Name: サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞由来腸管オルガノイドを用いた病原体上皮侵襲モデリングとサイトカインによる修飾法。マイクロインジェクション技術で腸管感染症のメカニズム解明に貢献します。

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この作業は、ウェルカム信託、ゲイツ財団、ケンブリッジバイオメディカル研究センターからの助成金によって支えられました。E.A.L. は、ウェルカムの信頼に支えられた臨床博士課程の学生です。

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
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<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li>
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<li>Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+opportunities+of+the+IL-22-IL-22R1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).</li>
<li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+functional+interleukin-22+%28IL-22%29+receptor+complex%3A+the+IL-10R2+chain+%28IL-10Rbeta+%29+is+a+common+chain+of+both+the+IL-10+and+IL-22+%28IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor%2C+IL-TIF%29+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+phagolysosomal+fusion+to+induce+protection+against+Salmonella+enterica+Typhimurium+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).</li>
<li>Nozaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+with+intestinal+epithelial+organoids+allows+efficient+expansion+and+motility+analysis+of+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes.</a> Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).</li>
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<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
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作者は何も開示することはありません。

このプロトコルは、腸内感染をシミュレートするモデルとして、iHOs とその有用性に hiPSCs の分化を概説します。以下では、プロトコルの重要な手順と、変更または改善された点について概説します。
このプロトコルは、以前に公開された作業25と比較して hiPSCs の差別化プロセスを合理化します。以前に使用された方法は、他の hiPSC 培養系 (例えば、フィーダー依存性 hiPSC 培養物) から化学的に定義された培地-ポリビニルアルコール (CDM − PVA) への hiPSCs の移送を必要とした。CDM-PVA へのこの転送は、通常、2〜3週間かかり、hiPSCs の毎日の供給を必要とします。このプロトコルはまた、一貫して効果的ではなく、いくつかの差別化が失敗しました。したがって、我々は、同じ成長因子を用いて分化を試さ、幹細胞培養培地 (CDM-PVA ではなく) で成長した hiPSCs を開始し、分化日数 0-3 における CDM − PVA を幹細胞培養培地と交換する。これは、これまでの5つの独立した hiPSC ライン試さのために成功しており、差別化プロセスをはるかに迅速かつ効率的にしています。これはまた、hiPSCs の分化前に週末のない培養を可能にし、hiPSC 培養の柔軟性をより高めることを可能にする。この方法によって生成された iHO 線は、hiPSC 線 Kolf2、Yemz1、および Lise116について前述したように腸上皮のマーカーのために phenotyped し、前のものを使用して生成された表現型と見分けがつかないように見えるプロトコル。
播種後、iHOs は、少なくとも1ヶ月のルーチン継代を必要とし、成熟を促進するために4〜7日ごとに分割します。使用される iPSC 線と初期培養の密度に応じて、iHO の開発に多少のばらつきがあることに注意してください。最初のいくつかの継代の間に、iHOs ていない細胞を視覚的に汚染することになる。これらは最終的には死滅し、球状のクリーンな培養物を残し、約4週間後、出芽 iHOs。さらに、内部のイメージ投射システムは望ましい形態を iHOs だけ選択し、通ることを使用することができる。IHOs が成熟するにつれて、成長率と密度に応じて、6 ~ 7 日ごとに分割する必要があります。次のいずれかが発生した場合、iHOs は、このポイントの前に分割する必要があります: iHOs の管腔空洞が死んだ細胞でいっぱいに開始し、基底膜マトリックスが崩壊し始め、iHOs は基底膜マトリックスから成長し始める、または文化はあまりにも 密集しており、メディアは非常に迅速に黄色になり始めます。
いったん iHO 培養が確立されると、iHOs の出現がいつでも変化するか、または予想と異なる場合 (例えば、培養は出芽ではなく球状のままである)、みつかりを介した免疫組織化学および qPCR による細胞マーカーiHOs 内の細胞型の分化 (例えば、杯細胞、パネート細胞) が無傷のままであることを確実にするために繰り返される。IHOs がもはや分化していない場合、それらは廃棄されるべきであり、redifferentiated または iHOs のそれ以前の通過は解凍し、再構成されるべきである。IHOs が分化しなくなった場合、潜在的な原因は培養の年齢 (6 ヶ月以上前のものであれば)、成長因子の活性 (これらは製造者の指示に従って再構成されることを確認し、避けるために小さなアリコートで凍結したままである複数の凍結融解サイクル)、あまりにも頻繁または暴力的な通路 (一般的に、継代は週に1回のみ発生する必要があります、そして、iHOs が手動で、定期的にあまりにも激しく解離している場合、彼らは完全に区別するために停止します)。
我々は、upregulates に感染する前に IL-21 が 18 h 刺激することを RNA 配列により確立し、抗菌遺伝子とバリア防御表現型に関与するものを用いた。RhIL-22 (またはシステムがこれに使用されている場合は代替サイトカイン) を伴う prestimulation を含むアッセイに対して新しい iHsO を使用する前に、サイトカインによってアップレギュレートされることが知られている遺伝子の活性を確認することをお勧めします (IL-22 の場合、我々は、iHOs の刺激後に qPCR を介してDUOX2およびLCN2) を使用して、受容体発現および無傷のシグナリングを保証した。IL-22 の最初の使用に先立ち、我々はまた、IL-6 レセプターの発現が基底であったことを立証するために iHOs 上の IL −22受容体を特定するために免疫組織を実施し、prestimulation が iHO 培養に rhIL を加えることによって単純に達成できることを意味する媒体。しかしながら、受容体が apically に発現されている場合、このプロトコルはリガンド apically を送達するように適合されなければならないことがある。
微量注入システムに関する落とし穴は、一般的に注射に必要な針の繊細さに関連しています。ここでは、6μ m ルーメンで市販のドリルチップを使用しています。これは、ガラス毛細管26から注射針を引っ張ることが可能であるが、これはあまり均一ではないかもしれないが、針先端または iHOs に注入される一貫性のないボリュームからの漏出につながる。注射が染料としてフェノールレッドを使用するための一つの理由である iHO ルーメンに行われていることを確認することが重要です。iHOs は赤色の接種を視覚的に拡大して保持し、どの iHOs が注入されたかを確実にすることができます。時折針は iHO 壁から破片で詰まります。この場合は、iHO の内側から針の先端を取り外し、マイクロインジェクションシステムの [クリーン] ボタンを押します。これは、閉塞をクリアする必要があり、より高い空気圧の短い期間を生成します。それはまた、プレート上に細菌の接種のいくつかの漏れを誘導します。したがって、これが発生した場合、プレートあたりの細菌の接種の平等を確保するために、すべてのプレートにクリーンアクションを繰り返す必要があります。HiPSC 派生 iHOs の大きな利点の1つは、そのサイズです。マウスおよび初代ヒトオルガノイドからの腸管オルガノイドははるかに小さい (hiPSC 由来 iHOs のために、それぞれ27、250〜1500μ m に対して最大〜100μ m および100〜300μ m まで測定)、大量のオルガノイドの注射が遅くなることを意味する。これにより、hiPSC 由来の iHOs で大規模な射出実験を試さすることができます。また postinfection を収穫することによって iHOs の管腔内容を研究し、iHOs を手動で DPBS し、管腔内容を解放することも可能である。微量注入の場合は、高濃度の細菌を使用することをお勧めします。我々は、低濃度が iHOs を含む IECs からの応答を生成するのに十分ではなかったことを発見した。さらに、その後、顕微鏡検査を使用して内在化細菌を見つけることは困難であった。Inoculums は、異なる細菌株に対して最適化されなければならない場合がある。
要約すると、hiPSC 由来 iHOs は腸内感染症に対する上皮応答を直接解剖するための有望なモデルを提供し、細胞内浸潤カウントを研究するか、画像化、iHO 上清におけるサイトカインレベルの測定、または RNA の収穫病原体に曝露した後の転写変化を研究する。これらの有用性は、将来的にはヒトが制限された病原体の感染モデルを確立し、この技術を使用して特定の疾患関連遺伝子変異を研究することによって調査をパーソナライズする可能性を活用するためにさらに明らかになるであろうおよび薬剤の応答。

近年では、宿主病原体相互作用の研究が、様々な前駆細胞から腸上皮の3次元表現を産生することができる「オルガノイド」モデルの開発によって強化されてきた。「主要な」オルガノイドは腸のバイオプシーから収穫される腸の幹細胞から直接生成することができる。さらに、腸オルガノイドは、hiPSCs から生成することができる。多くの組織で同じことが言え、胃1、肝臓2、膵臓3、4、脳5、6、肺7、前立腺8オルガノイド病気。がん9と薬物スクリーニング10のモデリングを含む、オルガノイドシステムの多くのエキサイティングなアプリケーションがありますが、ここでは、S を使用して、感染モデルとしての iHOs の使用に焦点を当てています。サルモネラトラコマチスサルモネラ (S.サルモネラ) を例示的な病原体として、IL −22を治療として前処理する。
本研究において、iHO を生成するために用いられた hiPSCs は、健常人から生成された「Kolf2」 iPSCs、ヒト誘導多能性幹細胞イニシアティブコンソーシアム (HipSci; www.hipsci.org) から入手可能な、オープンアクセス参照パネルを特徴とするhiPSC ライン11.オルガノイドのための前駆細胞として hiPSCs を使用することの1つの利点は、現在利用可能な健康ドナー iPSC ラインの広範な銀行があります, 結果は、異なる遺伝的背景を持つ細胞株の数で検証することができることを意味.さらに、特定の疾患関連一塩基多型 (Snp) の研究を希望する場合、CRISPR/Cas9 を使用して健康な細胞株の変異をエンジニアリングし、それによって変異型ラインと isogenic を保持することができます。比較のための制御線12.私たちの経験では、hiPSC 由来の腸管オルガノイドは、それらの主要な対応物よりもサイズが大きく、培養においてより一貫性があり、より技術的に困難な微量注入を可能にし、さらに多様化する病原体の可能性を研究。iHOs は凍結に保存することができ、私たちは実験用の材料を生産するために、iHO の文化を1年まで伝播しました。
インビボでは、IECs は腸の恒常性を調節する上で重要な役割を果たし、病原体を直接阻害することがあるが、これが起こるメカニズムはよく理解されていない。このサイトカイン IL −22は、腸管上皮バリア13の維持において役割を有することが知られており、感染14に応答して抗菌ペプチドおよびケモカインの誘導および分泌に関与している。それは、活性化 T 細胞 (特に、Th17 細胞) ならびにナチュラルキラー (NK) 細胞によって生成され、22R1 および IL −10R2 サブユニット15からなる heterodimeric 受容体に結合する。IL −22の受容体は、IECs 上で肺尖に発現され、iHO モデルにおいては、培養培地16にその添加によってオルガノイドと共に rhIL を pretreat することができる。オルガノイドシステムの欠点の1つは、他の免疫細胞の種類によって通常提供される関連する免疫応答が欠けていることです。しかしながら、この17,18をより良く表現するために腸リンパ球とオルガノイドを添加 drg しようとするモデルが出現している。
微量注入システムの使用は、インビボ感染の場合に起こるように、上皮の頂端表面への病原体の直接送達を可能にするので、iHO モデルにおける感染をシミュレートするための鍵である。IHO に注入された細菌溶液へのフェノールレッドの添加は、感染したものをマークし、したがって同じ iHO の繰り返し注射を回避する。オルガノイドは、感染モデル化のための血管として使用中に成長しており、ヘリコバクター・ピロリなどの病原体、19のノロウイルス、20のロタウイルス、21の滋賀毒素産生エシェリヒア・コリ22、クリプトスポリジウム23、およびジカウイルス24は、これらのシステム内で生存し、複製することが示されました。この技術は、感染に対するヒトの上皮反応についての直接的な情報を得るために、特に原虫のような培養が困難な生物、またはヒトの制限された病原体に、より広い範囲の病原体に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>5 mm ガラス底注入皿</td><td>MatTek corporation</td><td>P50G-0-14-F</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 647 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A22287</td><td>1:1,000 濃度で使用</td></tr><tr><td>B27 無血清サプリメント</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>ストック濃度 50 倍、最終濃度 1 倍</td></tr><tr><td>BMP-4 組換えヒトタンパク質</td><td>R&D</td><td>PHC9534</td><td>ストック濃度 10 &mu;g/mL、最終濃度 10 ng/mL</td></tr><tr><td>細胞回収液(細胞リフティング液)</td><td>BD</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab120890-5mg</td><td>ストック濃度 3 mM、最終濃度 3 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、IV型粉末</td><td>ライフテクノロジー</td><td>17104019</td><td>0.1%で再構成</td></tr> <tr><td>コーニング極低温バイアル</td><td>コーニング</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC 処理 24ウェル培養プレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>DAPI二乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564-10MG</td><td>10 nM濃度で使用</td></tr><tr><td>Dulbecco'PBS(MgCl2またはCaCl2なし)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'PBS(MgCl2およびCaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-100ML</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>R&D</td><td>236-EG-200</td><td>原貨濃度 100 &mu;g/mL、最終濃度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Eppendorf TransferMan NK2 (マイクロインジェクションシステム)</td><td>Eppendorf</td><td>920000011</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtojet express&nbsp;(マイクロインジェクションシステム)</td><td>Eppendorf</td><td>5248 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex medium kit (幹細胞培養培地)</td><td>Life Technologies</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL イメージングシステム (インフードイメージングシステム)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272-10ML</td><td>ストック濃度 10 mg/mL、最終濃度 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>ヤギ抗サルモネラ菌、CSA-1</td><td>Insight Biotechnology</td><td>02-91-99</td><td>1:20 濃度で使用</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充 (setrum replacment)</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement (glutamine supplement</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>A2916801</td><td>Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Promega UK</td><td>V1201</td><td>原液濃度 50 mM、最終濃度 10&mu;M</td></tr><tr><td>Matrigel、GFR、フェノールフリー(基底膜マトリックス)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids&nbsp; solution (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>N2 serum-free supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140163</td><td>ストック濃度 10,000 U/mL、最終濃度 100 U/mL</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ピエゾドリルチップマウス ICSI、25°C; 先端角度、6 &micro;m 内径</td><td>エッペンドルフ</td><td>5195000087</td><td></td></tr><tr><td>プロスタグランジン E2</td><td>Sigma</td><td>P0409-1MG</td><td>原液濃度 2.5 mM, 最終濃度 2.5 mM</td></tr><tr><td>組換えヒトFGF 基礎</td><td>R&D</td><td>233-FB-025</td><td>ストック濃度 100 &mu;g/mL、最終濃度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>組換えヒト IL-22</td><td>R&D</td><td>6057-NG-100</td><td>ストック濃度 100 &mu;g/mL、最終濃度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>組換えヒト Noggin</td><td>R&D</td><td>6057-NG-100</td><td>ストック濃度 100 &mu;g/mL、最終濃度100 ng/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>組換えヒト R-spondin1</td><td>R&D</td><td>4645-RS-025</td><td>ストック濃度 25 mg/mL、最終濃度 500 ng/mL</td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス/ラット アクチビン A</td><td>R&D</td><td>338-AC-050</td><td>ストック濃度 100 &mu;g/mL、最終濃度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>回収細胞培養凍結培地 (cell freezing medium)</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>R2625-50MG</td><td>ストック濃度 3 &mu;M、最終濃度 3 mM</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地と Glutamax サプリメント (RPMI 培地と L-グルタミン サプリメント)</td><td>Life Technologies</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (細胞溶解バッファー)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES9690T-A101X</td><td>1% 濃度で使用</td></tr><tr><td>Versene (EDTA 溶液)</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>Stemcell Technologies&nbsp;</td><td>7180</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td>ストック濃度 3 mM、最終濃度 10 mM</td></tr></tbody></table>

サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

ヒトの腸の上皮内層を代表する3次元構造を特徴とする腸管 ' オルガノイド ' (iHO) 系は、ヒト誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) から産生され、培養において維持し、促進する刺激的な機会を提供する腸内感染症に対する上皮反応のモデル化。インビボでは、腸管上皮細胞 (IECs) は腸の恒常性を調節する上で重要な役割を果たし、病原体を直接阻害することがあるが、これが起こるメカニズムは完全には解明されていない。サイトカインインターロイキン-22 (IL − 22) は、感染に応答して抗菌ペプチドおよびケモカインの放出を誘発することを含む腸上皮関門の維持および防御において役割を果たすことが示されている。
我々は、基底膜マトリックスベースの prointestinal 培養システムに埋め込む前に、特定のサイトカインの組合せをそれらの培地に添加することによって、iHOs への健康なコントロール hiPSCs の分化を記述する。一旦埋め込まれると、iHOs は、ノギン、spondin-1、上皮成長因子 (EGF)、CHIR99021、プロスタグランジン E2、および Y-27632 dihydrochloride 一水和物を添加した培地で増殖される。IHO ultrastructure の手動破壊による週刊継代は出芽 iHOs の形成につながり、いくつかは陰窩/絨毛構造を呈する。すべての iHOs は、杯細胞、enteroendocrine 細胞、パネート細胞、および偏光 enterocytes からなる分化した上皮を示し、各細胞サブセットの特異的マーカーについて免疫染色を介して確認することができる、透過型電子顕微鏡(TEM)、及び定量 PCR (qPCR)。感染をモデル化するために、サルモネラサルモネラトラコマチスサルモネラ SL1344 をマイクロインジェクションの内腔に IHOs し、37° c で90分間インキュベートし、修飾ゲンタマイシン保護アッセイを実施して細胞内濃度のレベルを特定する。細菌の侵入。いくつかの iHOs はまた、このサイトカインがサルモネラ感染に対して保護されているかどうかを確立するために、感染前に組換えヒト IL-22 (rhIL) で前処理されている。

分化プロセスの開始後、細胞は、基底膜マトリクスに包埋する前に、最終的な内胚葉形成の段階を通過し、続いて hindgut パターニングを行うべきである。スフェロイドは、iHOs が成熟するにつれて数週間にわたって透明になり多量の混入物質を有する培養物を形成することになる。分化、埋め込み、および継代プロセスの見本画像を図 1に示す。
微量注入システムのセットアップは図 2に示す通りである。IHOs は、フェノールレッド/細菌溶液とマイクロインジェクションされ、その赤色を保持し、重複した注射を防ぐために感染した iHOs の同定を可能にします。播種された細胞内細菌の数は、修飾ゲンタマイシン保護アッセイに従って行われる。rhIL の prestimulation は S を制限します。サルモネラ感染は、rhIL 治療後に観察される細胞内細菌の減少を伴う (図 3)。また、宿主の IEC-細菌性相互作用の可視化を促進するために、感染した iHOs を免疫染色 (TEM) で日常的に処理しています (図 4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig1.jpg"> 図 1: iPSCs の分化を iHOs に誘導した。IPSCs から iHOs への分化の代表的な配列は、観察された形態変化およびこれらの変化を駆動するのに必要とされる成長因子を実証する。決定的な内胚葉は、分化の第4日目に形成され、アクチビン A、FGF、BMP −4、LY294002、および CHIR99021 の組み合わせの特定の濃度への曝露に続く。8日後、特異的濃度の CHIR99021 およびレチノイン酸を有するこの決定的な内胚葉のパターニングは、hindgut 形成をもたらす。Postembedding は、スフェロイド形成が観察される。Prointestinal 増殖因子 spondin 1、ノギン、EGF、CHIR99021、およびプロスタグランジン E2 を添加した培地と重ね合わせて支持基底膜マトリックスを用いて持続的に継代した後、スフェロイドは出芽 iHOs に進行する。(画像は4倍 ~ 10 倍の倍率で撮影しました)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2.jpg"> 図 2: Sで IHO を微量注入する。サルモネラ.(A)環境室に封入された微量注入システム (材料の表を参照してください。これは管理された環境の iHOs の注入を可能にする (37 ° c/5% の CO2)。(B) 細菌接種は、微量注入系に付着した microcapillary を用いて iHO 管腔内に直接送達される。(C) フェノールレッドと細菌 inoculums を混合することにより、どの iHOs が感染しているかは明らかであり、従って同じ iHO の重複注射を避ける。画像は10倍の倍率で撮影した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig3.jpg"> 図 3:RhIL を有する Kolf2 細胞株に由来する iHOs の前処理は、S を制限する。腸管上皮細胞への侵入を SL1344 サルモネラ。ゲンタマイシン保護アッセイについて、iHOs は、感染前に 100 ng/mL rhIL-22 18 h で処理し、未処置で放置し、90分 postinfection にインキュベートした。データは3つの生物学的反復のための3つの技術的な反復の平均± SEM である。有意性の検定では、マン・ホイットニー U 検定が使用されました。p &lt; 0.0001.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2.jpg"> 図 4: IECs と s. サルモネラ SL1344 との相互作用これらのパネルは Sと注入される iHOs を示す。サルモネラ SL1344 を3時間インキュベートし、(A) 免疫蛍光または(B) 透過型電子顕微鏡のための固定および処理に先立った。パネルAでは、細菌は iHO 内腔内に見られ、上皮と相互作用する。核は、4′、6-diamidino-2-フェニル (DAPI) dilactate (青)、ファロイジン (赤色) を有する細胞膜、及び CSA − 1 (緑色) を有する細菌で染色される。画像は20倍の倍率で撮影されています。パネルBは、侵入後のサルモネラの3つの異なる細胞内処理経路を示す。細菌はサルモネラ含有液胞の中で (a)、細胞質の中では遊離しており、(c) オートファジーを受けている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>RPMI/B27 培地</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンポーネント：</td>
			<td>量：</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルタミンサプリメントと RPMI 1640 培地</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 無血清サプリメント50x</td>
			<td>10Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>iHO ベース成長培地</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンポーネント：</td>
			<td>量：</td>
		</tr>
<tr>
<td>高度 DMEM/F12</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 無血清サプリメント50x</td>
			<td>10Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 無血清サプリメント100x</td>
			<td>5Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES 1 M</td>
			<td>5Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン 200 mM</td>
			<td>5Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>IHO ベース成長培地の成長因子</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンポーネント：</td>
			<td>量：</td>
		</tr>
<tr>
<td>組み換え型ヒト R-spondin1</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>組換えヒトノギン</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>上皮成長因子 (EGF)</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロスタグランジン E2</td>
			<td>2.5 μ m</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>3μ m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632 dihydrochloride 一水和物</td>
			<td>10μ m</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: メディアのレシピ

ヒトが誘導した多能性幹細胞 (hiPSC) 由来の腸管オルガノイドは、インビトロで腸内疾患をモデル化する刺激的な機会を提供する。我々は、腸管オルガノイド (iHOs) への hiPSCs の分化、サイトカインによるこれらの iHOs の刺激、およびサルモネラサルモネラの iHO 内腔への微量注入を示し、これによって上皮浸潤の研究を可能にする病原 体。

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

このプロトコルは、腸内病原体による上皮浸潤をモデル化するための幹細胞由来腸オルガノイド系の有用性と、サイトカインを用いたこのプロセスの改変を示す。マイクロインジェクションは、目的の病原体をオルガノイドの内腔に直接送達することを可能にし、生体内での感染のプロセスをより密接に複製する。この方法は、異なる腸内病原体または目的の代替サイトカインの研究に適用することができる。私は病原体を使用する前にマイクロ注射技術を習得するためにのみフェノールレッドで手順の試験実行を完了することをお勧めします。2日目に、培地を幹細胞培地の10ミリリットルに変えて分化を開始し、成長因子を補う。6日目に、培地をRPMI-B27培地の10ミリリットルに変更し、6つのミクロモルCHIR99021に加えて、3つのミクロモルレチノイン酸を加えて、後腸への後部内臓のパターン化を開始する。分化10日目に、後腸を基膜マトリックスに埋め込む。まず、後腸板から培地を取り出し、マグネシウムを含まないカルシウムDPPSでプレートを1回洗います。5ミリリットルのコラゲターゼ溶液をプレートに加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、オルガノイド塩基成長培地の5ミリリットルをプレートに添加することによりコラゲターゼを不活性化する。後腸細胞はこの時点で浮いているはずです。15ミリリットルの円錐管に後腸の懸濁液を集める。その後、240回Gで遠心分離機を1分間行う。遠心分離後、上清からピペットを取り除き、オルガノイドベース成長培地の10ミリリットルを加え、穏やかにピペットを行い、遠心分離機を95回Gで1分間再び遠心分離します。オルガノイド塩基成長培地中の細胞を2回洗浄する。細胞を塩基成長培地の300~500マイクロリットルに再懸濁し、この溶液の約100マイクロリットルを基底膜マトリックスの1.5ミリリットルに加える。プレートヒーターに24ウェルプレートを摂氏37度に設定します。そして24ウェルプレートの1つの井戸に後腸細胞マトリックス混合物の60マイクロリットルを見つける。簡単に設定し、顕微鏡下で密度を確認してください。マトリックスの残りの部分を24ウェルプレートに見つけた後、プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。その後、24ウェルプレートの各ウェルに成長因子を含む塩基成長培地の800マイクロリットルを加えます。オルガノイドを通過するには、まずそれらから培地を取り出し、細胞持ち上げ溶液のウェルあたり500マイクロリットルに交換します。40〜50分間摂氏4度でインキュベートし、その時点でオルガノイドが溶液中に浮かんでいるべきである。オルガノイドと細胞持ち上げ溶液を15ミリリットルの円錐形チューブにそっとピペットし、オルガノイドを分解しないようにします。オルガノイドを3〜5分間落ち着かせ、上清と単一細胞を取り除きます。オルガノイドを5ミリリットルの塩基成長培地に再懸濁し、ピペットを軽くして洗浄する。95回Gで2分間遠心分離機。次に、ボンネット内に37°Cのプレートヒーターに24ウェルプレートを設置し、オルガノイドペレットから上清を取り除きます。次いで、P1000ピペットを用いて、オルガノイドを300~500マイクロリットルの塩基性成長培地で再懸濁し、オルガノイドを小さな塊に分解する。約100マイクロリットルのオルガノイドを基体膜マトリックスの1.5ミリリットルに入れ、ピペットを短時間混ぜ合わせます。24ウェルプレートの1つの井戸に基膜マトリックスの60マイクロリットルを見つけます。30秒間固めるためにそれを残した後、顕微鏡の下で密度を確認してください。マトリックスの残りの部分を24ウェルプレートに見つけた後、プレートを37°Cのインキュベーターに10分間置き、原稿に従って成長因子を含む800マイクロリットルのベース成長培地でオーバーレイします。組換えヒトIL-22プリ刺激によるマイクロインジェクションアッセイでは、培地に組換えヒトIL-22を添加し、注射の18時間前に1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度を得る。オルガノイドを含むマイクロインジェクション皿を顕微鏡のステージに積み込み、蓋を外し、オルガノイドに焦点を当て、注射を開始する準備をします。インジェクタとアームコントロールステーションをオンにします。インジェクターが600キロパスカルの圧力と0.5秒の射出時間に設定されていることを確認します。顕微鏡の段階からまだ後退していない場合は、注入アームを回転させて確実にし、グリップヘッドを取り外します。10マイクロリットルの接種物でドリルチップをロードし、ドリルチップを鈍い端にそっと握ります。ドリルチップをグリップヘッドに入れ、マイクロインジェクションアームに再び取り付けます。マイクロインジェクション皿の上に針が1〜2センチメートルある位置に腕をそっと動かします。腕のコントロールを使用して、針先を皿の中央に配置し、メディアの表面上に置くまで下げます。すべての注射の後、この時点に針を返すようにアームコントロールステーションをプログラムします。オルガノイドに顕微鏡を集中させ、注入するターゲットを選択します。注射するオルガノイドのすぐ上と右側の針を置き、針を下方に動かしてオルガノイドの内腔に入れる。マイクロインジェクターの注入ボタンを押して、フェノール染色細菌混合物を針から出てきます。そして、各オルガノイドを3回注入します。必要なオルガノイドをすべて注入したら、マイクロインジェクションプレートをステージから取り出し、蓋を交換し、プレートを摂氏37度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、成長培地を吸引し、3ミリリットルの細胞持ち上げ溶液に交換します。その後、摂氏4度で45分間インキュベートします。次に、オルガノイドと細胞持ち上げ溶液を、5ミリリットルのDPBSを含む15ミリリットルの円錐管に静かに移動させます。370回Gで3分間遠心分離機。上清を取り除き、1ミリリットルのゲンタマイシン当たり0.1ミリグラムを含む塩基成長培地を1ミリリットル加える。次に、P1000を使用して、ピペットを約50回上下してオルガノイドを分解する。4ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で1時間インキュベートして細胞外細菌を殺す。次に、オルガノイドを370倍Gで3分間遠心分離する。上清を吸引し、できるだけ残す。オルガノイドをDPBSで一度洗い、遠心分離機をもう一度洗います。500マイクロリットルのライシスバッファーを加え、ピペットを約50回上下して手動でヒト腸器官を解約する。室温で5分間インキュベートした後、得られた溶液をDPBSで10倍に連続して希釈する。ピペット3つの20ミクロンの液滴は、事前に温められたLB寒天プレートにきちんとして希釈された溶液です。最後に、一晩摂氏37度でインキュベートし、コロニーカウントを進めます。ヒト腸器官をフェノール赤色細菌溶液でマイクロ注入した。オルガノイドによるこの赤い色の保持は、重複した注射を防ぎます。組換えヒトIL-22を用いたCOF-2細胞株由来のヒト腸器官の前処理は、S.typhimurium SL1344の腸内上皮細胞への侵入を制限する。感染したオルガノイドは、宿主IEC細菌相互作用の可視化を容易にするために、免疫染色または透過電子顕微鏡のために処理された。RNAは、感染に対するトランスクリプトーム応答を見るために注入されたオルガノイドから抽出することができる。蛍光および電子顕微鏡法はまた、宿主病原体相互作用をより詳細に観察するために使用することができる。覚えておくべきことは、マイクロインジェクターで、一貫した結果を得るために迅速かつ効率的に注射を完了できる十分な練習をしていることを確認することです。マイクロインジェクションドリルチップは細かい鋭い点を持ち、マイクロインジェクタからロードおよびアンロードする際には注意が必要です。この技術は、上皮細胞病原体の相互作用をこれまで得られなかった詳細で研究することを可能にする。この感染モデルは、ヒト固有の病原体を研究する人に特に使用される。

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

私たちは、小さな腸の陰窩からヒトの腸を、手術組織と生検の両方から採取した結腸の陰窩からコロノイドを確立する方法を説明しています。この方法論の記事では、ヒトエンテロイドとコロノイドの成長と維持を成功させるために不可欠な培養モダリティを紹介します。...

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このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。...

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本研究は、組織幹細胞由来の腸オルガノイドを用いた細菌感染の in vitro 調査方法を提示します。このプロトコルは、2次元でオルガノイドを培養・分化する方法、浸潤性大...

宿主と細菌の相互作用を研究するための侵入膜抽出物または基底膜抽出物を用いた二次元オルガノイド培養

学ぶ ヒトiPS細胞由来腸管オルガノイドを用いた病原体上皮侵襲モデリングとサイトカインによる修飾法。マイクロインジェクション技術で腸管感染症のメカニズム解明に貢献します。

サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

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