分裂酵母Schizosaccharomyces pombeにおけるミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の発現と複合体集合体の解析

私たちの研究範囲はミトコンドリアタンパク質の翻訳であり、ミトコンドリア呼吸鎖複合体の翻訳と組み立てに影響を与えるメカニズムの解明を試みています。私たちの研究では、shy1が複雑な4つの注入の組み立てに参加することにより、ミトコンドリアの通常の機能の持続可能性に役割を果たしていることがわかりました。当研究室では、M=メトトレキサート注入のメカニズムを調査します。

[ナレーター]まず、Schizosaccharomyces pombeの細胞ペレットの湿潤重量を測定します。細胞を8ミリリットルのSバッファーに再懸濁します。ジチオスレイトールを最終濃度 10 ミリモルまで添加し、フッ化フェニルメチルスルホニルを 1 ミリモルまで添加し、両方の試薬が新しく調製されるようにします。溶解酵素を細胞懸濁液に添加して、Schizosaccharomyces pombeの細胞壁を消化します。シェーカーでチューブを摂氏30度で特定の溶解酵素に推奨される時間回転させます。顕微鏡を使用してスフェロプラストの形成を観察します。次に、サンプルを摂氏4度で1,000 Gで10分間遠心分離し、スフェロプラストをペレット化します。ペレットを8ミリリットルの氷冷Sバッファーに再懸濁します。2回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤を含む8ミリリットルの氷冷均質化バッファーにスフェロプラストを再懸濁します。混合物を、乳棒と試験管を含む事前に冷却されたガラスダウンホモジナイザーに移します。ぴったりとフィットする乳棒で上下に約15回ストロークすることにより、細胞を機械的に均質化します。次に、スフェロプラストを顕微鏡で調べて、膜の破損を確認します。次に、均質化された懸濁液を遠心分離管に移します。摂氏4度で1,000 Gで5分間遠心分離し、壊れていない細胞や破片をペレット化します。得られた上清を摂氏4度で3,000 Gで5分間遠心分離し、核をペレット化します。次に、上清を新しい遠心分離管に移します。12,000 Gで摂氏4度で15分間遠心分離してミトコンドリアと他の細胞小器官をペレット化し、上清をデカントした後、ペレットを1ミリリットルの氷冷ソルビトールEDTAモップバッファーに再懸濁します。その後、12,000 G、摂氏4度で再度15分間遠心分離し、ミトコンドリアを洗浄します。最終ペレットを1ミリリットルの氷冷ソルビトールEDTAモップバッファーに再懸濁します。次に、精製したミトコンドリアを将来の実験のために貯蔵チューブに分注します。SDSページでバッファーを40マイクロリットルのミトコンドリア総タンパク質にローディングします。混合物を適切な温度で指定された時間インキュベートすることにより、タンパク質を変性させます。免疫ブロッティングの前に、約20マイクログラムまたは4マイクロリットルのミトコンドリアタンパク質を12%SDSページゲルにロードします。BNページ用のサンプルを調製するには、まず遠心分離によって以前のアリコートからミトコンドリアをペレット化します。ミトコンドリアを200マイクロリットルの3つのXBNページゲルバッファーに再懸濁します。次に、2マイクロリットルの100 Xフェニルメチルスルホニルフッ化物と1マイクロリットルの1モル塩化マグネシウムをピペットで移動します。摂氏4度で12,000 Gで15分間再度遠心分離します。ミトコンドリアペレットを160マイクロリットルの5重量%のデジトラムに再懸濁します。氷上で30分間インキュベートし、10分ごとに穏やかに混合します。懸濁液を摂氏4度で20,000 Gで5分間遠心分離します。次に、上清を新しいチューブに移します。80マイクロリットルの3XBNページサンプルバッファーをデジトラム処理サンプルに加えます。または、DDM処理されたサンプルに32マイクロリットル。次に、プレキャストのネイティブBis-Trisゲルを3〜12%の勾配で組み立てます。処理されたタンパク質サンプルを、天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の高分子量タンパク質マーカーとともにロードします。0.02% Kumasi G250 を含む陰極バッファーを使用して、ゲルを 80 ボルトの定電圧と 6 ミリアンペアの電流で 30 分間実行します。バッファーをクマシを含まない陰極バッファーに交換し、色素の前面がゲルの底に到達するまで10ミリアンペアで3時間実行を続けます。タンパク質マーカーを含むゲルレーンをカットします。マーカーをKumasi R250バッファーで15分間染色します。次に、バンドが見えるまで汚れを取り除きます。ゲルの残りの部分をBNページ転写バッファーに30分間浸して平衡化します。0.45マイクロメートルのPVDFブロットメンブレンをメタノールですすぎ、転写バッファーで10分間平衡化します。 300ミリアンペアの定電流を2時間使用して、ゲルからPVDFメンブレンにタンパク質を転写します。PVDFメンブレンをメタノールですすぎ、クマシ染料を除去します。次に、5%スキムミルクを含むTBSブロッキングバッファー中でメンブレンを摂氏25度で1時間インキュベートします。PVDF膜をSchizosaccharomyces pombeミトコンドリア呼吸鎖複合体に対する指定された一次抗体とインキュベートします。摂氏4度で一晩インキュベートした後、TBSTバッファーを使用してメンブレンを洗浄します。次に、二次抗体中のメンブレンを摂氏25度で1〜10,000の希釈で1時間インキュベートします。メンブレンをTBSTバッファーで洗浄した後、PVDFメンブレンを露出してスキャンし、免疫ブロットの結果を視覚化します。shy1遺伝子の欠失は、ミトコンドリアDNAがコードする呼吸鎖タンパク質、Cob1、Cox1、Cox2、Cox3、およびAtp6の定常状態レベルを著しく低下させました。ブルーネイティブページ分析は、DG可溶化呼吸鎖スーパー複合体3242および324の存在量がデルタシャイ1細胞で減少していることを示しました。スーパー複合体32.=、および55Nのレベルは影響を受けませんでした。DDM可溶化ダイアメトリック複合体3のレベルは、Delta shy1株で変化しませんでした。