ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と免疫ブロットを使用して培養されたひと細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体の解析

青色の天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ミトコンドリア酸化リン酸化系のインタクト複合体の解析が可能です。ミトコンドリア酸化リン酸化系の複合体全体の集合体を重ね合わせることができる便利で安価な技術です。ミトコンドリア溶解物を調製するには、まず氷冷PBS溶液を使用して細胞を1回穏やかに洗浄します。

細胞を削り、摂氏4度で800Gで10分間ペレットします。その後、800Gで氷冷PBSと遠心分離機で細胞ペレットを2回800Gで10分間洗浄します。次に、200xプロテアーゼ阻害剤の200マイクロリットルをPBSの20ミリリットルに加える。

PBSプロテアーゼ阻害剤混合物中の細胞を、1ミリリットル当たり5ミリグラムの最終的なタンパク質濃度に再懸濁する。プロテアーゼ阻害剤を用いてPBSで3.3ミリモルジジトニンを調製するには、沈殿が見えないまで100°CでPBSの1ミリリットルにジジトニンの4ミリグラムを溶解する。すぐに氷の上で冷却し、100xプロテアーゼ阻害剤の10マイクロリットルをジジトニン溶液の1ミリリットルに加えます。

次に、1.65ミリモルの最終濃度でジギトニンプロテアーゼ阻害剤混合物を細胞に加えます。よく混ぜ、氷の上で5分間インキュベートします。次に、PBSプロテアーゼ阻害剤混合物を細胞に加え、最終体積1.5ミリリットルにします。

摂氏4度で10,000Gで10分間遠心分離機。上清を取り除き、ミトコンドリアバッファー内のミトコンドリアペレットを再中断します。PBS阻害剤溶液に取り付けた新鮮な10%ロレアルの1ミリリットルを調製する。

氷上で1%インキュベートの最終濃度でミトコンドリアに10%ロレアルマウントを加え、少なくとも15分間追加します。摂氏4度で20,000Gで20分間遠心分離機。上清を新しいチューブに集め、サンプルバッファーを追加します。

青色のネイティブページ用の勾配ゲルを調製するには、まず、傾斜式メーカーを攪拌プレートに配置し、柔軟なチューブを蠕動ポンプに接続します。針を入れた輸液セットをチューブに取り付けます。勾配メーカーの近位チャンバーに磁気撹拌機を入れ、最大ポンプ速度で蒸留水でチューブを10分間洗浄します。

次に、チューブと勾配メーカーを空にします。ピペットを使用して、勾配メーカーのチャンバー間のチャネル内の残った蒸留水を除去します。チャネルとチューブをバルブで閉じます。

ホルダーに2枚のガラス板を組み立て、スタンドに置きます。ゲルホルダーの底部の穴を使用して、ガラス板の間のチューブに針を接続します。8.3 x 7.3センチメートルのゲルを作るために、最初に6%と15%のゲル溶液を調製し、氷の上に保管してください。

気泡を作らないように、それらを穏やかに混ぜます。次に、勾配ゲルミキサーチューブチャンバーの近位端に6%ゲルの2.6ミリリットル、遠位端を15%ゲルの2.1ミリリットルでロードします。次に、磁気スターラーをオンにして、勾配メーカーのチャンバー間のチューブとチャネルを開きます。

直ちに蠕動ポンプを毎分5ミリリットルに切り替えます。ガラス板を満たし、チューブにゲルがない場合は針を取り除きます。ゲルを蒸留水でそっと重ね、ゲルを室温で少なくとも1時間保ちます。

勾配チャンバーを蒸留水で満たし、蠕動ポンプを最高速度で使用して、チューブを直ちに洗浄します。蒸留水6ミリリットルを3ミリリットルの3ミリリットルの3ミリリットルの3つのゲルバッファーに加え、1xゲルバッファーを作ります。ろ紙で、ゲルの表面から蒸留水を静かに取り除きます。

ゲルの表面を1xゲルバッファーで洗い、濾紙で緩衝液をそっと取り除きます。原稿に従って4%積み重ねゲルを準備する。気泡にならないように、やさしく混ぜます。

次に、ガラス板の間に櫛を置き、櫛の下に積み重ねゲルを注ぎます。櫛を完全に浸します。積層ゲルを少なくとも30分間重合させます。

その後、櫛を取り出し、ピペットを使用して1xゲルバッファーでウェルを洗浄します。青色の天然ゲル電気泳動を行うために、まず、青カソードバッファーをゲルカセットに加える。ピペットを使用して、青いカソードバッファーで井戸を洗浄し、充填します。

その後、5〜30マイクログラムのタンパク質サンプルを井戸にロードします。青いカソードバッファーを上部に、タンクにアノードバッファーをそっと充填します。まず、15分間40ボルトの定電圧でゲルを実行します。

その後、電圧を80ボルトまで上げます。染料がゲル長の2/3に達するまでゲルを実行します。青いカソードバッファーをカソードバッファーに交換し、色素前面がゲルから外れるまで電気泳動を続けます。

ガラスプレートを取り出し、半乾式ブロッティングでPVDF膜にタンパク質を移します。25ボルトの定電圧と電流を1アンペアに30分間使用してください。ヒト神経芽細胞腫細胞における呼吸鎖複合体の集合は、治療を受けずにコントロール細胞と比較してクロラムフェニコール処理時に阻害された。

対照的に、核遺伝子によってコードされる複合体は、アップレギュレートされた。酸化リン酸化錯体の分解は、複数の凍結融解サイクルで観察された。ゲルの品質は酸化リン酸化複合体の検出に影響を与える可能性があります。

また、膜の剥離は、信号対雑音比を低下させた。手順を実行する際には、OXPHOS複合体を保持するために、冷たい条件下で簡単な調製とゲル電気泳動を行うことを忘れないでください。青色のネイティブページに続いて、第2の次元SDSページを適用して、呼吸鎖複合体のタンパク質サブユニットを研究することができる。

青いネイティブページは、研究者が複合体の組立、さらには酸化リン酸化システムの超複合体を研究することができます。