In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

私たちの研究では、単球とマクロファージの系統を調査し、その優れた可塑性と、炎症、組織修復、および感染中のエフェクター応答を形成するために環境からの複数のシグナルを統合する能力を強調しました。マクロファージは全身に存在し、自然免疫と適応免疫の開始と解決を調整し、防御免疫と免疫介在性の病理に影響を与えます。マクロファージのリプログラミングは、この分野で最も有望な特徴です。

新興のオミクス技術は、マクロファージ生物学の理解に革命をもたらし、マクロファージの表現型の多様性、機能特性、プログラミングの可能性、およびこれらの細胞の発生起源に関する洞察をもたらしました。マクロファージの分化と分極を発見する際の主な障害と落とし穴は、文献全体の実験条件とプロトコルが不均一であること、およびマクロファージ用語の定義におけるコンセンサスの欠如です。マクロファージの分極に対する薬物および脂質メディエーターのリプログラミング効果を実証し、マクロファージと膠芽腫細胞との間の相互作用の3Din vitroモデルを開発します。

さらに、血小板が単球由来マクロファージの分化をN1表現型にライセンスすることを示しました。まず、抗凝固した末梢血サンプルを遠心分離機に入れます。室温で200Gに15分間回転させます。

上部に多血小板血漿、下に赤血球と白血球を含む細胞画分の分離を観察します。最初の遠心分離から得られた細胞画分を、室温に予め加温した滅菌PBSで希釈します。Ficoll-Hypaque密度グラジエント遠心分離に進む前に、溶液を穏やかにホモジナイズしてください。

15ミリリットルのFicoll-Hypaqueを滅菌15ミリリットルのチューブに移します。30ミリリットルの希釈した血液をFicollの上に慎重にゆっくりと加え、相間の混合を最小限に抑えます。Ficollと希釈した血液を600Gで含んだチューブを室温で25分間遠心分離します。

滅菌済みの3ミリリットルパスツールピペットで、黄色の最上層の一部を取り除きます。黄色の層とFicoll層の間の界面を滅菌パスツールピペットで慎重に収集します。採取した末梢血単核細胞(PBMC)を、少なくとも3ミリリットルの滅菌PBSを含む新しい15ミリリットルのチューブに移します。

滅菌PBSをチューブに補充して、総容量が12〜15ミリリットルになるようにします。次に、サンプルを600Gで10分間遠心分離します。次に、PBMCサスペンションを300Gで8〜10°Cで5分間スピンダウンします。

細胞を所望量の滅菌冷PBSに2%FBSで再懸濁します。次のステップまで、セルを摂氏4度に保ちます。所望の量のPBMC懸濁液を5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに移します。

次に、細胞懸濁液100マイクロリットルごとに10マイクロリットルのポジティブセレクションカクテルを追加します。懸濁液を完全に混合してから、室温で15分間インキュベートします。次に、細胞懸濁液100マイクロリットルあたり10マイクロリットルの磁性ナノ粒子をピペットで吸う。

磁性ナノ粒子の均一な懸濁を確保するために、5回以上激しく上下にピペットを動かします。室温で10分間インキュベートした後、FBSとEDTAを含むPBSを懸濁液に加えて、総容量を2.5ミリリットルにします。細胞を2〜3回ゆっくりと上下させます。

チューブをマグネットソーターに挿入し、5分間放置します。磁石をチューブと一緒に反転させ、1回の連続動作で反転させます。磁石とチューブを2〜3秒間逆さまにしてから、直立位置に戻します。

チューブを磁石から取り外し、2.5ミリリットルのPBS-FBS-EDTAバッファーを再度チューブに追加します。細胞懸濁液を2〜3回上下に静かにピペットで動かして混合します。チューブを磁石に戻し、5分間離して置きます。

1回の連続動作で、磁石とチューブを再度反転させ、上清画分を破棄します。チューブを磁石から取り外し、EDTAを含まないPBS-FBSの適切な容量に細胞を再懸濁します。これで、正に選択されたセルを使用する準備が整いました。

次に、選別したCD14細胞にPBS-FBSバッファーを追加し、総容量を12〜14ミリリットルにして、残りのEDTAを希釈します。600Gで10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、陽性で選択したCD14単球を2ミリリットルのPBS-FBSバッファーに再懸濁します。

自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。培養準備まで細胞を氷上に保ちます。培養するには、ペレットを1ミリリットルあたり100万細胞の濃度で補充したRPMI 1640培地に再懸濁します。

調製した細胞懸濁液250マイクロリットルを48ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。マクロファージコロニー刺激因子1ミリリットルあたり50ナノグラムを含む250マイクロリットルの抗生物質添加RPMI培地を各ウェルに加えます。加湿インキュベーターで細胞培養プレートをインキュベートし、マクロファージの分化を開始します。

マクロファージ分化の4日目に、各ウェルの培地の半分を交換します。所望の分極条件のサイトカインまたは試薬を添加し、さらに3日間培養を続けます。表現型の特徴付けのために、7日目にマクロファージ由来の単球を採取します。

インターフェロンγプラスリポ多糖によって誘導されたM1マクロファージは、CD64の発現が最も高く、CD206が欠如し、CD163とMERTKのレベルが低いことを示しました。インターロイキン4により誘導されるM2aマクロファージは、CD206の発現が増加し、CD64、CD163、およびMERTKの発現が低下することを特徴としていた。インターロイキン10またはデキサメタゾンにより誘導されたM2cマクロファージは、CD163およびCD14の発現増加、CD64の中間レベル、およびMERTK発現の増加を示した。