Applications+in+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li>
<li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5%27+splice+site+and+branch+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+kinesin+waits+between+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li>
<li>Göhring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502(2021).</li>
<li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669(2018).</li>
<li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoo%2C+C+%22Single-molecule+FRET+with+total+internal+reflection+microscopy%22">Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy</a>. (12), Cold Spring Harbor. 1223-1237 (2012).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+%28excitation%29+for+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+%28emission%29+for+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li>
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<li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li>
<li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+analysis+software+%283.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
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<li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

この記事では、モバイルでありながら表面につながれたプローブ分子から生じるsmFRETデータの自動記録および定量分析のためのパイプラインについて詳しく説明します。これは、表面固定化プローブまたは共焦点励起ボリューム17に出入りする溶液中で拡散するプローブのいずれかを含む、smFRET実験に対する2つの主要なアプローチを補完する。それは時間の機能として正しいFRET効率および分子位置を提供する。したがって、遷移キネティクス1、FRETヒストグラム39、または2次元拡散22を定量化する特殊な分析プログラムの入力として使用することができる。
ソフトウェアは、ユーザーに無料の使用、変更、再配布の永久権利を付与するオープンソースイニシアチブによって承認された無料のオープンソースライセンスの下でリリースされます。Github は、ソフトウェアを入手し、バグを報告したり、code40 を提供することで開発プロセスに参加することを可能な限り簡単にする開発と配布プラットフォームとして選ばれました。Pythonで書かれたソフトウェアは、独自のコンポーネントに依存しません。Jupyter ノートブックをユーザー インターフェイスとして選択することで、解析の各ステップでデータの検査が容易になり、実験システム専用のパイプラインの調整と拡張が可能になります。 sdt-python library32 は、単一分子局在化、拡散解析、蛍光強度解析、カラーチャネル登録、共局在分析、ROI処理などの蛍光顕微鏡データを評価する機能を実装します。
原則として、単一粒子追跡は、1次元、2次元、または3次元システムで実行できます。ここでは、単分子分析パイプラインを2Dモバイルシステムの研究に合わせて調整しました。この選択は、平面で支持される脂質二重層(SLB)のような単純なシステムの利用可能性を反映して、移動式蛍光プローブを提示する。このような脂質二重層系は、典型的には、2つ以上のリン脂質部分から構成され、バルク分率はSLBの主要な物理化学的パラメータ(位相および粘度など)を決定し、マイナーな分画は生体分子の付着部位を提供する。これらの付着部位は、アビジンまたはストレプトアビジンベースのタンパク質プラットフォームまたはヒスチジンタグ41を有するタンパク質プラットフォーム用のニッケルNTA共役リン脂質に対するリン脂質をビオチン化することができる。SLBにタンパク質をリンクするための適切なプラットフォームの選択は、科学的な質問に依存します。読者は、成功した戦略の例については、文献16,38,42を参照することができます。サンプル内のプローブの密度は、ポイントスプレッド関数の重複を避けるために十分に低くする必要があります。通常、μm2当たり0.1分子未満が推奨されます。適切なプローブ密度を示す例については、代表的な結果セクション(特に図6)を参照してください。この分析方法は、生細胞の細胞膜に拡散する単一の蛍光標識タンパク質分子にも適用可能である。
smFRET実験の重要な側面の1つは、FRETプローブ自体の生産と特性化です。FRET ペアのフルオロフォアを選択する場合、フェルスター半径は、予想される色間距離43 と一致する必要があります。フォトブリーチに耐性のある染料は、長い時間の痕跡をもたらすので好ましい。しかし、漂白率が上昇した場合、1種のフルオロフォア種を利用して、段階的な光漂白分析を介して共局化分子から発生する多元化事象を認識することができる。プロトコルのセクションのステップ8.1.4を参照してください。フルオロフォア対は、部位特異的に、そして関心のある分子に共有結合し、分子内または分子間FRETペアを形成するべきである。
smFRETを他の容易に利用できる技術と組み合わせることで、(STED44経由で)回折限界を超えてその空間解像度を高めることができます。ここで示すsmFRETの追跡アルゴリズムは、新しい実験設定とモデルシステムへのアプローチの適用性を広げます。これには、(i)移動生体分子の化学量論における運動学的変化、(ii)移動生体分子の動的関連、(iii)自由に拡散反応物の酵素反応の速度、および(iv)移動体生体分子の立体構造変化の運動論の研究が含まれる。最初の2つの例では、分子間FRET、すなわちドナーとアクセクターが関心のある生体分子エンティティを分離するために共役していることを示すモデルシステムが必要です。後者の例は、同一分子体の中でドナーとアクセクサを運ぶバイオセンサー(分子内FRET)を利用することができる。
分子内FRETベースのセンサは、生体分子の固有の立体構造変化、内在性または外力負荷(分子力センサ16)、またはカルシウムm45やpH46などのナノ環境におけるイオン濃度に関する洞察を提供できる。.モデルシステムと好ましいアンカープラットフォームに応じて、このようなsmFRETイベントは2Dまたは3Dのいずれかで追跡することができます:(i)SmFRETイベントの平面追跡は、形質膜内の受容体リガンド相互作用時間の定量化、膜固定シグナル増幅カスケードの関連、および表面のストイチオメトリー変化に使用することができます。(ii) smFRETイベントの体積追跡は、生細胞またはインビトロ再構成システム内の任意の分子内または分子間FRETプローブに使用することができる。
SmFRETの追跡方法は、主に分子内FRETプローブを念頭に置いて開発されました。これらのプローブは、固定された既知の数の蛍光標識、凝集および誤って合成された(例えば、不完全に標識された)分子からのデータを拒絶するために利用された事実、ならびに蛍光HOREの1つが光漂白されたプローブからも利用された事実である。しかし、フィルタリングステップを調整することにより、分子間FRETプローブにも適用できる。例えば、単一のドナーと単一のアクセプターフルオロフォアを特徴とする分子のみを受け入れる代わりに、ドナーとアクセプター色素の空間的軌道を調べ、例えばドナーアクセプター軌道を共同拡散させる方法を選択することができます。
3D-DAOSTORMアルゴリズムは、放射ビーム経路の円筒レンズによる乱視による光軸に沿った信号位置を決定するサポートを持つため、3D実験を解析パイプラインに簡単に統合することができます。この場合、アクセクサ励起時のアクセクサシグナルは、索体測定と軸位置を決定するのに役立つであろう。また、解析ソフトウェアを用いて、その大規模な自動化とフィルタリング方式を利用して、固定化プローブを用いた実験データを評価することもできます。実際、ゲル相bilayer38 に固定化されたホリデイ接合部からのsmFRET効率データセットを、初期バージョンのソフトウェアを用いて解析した。

フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)は、ナノメートル以下の分解能でプロセスの調査を可能にする分子生物学的および生物物理学的研究において主要な原動力となっています。ドナーとアクセプター蛍光体との間のエネルギー伝達の効率は、サブナノメートルからナノメートルの範囲における色素間距離に強く依存するため、生体分子の静的かつ動的な立体構造を探索する分光定規として有効に使用されています1,2,3,4.また、FRET現象はバルクレベル5,6で膜関連タンパク質と細胞内タンパク質の共局在化研究に広く用いられている。過去20年間で、この方法はsmFRETイベントを監視するために適応され、時間的および空間的分解能を大幅に増加させ、異種サンプル中のまれな亜集団でさえも解決しました。これらの技術を備えた、RNAポリメラーゼII8の転写処理率、DNAポリメラーゼ9,10の複製速度、ヌクレオソーム転座率11、組み立てられたスプリセソーム12の転写スプライシングおよび失速速度、リボソーム亜集団13の活性、およびkinininモータの歩行速度などの分子機械のダイナミクスにユニークな洞察を得たを挙に、いくつか名前を付けます。受容体リガンド相互作用持続時間15及び分子力16が定量化されている。
強度ベースのsmFRET研究は、通常、FRET効率を測定するために感作発光に依存しています:放出経路のビームスプリッターは、ドナー励起時にドナーとアクセプター蛍光体から発生する光を空間的に分離し、個々の蛍光強度の定量化を可能にします。その後、効率は、総フォトン数17に対してアクセクターによって放出される光子の割合として計算することができる。また、ドナー励起(ALEX)に続くアクセクサ励起は、FRET事象のストイチオメトリーの測定を可能にし、例えば、光漂白されたアクセクターフルオロフォア18を特徴とするプローブから生じる信号からの真の低FRET信号間の識別を助ける。
単一分子FRET実験は、一般的に2つの方法のいずれかで行われます。まず、サンプル体積の小さな領域を共焦点顕微鏡を用いて照光する。溶液中の単一のプローブ分子は、焦点体積内で拡散する場合に励起されます。この技術により、高速光子計数検出器を使用して、マイクロ秒以下の時間分解能を可能にします。第二に、プローブは表面に特異的に固定化され、広視野顕微鏡を介して監視され、多くの場合、バックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために全内部反射(TIR)構成を使用する。プローブの固定化により、最初のアプローチを使用する場合よりもはるかに長い記録時間が可能になります。さらに、視野が大きいほど、複数のプローブを並列で監視できます。カメラの必要性は、この方法は、上記の方法と比較して遅くなります。時間の解像度は、ミリ秒から 2 番目の範囲に制限されます。
長い時間のトレースが必要な場合、例えば、ミリ秒から秒の時間スケールで動的プロセスを研究するために、蛍光バーストは通常短すぎるため、最初の方法は適用されません。第2のアプローチは、例えば細胞膜内に拡散するプローブを特徴とする生細胞実験において、固定化が実現不可能な場合には失敗する。さらに、生体モデルシステムは接触したsurface16の移動度に応じてその応答を劇的に変化させることができることが観察されている。
SmFRETと単粒子追跡実験を組み合わせて、モバイルFRETプローブを記録する実験が過去19回に行われてきたが、データの評価に公的に利用可能なソフトウェアはない。これにより、smFRET効率やストイチオメトリー、サブピクセル精度の位置、時間の関数としての蛍光強度など、移動式蛍光プローブの複数の特性を決定できる新しい分析プラットフォームの開発が促されました。段階的な漂白挙動、近傍距離、発光強度、およびその他の形質を調べることによって得られた痕跡をフィルタリングする方法を確立し、正しく合成され、機能的な単一プローブ分子を排他的に選択した。ソフトウェアはまた、信頼性の高い、定量的なsmFRET data17を生成するために、最近の多実験室研究で合意された実験的および分析的な技術をサポートしています。特に、この実装は、FRET効率と量イチオメトリーの計算のための検証済みの手順に従います。ドナー発光チャネルIDDおよびアクセプタ排出チャネルIDAにおけるドナー励起時の蛍光強度は、Eq(1)を用いた見かけのFRET効率効率の計算に使用される。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
アクセクサ励起IAA時のアクセクサ発光チャネルにおける蛍光強度の助けを借りて、Eq(2)を用いて見かけのストイチオメトリーを計算する。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
FRET効率とストイチオメトリーSは、4つの補正因子を考慮することで、EappとSappから導き出すことができます。
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
αは、アクセプター発光チャネルへのドナー蛍光の漏出を記述し、ドナー蛍光HORAのみを含むサンプルを使用して、またはアクセプターが漂白された軌道の一部を分析することによって決定することができる。δは、ドナー励起光源によるアクセプタの直接励起を補正し、アクセプタ蛍光色素のみを含むサンプルを使用するか、ドナーが漂白された軌道の一部を分析することによって測定することができる。
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γは、ドナーとアクセプターの放出チャネルの発散検出効率とフルオロフォアの異なる量子効率を是正するためにIDDをスケーリングします。この係数は、高いFRET効率20の軌道におけるアクソシドール漂白時のドナー強度の増加を分析するか、または複数の離散FRET状態を特徴とするサンプルを研究することによって計算することができる。
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
βは、ドナーとアクセクサの励起の異なる効率を修正するためにIAAをスケーリングします。γがアクサンパクサ漂白分析によって決定された場合、βは、既知のドナー間受け入れ子比21のサンプルから計算することができる。それ以外の場合、マルチステート FRET サンプルもβを生成します。
一緒に、補正は、Eq(3)を使用して補正FRET効率の計算を可能にする。
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
そして、Eq(4)を用いて修正されたストイチオメトリー。
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
理想的には、1:1ドナー対アクセクサ比に対する修正されたストイチオメトリーは 、S = 0.5を与える。実際には、信号対雑音比が低下すると 、Sの測定値の広がりが生じ、ドナー専用信号(S = 1)およびアクセクサ専用信号(S = 0)からの差別が妨げられます。結果として得られる時間トレースは、単一分子軌道のより詳細な分析のための入力として使用して、時空間的な力プロファイル16、単一分子事象22の移動性、または異なる状態間の遷移運動論などの情報を得ることができる1。
以下のプロトコルは、smFRET追跡実験の実験パラメータと手順、および新しく開発されたソフトウェアスイートを用いたデータ解析の動作原理について説明します。実験データの取得には、以下の要件を満たす顕微鏡のセットアップを使用することをお勧めします: i) 単一色素分子の放出を検出する能力;ii) 広視野照明: 特にライブセル実験では、全内部反射(TIR23,24,25)構成が推奨されます。iii)ドナーとアクセプター蛍光が同じカメラチップ25または異なるカメラの異なる領域に投影されるような波長に応じた発光光の空間的分離。iv)ドナーおよびアクセプター励起の光源の変調をミリ秒の精度で、例えば、直接変調可能なレーザーまたはアクロス視変調器を介した変調を使用する。これにより、ストロボスコープ照明は、蛍光色素の光の漂白を最小限に抑えるだけでなく、色素数を決定するために交互に興奮を可能にします。v) PIMS Python パッケージ26で読み取ることができる形式で記録された画像シーケンスごとに 1 つのファイルの出力。特に、複数ページの TIFF ファイルがサポートされています。

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;Plan-FLUAR 100x/1.45 オイル対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td>000000-1084-514</td><td></td></tr><tr><td>Axio オブザーバー 顕微鏡本体</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バンドパス フィルター</td><td>クロマ テクノロジー コーポレーション</td><td>ET570/60m</td><td>ドナー エミッション フィルター</td></tr><tr><td>バンドパス フィルター</td><td>クロマ テクノロジー</td><td>コーポレーション ET675/50m</td><td>アクセプター エミッション フィルター</td></tr><tr><td>コンダ フォージ</td><td>コンダ フォージ コミュニティ</td><td></td><td>Anaconda/miniconda</td></tr><tr><td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td><td>MENZEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Semrock Inc</td><td>FF640-FDi01-25&times;ド</td><td>ナーとアクセプターエミッション</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー(クワッドバンド)</td>の36分離<td>Semrock Inc</td><td>Di01-R405 / 488/532 / 635-25&times;36</td>励<td>起光と発光光の分離</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>for imaging buffer</td></tr><tr><td>fret-analysis</td><td>Sch&uuml;tzグループ、ウィーン</td><td></td>工科大学、<td>Pythonパッケージ、smFRETデータ解析用、バージョン3</td></tr>、<tr><td>Fura-2 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11524766</td><td></td></tr>、<tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td>、イメージングバッファ用</td></tr><tr><td>iBeam Smart 405-S 405 nmレーザー</td><td>Toptica Photonics AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EMCCDカメラ</td><td>Andor Technology Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek chambers(8ウェル)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>177402PK</td><td>サンプル調製およびイメージング用</td></tr><tr><td>Millenia Prime 532 nm レーザー</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miniconda</td><td>Anaconda Inc.</td><td></td><td>Python 3 ディストリビューション。 最小バージョン: 3.7</td></tr><tr><td>一価ストレプトアビジン (細菌発現用プラスミド)</td><td>Addgene</td><td>20860 & 20859</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 640 nm レーザー</td><td>Coherent Inc</td><td>1185055</td><td></td></tr><tr><td>Optosplit II</td><td>Cairn Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253</td><td>for imaging buffer</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>sdt-python</td><td>Sch&uuml;データ解析のための TU Wien</td><td></td> Python ライブラリの tz グループ<td>; バージョン 17</td></tr><tr><td>TetraSpek ビーズ サイズ キット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T14792</td><td>画像レジストレーションのためのランダム分布固定化基準マーカー</td></tr><tr>USC500TH <td>SUV 形成のための</td><td>超音波浴</td><td>VWR</td><td></td></tr></tbody></table>

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

単一分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)は、サブナノメートルからナノメートルの範囲の距離を報告する多目的な技術です。分子力の測定、生体分子の立体構造ダイナミクスの特徴づけ、タンパク質の細胞内共局在の観察、受容体リガンド相互作用時間の測定など、生物物理学的・分子生物学的実験の幅広い分野で使用されています。広視野顕微鏡構成では、実験は通常、表面固定化プローブを用いて行われる。ここでは、単一分子追跡と交互励起(ALEX)smFRET実験を組み合わせた方法が提示され、表面結合した、しかもガラス支持脂質二重層中の移動式プローブのsmFRET時間トレースの取得が可能となる。記録されたデータの分析のために、(i)蛍光シグナルの局在化、(ii)単粒子追跡、(iii)補正因子を含むFRET関連量の決定、(iv)smFRETトレースの厳格な検証、および(v)結果の直感的な提示を支持する自動化されたオープンソースソフトウェアコレクションが開発されました。生成されたデータは、プローブの拡散挙動の評価やFRET遷移の調査など、特殊なソフトウェアを介してさらなる探査のための入力として便利に使用できます。

実験の科学的な問題に応じて、smFRETトラックから様々な低レベルおよび高レベル情報を抽出することができます。ここでは、アナログおよびデジタルプローブを用いた分析パイプラインの例を示す:ペプチドベースの分子力センサ16 とそのコンフォメーション38の確率的切り替えを有するDNAプローブをそれぞれ紹介する。これらのプローブの設計と動作原理については 、図5 を参照してください。
ローカリゼーションとトラッキングアルゴリズムがプロトコルで説明されているように実行された後、パッケージは、初期パラメータとその後のフィルタステップを最適化するための複数のデータ可視化ツールを提供します:(i)個々のsmFRETイベントの視覚化、(ii)関心のある特定の領域のデータを分析するためのオプションの画像セグメンテーション、(iii)FRET効率対ストイチオメトリー(E-S)プロットを介したフィルタステップの監視。単一分子データの視覚化を 図6に示します。
最後に、フィルタされたFRETイベントは、E-SプロットとFRET効率ヒストグラムで表されます(図4)。E-Sプロットは、前述のフィルタリングステップを最適化し、最終結果を調査するのに便利なツールです。部分的に漂白されたまたは不完全に標識されたFRETセンサーは、その量化測定値によって除外することができる。移動度パラメータは、 x-y プロット(図6)または平均二乗変位(MSD)プロット(図4)で個々の軌道パスをプロットすることによって調査できます。最初の方法は、固定化されたイベントからモバイルを識別するのに特に有用であり、後者は拡散係数を計算するために使用されます。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> 図4:例示的な出力。 (A) FRET効率は、ガラス支持脂質二重層を飾り、T細胞で張る分子力センサ(左パネル)の集団に対して、ストイチオメトリー(E-Sプロット)に対してプロットされる。1 つの人口クラウドのみが表示されます。FRET効率のそれぞれのヒストグラムは、細胞の存在と不在における力センサー集団の差を例示する(中間パネル)。T細胞存在下でのセンサ集団のFRET効率低下へのシフトは認められないが、センサモジュールの力依存性の伸張はほとんどない。これらの実験条件のMSDプロットは、T細胞の下の力センサー集団が、非連結の対応物(右パネル)よりもかなり遅く動くということを確認する。(B)同じ分析を、ガラス支持の液体脂質二重層を飾るホリデイ接合DNAセンサーで行った。E-Sプロットは、FRET効率ヒストグラムでも明らかな2つの集団を明確に示しています。MSD プロットは、1 つの高速移動センサーの母集団の存在を示します。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;MSD = 平均平方変位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> 図5:分子内FRETプローブの設計と動作原理(A)機械的分子力の定量のためのアナログペプチドセンサー。ドナーおよびアクセプター蛍光HOREは、ペプチド骨格の両端に共有結合される。このセンサーモジュールは、特定のリガンドに部位特異的に結合され、これは、目的の細胞内表面受容体(ここでは、T細胞受容体のβ鎖を特異的に認識する抗体断片)に結合する。受容体リガンド結合時に力が発揮され、センサーモジュールが伸び、最終的には結合切断後に反動する。このパネルは16から変更されます。(B) FRET遷移の定量を行うデジタルDNAセンサーFRETセンサーは、ホリデイ接合部を形成する4本のDNA鎖で構成されています。ドナーとアクセクサ蛍光相は2本の鎖に共有結合する。ホリデイジャンクションは、周囲のバッファー条件に応じて、それらの立体構造を頻繁に切り替えます。これらの立体構造の確率的切換えは、個々のプローブのFRET効率を定量することによって監視することができる。略語: TCR = T細胞受容体;FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> 図6:FRETプローブのローカリゼーションとトラッキングの例 (A)個々の事象のFRET効率および量合体測定は、ドナー励起時のドナー蛍光色素の強度(D→D)、ドナー励起時のアクセクサ蛍光体(D→A)、およびアクセクサ励起時のアクセクターフルオロフォア(A→A)を定量することによって計算される。近傍フィルタは、近接エミッタのポイントスプレッド機能を重ねることでバイアスを防ぎます。画像のセグメンテーションにより、ユーザーは対象領域内にローカライズされた特定のsmFRETイベント(例えば、セルまたはマイクロパターン)を選択できます。画像セグメンテーションの一例として、T細胞をFura-2(左側に表示)で染色し、適応閾値を付けて細胞の縁を特定する(オレンジ色の点線)。スケールバー= 5 μm. (B) 分子力センサーを用いたsmFRET軌道。個々の軌道を x-y 平面にプロットして、拡散の挙動と局在化を視覚化することができます(左パネル)。さらに、各軌道の強度を時間をかけてプロットして、FRETの遷移または漂白ステップを特定することができます(中央のパネルは左パネルからの赤い軌道を示しています)。得られたFRET効率とストイチオメトリーも同様に可視化することができる(右パネル)。(C) ホリデイ接合DNAセンサーを用いた smFRET 軌道。HBSS + 12 mM MgCl2 は測定時にバッファとして使用した。これらの例のシーケンスの終わり近くにある見かけのアクセクサ漂白ステップとは別に、各センサのFRET遷移の頻度を決定することができる。ホリデイ接合は高周波で立体構造を切り替えますが、分子力センサはFRETトランジションを示しません。この情報により、フレーム間の遅延などの実験条件を調整し、観察される遷移の数を増減することができる。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー伝達;smFRET = 単分子フレット;HBSS = ハンクのバランスの取れた塩溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足情報:単一分子の局在化と追跡(01.Tracking.ipynb) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">こちらをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。</a>

本稿では、広視野蛍光顕微鏡を用いた移動式単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)ベースのプローブの時空間解析方法を紹介する。新開発のソフトウェアツールキットは、正しいFRET効率や分子位置を含む移動プローブのsmFRET時間トレースを時間の関数として決定することを可能にします。

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

表面結合プローブを用いた単一分子FRET実験は、これまでほぼ固定化された分子に対して行われてきました。しかし、多くの生体分子が拡散し、我々の方法で分析することができます。単一分子FRETと追跡を組み合わせることで、FRET欠乏時間の経時的な移動プローブの解析だけでなく、拡散挙動などの時空間的な側面を調べることができます。当社の方法は、さまざまな異なるFRETベースのプローブと互換性があります。例えば、生細胞実験における分子力、立体ダイナミクス、結合運動に関する洞察を提供することができます。高品質の単一分子FRET実験は、悪名高い実行が困難です。信頼性の高い定量を行うためには、良好な信号対雑音比と十分な長さの単一分子トラックでデータを記録することが重要です。サンプル測定を開始するには、ドナーとアクセプターの蛍光体を励起して、カメラをトリガーしながら適切な照明時間を得て、カメラの読み出しが有効になるまで待ちます。ドナーとアクセプター蛍光色素の励起を代わりに繰り返します。一分子シグナルを凝集体から識別する段階的な光漂白分析を可能にする視野内のプローブ当たり少なくとも1つの蛍光色素の光化を確実にするのに十分な大きさの繰り返し数を選択します。記録された画像シーケンスからのイメージセグメンテーション用のフレームだけでなく、ドナーとアクセプタの励起フレームを選択できるようにする照明シーケンスを指定します。同時に、同じ照明設定を使用して記録されたデータセットを解析します。この処理を行うために、各データセットに、それぞれのイメージ シーケンスのファイル名に一致する識別子とパターンを割り当てます。また、画像登録用の受託者マーカーの記録、フラットフィールド補正用の励起光プロファイル、オプションでドナー専用サンプルおよびアクセプタ専用サンプルなど、特別な目的に特化したデータセットを定義して、補正係数を決定します。次に、両方のチャンネルが 1 つのカメラを使用して記録される場合は、発光チャネルと生画像を選択します。このためには、適切なグラフィカルウィジェットを使用して、ドナーとアクセプターの放出に適した領域を選択し、両方の放出チャネルで受託マーカーをローカライズし、画像登録を行います。提供されたユーザーインターフェイスを使用して、ドナーとアクセクサーの両方の放出チャネルのローカリゼーションアルゴリズムに適したパラメータを見つけます。次に、ドナーとアクセプターの放出から得られた画像の合計にドナー励起時にFRETプローブの単一分子局在化パラメータを設定し、アクセプタ放出チャネルでアクセプタ励起時のプローブのローカリゼーションパラメータを設定します。すべてのフレームでドナーとアクセプター励起にFRETプローブを局地化します。結果は、元のフレーム番号、2 次元座標、およびソース イメージ ファイルを参照する識別子を含む 1 つのテーブルにマージされます。蛍光強度を追跡および測定するには、トラックピークアルゴリズムに適切なオプションを選択して、FRETプローブのローカリゼーションを軌道にリンクします。次に、解析ソフトウェア機能を使用して、画像配列から補助画像データを処理する。励起シーケンスで S によってマークされたセグメンテーションを容易にするために記録された追加の画像を抽出します。最後に、密に標識されたサンプルに記録された画像から、視野全体のドナーおよびアクセクサ励起光プロファイルを決定します。初期のフィルタリングステップでは、それらの蛍光強度を確実に決定することが困難であるため、重なり合うポイントスプレッド機能を持つ信号を廃棄します。不均一な照明の場合、良好な信号対雑音比を確保するために、視野内の明照領域内の信号のみを受け入れます。分子内FRETを研究する場合は、画像配列の最初から存在する軌道に解析を制限する。次に、先に得られた励起光源プロファイルを使用して、不均一な照明によって生じる位置依存的蛍光強度変動を逆転させる平坦なフィールド補正を実行し、次いで、見かけのFRET効率と見かけのストイチオメトリーを計算する。単一分子プローブと凝集体を識別するための光漂白の段階的な分析を行うには、ドナーとアクセクサ励起の際に変化点検出アルゴリズムの適切なパラメータを見つけます。次に、変更点検出アルゴリズムを実行します。あいまいな光の漂白動作を示すトラックを削除するには、蛍光色素が漂白されていると見なされる強度しきい値を定義してから、次のいずれかのオプションを選択します。受付者が部分的な漂白を示さない間、アクセクター蛍光色素の漂白を一歩でするオプション1。オプション2は、ドナーが部分的なアクセクサ剤漂白がない間に一歩で漂白する。オプション3は、どちらかのフルオロフォア漂白剤を一段階で、他方は部分的に漂白しない。そして、ドナーとアクセプターフルオロフォアが単段階の光漂白または全く光漂白を示さないオプション4。次に、アクササイザチャネルへのドナー排出漏出、直接アクソシテクサ励起、検出効率、励起効率の補正係数を計算します。次に、補正係数を用いて、見かけの効率とストイチオメトリーから見かけの測定からFRET効率を算出する。さらにフィルタリングする場合は、各軌道の最初の漂白イベントの前のデータ点のみを選択します。さらに、分析を単一分子プローブに制限するには、適切なストイチオメトリー限界内のデータポイントの少なくとも75%を持つ軌道のみを受け入れます。次に、適切な補助画像に対してグローバルまたは適応しきい値法を使用して画像セグメンテーションを実行し、視野内の異なる領域に解析を制限します。効率と量乗法プロットを作成して、誤ったストイチオメトリーの信号が正しく識別され、除去されたことを確認します。次に、FRET効率のヒストグラムをプロットして、FRET効率分布の十分に確立された概要を提供し、ヒストグラムをグループ化して、異なる実験の結果を簡単に比較します。科学的なPythonライブラリを利用して、例えば拡散解析を行って、ノートブック内のデータをさらに評価することが可能です。単一分子FRETイベントの可視化と追跡を以下に示します。フィルタされたFRETイベントは、FRET効率ヒストグラムの効率とストイチオメトリープロットで表されます。さらに、移動度パラメータは、XYプロットまたは平均平方変位プロットで個々の軌道経路をプロットすることによって調べることができます。当社のプラットフォームの出力により、モバイルプローブのFRET効率時間トレースの遷移をさらに特定できます。例えば、生体分子の立体構造変化を評価する。FRETベースの力センサーを使用して、分析プラットフォームは、初期のT細胞シグナル伝達中に免疫シナプス内の単一分子力イベントを定量化することができました。

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イメージングによる二乗平均変位(iMSD)解析をマクロピノソームに適用し、構造的および動的特性の観点から、マクロピノソームの固有の時間進化的性質を強調します。次いで、マクロピノソームは、時間不変の平均構造的/動的特性を有する細胞下構造の基準として、インスリン分泌顆粒(ISG)と比較される。...

時空間変動分光法による細胞内ナノ構造のトラッキングの構造と動特性のプロービング

ここでは、共焦点顕微鏡モードで単一分子レベルでの時間分解蛍光異方性を使用して、生体分子の局所的な柔軟性とダイナミクスを研究するためのプロトコルを紹介します。...

生体分子の局所柔軟性を特徴付けるための単一分子からの時間分解蛍光異方性

学ぶ 移動する単一分子FRETプローブの二次元時空間解析法。蛍光顕微鏡を用いてFRET効率と分子位置の時間変化を測定し、生細胞内の分子力や構造動態、結合動態を解明する。

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

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