Name: 生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶ ケモカイン機能とマクロファージ挙動のin vivo解析法。Danio rerioを用いた全胚固定法とライブイメージングで、免疫応答における細胞動態をリアルタイムに観察する技術を習得できます。

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私たちは、Tg(fabp10a:DsRed)トランスジェニックラインを共有するためのジンロンペン博士に感謝します。Tg(mpeg1:GFP)トランスジェニックラインを共有するためのジロン・ウェン博士。pTol2ベクターを提供する川上浩一博士。この研究は、中国国家自然科学財団(31771594)、広東科学技術計画プロジェクト(2019A030317001)、中央大学基礎研究基金(D2191450)によって支援されました。

注:全ての試料をフェニルチオール(PTU)卵水で処理し、色素を抑制した。
1. Tgの生成 (fabp10a:il34) トランスジェニックコンストラクトと魚の注入
<ol><li>ゼブラフィッシュの2.8kb fabp10aプロモーター8およびIL-34コード領域(ENSDART0000126460.3)をpTol2ベクターにクローンし、fabp10a-il34構築物を生成する。1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)およびWT魚胚にトランスポザーゼmRNAと共に構築物を注入する。 fabp10a-il34注入されたWT胚を成人9に上げ、その場所のハイブリダイゼーションによってトランスジェニックの創始者を同定する。 注:他のトランスジェニックラインが同じトランスポゾンシステムで作られると、Tol2構築物を別のトランスジェニックに直接注入することは問題になる可能性があります。一般的なプラクティスは、独立したトランスジェニックラインを作成し、その後、別のレポーターラインと新しいラインを横断することです。これにより、以前に挿入されたトランスジーンに対する新しいトランスジェネシスの影響がないことを保証します。</li>
</ol>2. 蛍光全山インシチュアライブリゼーション(WISH)と免疫染色と組み合わせる
<ol><li>サンプル固定
	<ol>
<li>所望の段階でTg(mpeg1:GFP)と交差した一過性注射または安定なIL-34トランスジェニックラインの胚を収集する。 注:この場合、胚を4d後受精(dpf)で採取した。(必要に応じて)注射器で絨間ゾンを取り除く。</li>
		<li>胚を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩4°Cまたは室温(RT)(約25°C)で2時間固定します。</li>
		<li>胚をリン酸緩衝生理食生に加えて100(PBST)3x 5分で洗う。</li>
		<li>PBST(50%メタノール/PBST)と100%メタノール、それぞれ1x 5分で胚を別々に脱水します。その後、新鮮な100%メタノールに変更し、-20°C(少なくとも2時間)で保存します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。</li>
	</ol></li>
	<li>プローブハイブリダイゼーション(1日目)
	<ol>
<li>PBST(50%メタノール/PBST)で50%メタノールで前の工程で胚を水分補給し、PBST 3x 5分で洗浄します。</li>
		<li>RTでPBSTでプロテパナーゼKで胚を消化する(最終濃度:10 μg/mL、PBSTで1:2000)。 注:消化時間は胚の段階に依存します:36時間未満の受精後(hpf)、必要ありません。36 hpf-2 dpf胚, 3-5 分;2-3 dpf胚, 10 分;3-4 dpf胚,15分;4-5 dpf胚, 15-20 分;5-6 dpf胚, 20-27 分;>6 dpf胚、RTで25〜30分(約25°C)。</li>
		<li>消化溶液を廃棄し、RTで20分間、4%のPFAで再度固定を行います。</li>
		<li>胚をPBST 2x 10分で洗います。</li>
		<li>PBSTを廃棄し、65°Cで加熱ハイブリダイゼーションバッファ(HBバッファ)を用いてハイブリダイゼーション前に5分間行い、HBバッファを元のチューブにリサイクルする。</li>
		<li>新しい加熱HBバッファーを65°Cで少なくとも1時間でハイブリダイゼーションする前ハイブリダイゼーションを行います。</li>
		<li>プローブ9を予熱し(この場合はil34プローブ、1ng/mL)を65°Cで少なくとも10分間加熱する。次に、HB バッファを元のチューブにリサイクルします。一晩65°Cで予熱プローブでハイブリダイゼーションを行います。</li>
	</ol></li>
	<li>抗体治療(第二日目)
	<ol>
<li>50%のホルミド/2x生理食塩水ナトリウムと12en 20(SSCT)、2x SSCT、65°Cで0.2x SSCTを予熱します。</li>
		<li>プローブを元のチューブにリサイクルし、-20 °Cにプローブを保管します。</li>
		<li>50%のホルムアミド/2x SSCTで胚を別々に洗う。2x SSCT;0.2x SSCT、3x 20分または65 °Cでそれぞれ2x 30分。</li>
		<li>PBST 3x 5分で胚を洗います。</li>
		<li>600 μL のブロッキングバッファー(PBST で 5% 濾過された胎児ウシ血清(FBS))を RT で 1 時間ブロックします。</li>
		<li>抗ジゴキシゲニン-HRP抗体溶液(ブロッキングバッファーに1:1,000-1:2,000)を400μL追加し、胚を一晩4°Cでインキュベートします。シグナルが弱い場合は、1:500の抗体希釈を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>着色および一次抗体インキュベート(日III)
	<ol>
<li>抗体を取り除きます。RTでPBST、6x 20分で胚を洗浄します。</li>
		<li>RTで5分間、1xプラス増幅希釈剤の30 μLでサンプルをすすいでください。</li>
		<li>ピペッティングアウトによって希釈剤を廃棄します。希釈フルオロフォアタイラミドストックソリューション(シアニン3プラス増幅試薬(Cy3)またはシアニン5プラス増幅試薬(Cy5)、この場合Cy3を使用した場合、1xプラス増幅希釈剤で1:50を1xプラス増幅希釈剤を作り出す。各サンプルに対して50~100μLの作業溶液を準備します。</li>
		<li>RTで暗闇の中で5〜15分間、フルオロフォアタイラミドワーキングソリューションでサンプルをインキュベートします。信号が弱い場合は、インキュベーション時間を30分に延長します。</li>
		<li>PBSTで作業溶液を変更して反応を停止し、信号を調べます。</li>
		<li>RTでPBST 3x 10分で胚を洗います。</li>
		<li>一次抗体で試料を一晩4°Cでインキュベートします。この場合、ヤギ-抗GFP抗体を一次抗体として使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>二次抗体染色(IV日目)
	<ol>
<li>胚をPBSTで4x 30分間洗います。</li>
		<li>胚を二次抗体で一晩4°Cでインキュベートする。この場合、二次抗体としてAlexa 488-抗ゴート抗体を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>写真を撮る(日V)
	<ol>
<li>RTでPBST 3x 10分で胚を洗います。</li>
		<li>胚を一晩4°Cまたは-20°Cで暗く70%グリセロールに保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. ライブイメージング
<ol><li>
サンプル選択 注:ライブ画像を使用して、Tg(fabp10a:il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP)魚が3-3.5 dpfの間にIL-34誘導下で肝臓に移行するかどうかを直接観察します。 ここでは、Tg(fabp10a-DsRed)トランスジェニックラインは、肝臓領域にラベルを付け、それを可視化するために使用され、肝臓の局在化を容易にし、マクロファージが肝臓に移行するかどうかを決定する。 イメージングの前に、蛍光顕微鏡を使用してDsRedおよびGFPの二重陽性胚を選択する。</li>
	<li>
魚の取り付け
	<ol>
<li>金属風呂を使用して、1%低溶融アガロースの1mLを90°C以上に加熱し、完全に溶かします。</li>
		<li>低融解アガロースを体温まで冷却した後、0.2%トリカインの50μLを加え、トリカインとアガロースを均一に混合します。</li>
		<li>麻酔された胚を底部にカバースライドを取り付けた小皿に移動し、周囲の水を取り除き、ゆっくりと胚に低溶融アガロースを落とし、アガロースが固まる前に魚の位置を慎重に設定し、肝領域を近くに保つ皿の底のカバースライド。</li>
		<li>低溶融アガロースが固化した後、慎重にそれを補強するためにアガロースの別の層でそれをカバーします。</li>
		<li>皿を共焦点顕微鏡キャリアテーブルの上に置き、トリカインでE2溶液10で魚を覆い、イメージングを開始する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
共焦点顕微鏡のソフトウェア動作
	<ol>
<li>ZENブラック2.3ソフトウェアを開き、生きている細胞ワークベンチを顕微鏡キャリアテーブルに取り付けます。</li>
		<li>[検索]をクリックします |インキュベーション|温度を29°Cに設定する。</li>
		<li>生細胞ワークベンチの中央に皿を置き、トリカインでE2溶液10で魚を覆う。</li>
		<li>[取得]メニューをクリックし、[スマート セットアップ]メニューで必要なスキャン モードとレーザーを選択し、[Zスタックと位置]を選択します。</li>
		<li>[テスト デザイナ]メニューをクリックし、[マルチブロック実験を有効にする] を選択し、最初のブロックで低倍率の下でサンプルを見つけ、高倍率に切り替えて、視野の中央に観測領域を表示します。</li>
		<li>位置とZスタック情報を設定し、適切なレーザー強度、走査層および画像速度を選択する。</li>
		<li>新しいブロックを作成し、上記の手順を繰り返します。すべてのブロックを設定した後、適切な数のループを設定し、記録を開始します(図1)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li>
<li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045(2013).</li>
<li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li>
<li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li>
<li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. , Oxford University Press. New York. (2002).</li>
<li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここで説明するプロトコルは、マクロファージン生体内の挙動に関するケモカインの機能を調べ、手順にはいくつかの技術的専門知識を必要とします。要約すると、プロトコルの合併症を避けるためにいくつかの重要なステップがあります:1)目的の細胞にラベルを付けるために、特定の強いトランスジェニック信号を示す適切なトランスジェニックラインを選択します。2)イメージングおよびトランスジェニック遺伝子過剰発現のためにアクセス可能な適切な組織を選択します。3)敏感で特定のRNAプローブを作ります。4)セルの挙動を正確にキャプチャするために、適切な観察時間枠を選択します。
免疫染色と組み合わせたその位置ハイブリダイゼーションにおける全マウント蛍光の手順では、遺伝子発現を検出するために使用されるRNAプローブは感度が高く、シグナルは十分に強くする必要があります。細胞の挙動に関する遺伝子機能を捕捉するためには、一連の時点をテストする必要があります。例えば、マクロファージ移行に対するil34の効果を観察する上で、fabp10aプロモーターは2〜3 dpfで発現し始めたが、肝臓に...

ゼブラフィッシュは、インド発祥の小さな熱帯硬骨淡水魚です。遺伝子保全に関しては、ゼブラフィッシュはヒト1と87%の類似性を持つ。ゼブラフィッシュの遺伝子調節、タンパク質機能、細胞行動(マイブレーション、増殖et.alなどの細胞行動を研究することにより、ヒトの関連する主題に関する洞察を提供します。ゼブラフィッシュ胚は、色素を阻害した後、異なる段階で初期胚の発達を観察するために使用することができる。一方、ゼブラフィッシュが性的成熟に発展するまでに3ヶ月しかかからないうちに、ゼブラフィッシュは4日ごとに数百個の卵を産むことができる。ミニサイズ、単純な繁殖、強力な生殖能力、これらの利点は、ゼブラフィッシュ培養を非常に省スペースにし、大規模な培養に役立ちます。従来の哺乳類モデルマウスはゼブラフィッシュよりもメンテナンスコストが高いため、マウスの飼育の規模が制限されます。初期の胚の発達の側面では、マウス胚は母親の子宮におけるマウス胚の発達の特徴のために生きている状態で観察することは困難である。それどころか、ゼブラフィッシュ胚は外部から発達し透明であるため、顕微鏡下で観察しやすい。さらに、ゼブラフィッシュは、関連する遺伝子機能研究のための様々なトランスジェニックラインを構築することが非常に容易である。現在、様々なゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、異なるタイプの細胞に標識するために利用可能である。特定の場所でケモカインを過剰発現させるトランスジェニックラインを構築し、ゼブラフィッシュの細胞挙動に関するケモカイン機能を研究することは、今や非常に便利です。
ここでは、ビボ2、3、4、5、6、7におけるマクロファージ挙動に対するIL-34の機能を調べるためにゼブラフィッシュトランスジェニックラインを使用するワークフローを提供した。まず、遺伝子il34の肝臓特異的過剰発現プラスミドを構築し、蛍光タンパク質GFPによりマクロファージを特異的に標識した1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)魚胚にプラスミドを注入した。次いで、その場で蛍光マウント全体を使用し、il34発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。これらのステップでは、サイトカイン産生ラインを確立し検証し、マクロファージ分布に及ぼす影響を視覚的に評価しました。最後に、サイトカインに応答するマクロファージの挙動を調べ、共焦点ライブイメージングを用いてマクロファージ移行を直接観察し、生体内のマクロファージ移行におけるil34の機能を確認した。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-抗ヤギ抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-HRP&nbsp;</td><td>パーキネルマー</td><td>NEF832001EA</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ-抗 GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6658</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>21097</td><td></td></tr><tr><td>シアニン 3 プラス 増幅試薬</td><td>パーキネルマー</td><td>NEL745001KT</td><td></td></tr><tr><td>E2ソリューション</td><td></td><td></td><td>15 mM&nbsp;NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &micro;M&nbsp;KH2PO4 + 50 & マイクロ;M&nbsp;Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Life</td><td>10099-133</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアミド</td><td>ダイヤモンド</td><td>A100314</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>V900860</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td>シグマ</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファー(HB)</td><td></td><td></td><td>50%ホルムアミド+ 5倍;SSC+9 mM クエン酸ナトリウム+50 &mu;g/ml ヘパリンナトリウム+ 500 &mu;g/mL tRNA+ 0.1% Tween20</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Σ</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Σ</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロー</td>ス <td></td><td>Σ A9414</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>GHTECH</td><td>1.17112.023</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー&nbsp;</td><td>Σ</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Σ</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4Sigma</td><td></td> <td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ΣS5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>16 g の PFA を 1x PBS 400 ml に懸濁し、60 °C で加熱します。C&nbsp;約30分溶解します。この溶液は事前に調製し、-4°Cで保存することができます。マスクで操作します。</td></tr><tr><td>10回;PBS</td><td></td><td></td><td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td></tr><tr><td>Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>1&times;Plus Amplification Diluent</td><td>perkinelmer</td><td>NEL745001KT</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>フェルメンタス</td><td>E00492</td><td></td></tr><tr><td>20回;生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)</td><td></td><td></td><td>175.3 g NaCl+ 88.2 g クエン酸ナトリウム 1 L ddH2O, PH 7.0</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン</td><td></td><td>Sigma E10521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>シグマ</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td><td></td><td></td><td>Tg (fab10a:il34) トランスジェニック ラインジェニック ラインジェニック ラインジェニック ジェニック ライン生成</td></tr><tr><td>pBSK-il34</td><td></td><td></td><td>il34 プローブ調製</td></tr><tr><td>用Fish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg (mpeg1: GFP)</td><td></td><td></td><td>GFP</td></tr><tr><td>Tg (fabp10a: DsRed)標識</td><td></td><td></td> <td>DsRed</td></tr><tr><td>Tg (fab10a:il34)</td><td></td><td></td><td>肝細胞におけるIL-34の過剰発現</td></tr></tbody></table>

生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

ゼブラフィッシュは、基礎研究や生物医学研究で広く使用されています。多くのゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、現在、様々なタイプの細胞に標識するために利用可能です。ゼブラフィッシュの透明な胚体のために、生体内の特定のタイプの細胞の挙動に対する1つのケモカインの影響を研究することは便利です。ここでは、生体内でのマクロファージ移行に関するケモカインの機能を調べるためのワークフローを提供した。IL-34を過剰発現させる組織特異的過剰発現プラスミドを構築し、マクロファージが蛍光タンパク質によって特異的に標識された1細胞段階のトランスジェニック魚胚にプラスミドを注入した。その後、その場で蛍光全体を使用し、ケモカイン発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。最後に、共焦点ライブイメージングを用いて、安定したトランスジェニック魚のマクロファージ挙動を直接観察し、生体内のマクロファージに対するIL-34の機能を調べた。

ゼブラフィッシュのプロトコルに関与する手順を図2に示します。まず、il34がfabp10aプロモーターによって駆動されたpBLK-fabp10a-il34-sv40コンストラクトを生成した(図2)。この構築物を、トランスジェニック安定線を生成するために成人に提起したGFPおよびWT胚でマクロファージに標識できるゼブラフィッシュ胚(mpeg1:GFP)にマイクロ注入した(図2)。il34の発現は、その中の蛍光全体によって分析された(図2および図3)。GFPによって標識されたマクロファージを免疫染色により分析した(図2および<stro...

生体内でのマクロファージ募集に対するケモカインの効果を試験するために、その位置ハイブリダイゼーション中のマウント全体を使用してケモカインの異所性発現を検出し、免疫染色を用いてマクロファージの標識を行った。ライブイメージングは、マクロファージ移行のリアルタイム観察に使用されました。

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

ここで説明するプロトコルは、ケモカインの機能とin vivoでのマクロファージの挙動を調べることができます。細胞の細胞の既存の実験モデルのほとんどは、インビトロ細胞実験に基づいています。しかし、インビトロ実験は、時には複雑な環境をvivoでモデル化するには単純すぎることがあります。また、生体内の化学引き上げ能力を表さない場合もある。これらの方法は、マウスにとって困難である直接細胞行動観察のためにシマウマ魚の特定の利点を利用する。TGFABP-10A インターロイキン-34 トランスジェニックコンストラクトを生成して開始します。.FABP-10Aインターロイキン-34コンストラクトをトランスジェニックなTg(mpeg1:GFP)トランスジェニックおよび野生型魚の胚にトランスポザーゼMRNAと一緒に注入します。原稿の指示に従って胚を上げて収集します。その後、摂氏4度または室温で2時間一晩4%パラホルムアルデヒドでそれらを固定します。固定後、PBSTで胚を洗浄ごとに5分間3回洗浄します。胚をPBSTで50%メタノールで別々に脱水し、続いて100%メタノールを脱水し、次いで新鮮な100%メタノールに変え、少なくとも2時間はマイナス20°Cで保存する。プローブハイブリダイゼーションの準備ができたら、胚をPBSTで50%メタノールで別々に再水和する。その後、PBSTで1回5分間3回洗浄します。室温でPBSTでプロテアーゼKで胚を消化する。次いで、消化液を廃棄し、室温で20分間4%パラホルムアルデヒドで固定を繰り返した。固定後、1回の洗浄で10分間PBSTで胚を2回洗浄します。65°Cの加熱ハイブリダイゼーションバッファを少なくとも1時間プリハイブリダイゼーションします。その後、インターロイキン-34プローブを摂氏65度に予熱し、10分間加熱します。ハイブリダイゼーションバッファーを元のチューブにリサイクルし、予熱プローブを摂氏65度で一晩でハイブリダイゼーションを行います。翌日、胚を50%ホルムアミドと2X SSCTで洗い、続いて2倍のSSCTを、次に摂氏65度で0.2X SSCTを洗浄します。各洗浄を1回20分で3回繰り返します。その後、1回の洗浄につき5分間PBSTで胚を3回洗浄する。室温で1時間のブロッキングバッファーの600ミリリットルでサンプルをブロックします。その後、抗ジゴキシゲニンHRP抗体溶液の400マイクロリットルを追加し、一晩摂氏4度で胚をインキュベートします。翌日、抗体を取り除き、PBSTで6回、洗浄ごとに20分間洗浄します。最後の洗浄後、各サンプルを30マイクロリットルの1Xプラス増幅希釈液で5分間洗い流します。フルオロフォア・チラミンの働く溶液中のサンプルを暗闇の中で5~15分間インキュベートします。信号が弱い場合はインキュベーション時間を30分に延長する。次いで、PBSTで1回10分間、胚を洗浄します。そして、一晩摂氏4度で一次抗体でそれらをインキュベートします。翌日、PBSTで5回洗浄して1回30分間洗浄し、一晩摂氏4度で二次抗体でインキュベートする。翌日、PBSTで1回10分間胚を3回洗い、暗闇の中で摂氏4度またはマイナス20度のグリセロールに長く保管します。画像化の前に、蛍光顕微鏡を使用してDS赤およびGFPの二重陽性胚を選択してください。魚を取り付けるには、金属浴を使用して1%低融解アガロースの1ミリリットルを摂氏90度以上に加熱します。その後、体温に冷却し、0.2%トリケーヌの50マイクロリットルで混合します。麻酔した胚を底面にカバースライド付きの小皿に移します。周囲の水を取り除き、ゆっくりと胚に低融解アガロースを落とします。アガロースが固まる前に魚の位置を慎重に設定し、肝臓領域をカバースライドの近くに保ちます。アガロースが固まったら、それを補強するためにアガロースの別の層で慎重に覆います。コンフォーカル顕微鏡キャリアテーブルに皿を置き、トリカインでE2溶液で魚を覆い、イメージングを開始します。共焦点顕微鏡を操作するには、Zen Black 2.3ソフトウェアを開いて[位置指定]をクリックし、インキュベーションを行い、温度を摂氏29度に設定します。取得メニューをクリックし、スマートセットアップメニューで必要なスキャンモードとレーザーを選択します。次に、Z スタックと位置を選択します。実験用デザイナーメニューをクリックし、最初のブロックでマルチブロック実験を有効にして、低倍率でサンプルを見つけます。次に、高倍率に切り替え、視野の中央に観察領域を入れましょう。位置とZスタック情報を設定します。次に、適切なレーザー強度、走査層、および撮像速度を選択します。すべてのブロックが設定されたら、適切なループ数を設定し、記録を開始します。このプロトコルは、GFPで標識されたマクロファージであるトランスジェニック魚の胚に発現プラスミドを介して肝臓特異的インターロイキン-34を注入するために使用された。フルマウント蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーションおよび免疫染色で使用し、インターロイキン-34およびGFP標識マクロファージの発現を解析した。マクロファージ細胞数を未注入で定量的に分析し、注入された胚の肝臓および尾領域を構築した。ライブイメージングは、緑色とラベル付けされたマクロファージを直接観察し、対照魚の肝臓を通過し、魚を発現する上でインターロイキン-34の肝臓に移行するために使用されました。このプロトコルの重要なステップは、関心のある細胞にラベルを付けるために適切なトランスジェニックラインの選択を含む。そして、トランスジェニック遺伝子の発現を画像化するための適切な組織と同様、適切な観察時間枠。この技術は、生体内のT細胞および好中球のような他の細胞の挙動に関する他のケモカインの機能を研究するために適用することができる。

an-ectopic-chemokine-expression-model-for-testing-macrophage

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、蛍光ベースのトランスウェルマクロファージ相互作用アッセイを使用して、腫瘍とマクロファージの相互作用を研究しています。このアッセイには、化学的に誘発された走化性によるマクロファージの移動の解析が含まれます。...

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リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

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生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

この記事は、マクロファージを引き付けるために腫瘍細胞から条件付き培地の能力を評価するのに有用なインビトロアッセイを表す。...

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

ここで提示するプロトコルは、顕微鏡法および蛍光染色を用いて生細胞培養におけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)産生を検出するプロトコルである。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって特異的なMETタンパク質マーカーを調べるためにさらに拡張することができる。...

分化ヒト単球由来マクロファージにおける細胞外トラップ放出のIn Vitro刺激と可視化

ここでは、C5a勾配を化学戦術補体で画像マウス常駐腹膜マクロファージにタイムラプス、位相コントラスト顕微鏡を用いた方法について説明する。プロトコルは、他の免疫細胞に拡張することができます。...

マウスマクロファージ・ケモタクシスのタイムラプスイメージング

ここでは、3次元(3D)コラーゲンIマトリックス中の初代ヒト単球由来マクロファージと腫瘍スフェロイドとの相互作用を調査するためのプロトコルを提示し、微小環境の可溶性および物理的特性が細胞浸潤に与える影響を比較する可能性を示します。...

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

単球とマクロファージは、健康と病気に不可欠な非常に可塑的で再プログラム可能な免疫細胞です。彼らは、特定の分化プログラムと表現型を採用することにより、幅広い刺激を感知し、反応します。私たちは、マクロファージの分極とリプログラミングを研究するためのin-vitroモデルを標準化し、研究に貴重なツールを提供しています。...

In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

ヒトCARTと骨髄細胞の間の相互作用を研究するために利用できる異種移植モデルが限られていることを考慮して、CART細胞に対するヒトマクロファージの影響を理解するために、 in vitro および in vivo...

骨髄細胞とCAR T細胞間の相互作用のin vitroおよびin vivoの研究

学ぶ ケモカイン機能とマクロファージ挙動のin vivo解析法。Danio rerioを用いた全胚固定法とライブイメージングで、免疫応答における細胞動態をリアルタイムに観察する技術を習得できます。

生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル

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