マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

私たちは、がん細胞と免疫細胞の相互作用を調査し、転移時にそれらがどのように相互作用するかをより深く理解したいと考えています。ほとんどの場合、in vivoモデルは、免疫系の文脈でがん細胞の3D浸潤に関する研究課題を追求するための日常的な方法であり、またはシステムの孤立したコンポーネントに焦点を当てています。この方法は、in vivoの状況の複雑さを模倣しながら、顕微鏡下で特定の環境特性をより直接的に操作できる細胞挙動の解析を可能にします。

私たちは、未改変のがん細胞が、モータータンパク質KIF16Bのために枯渇したマクロファージと一緒に共培養されると、3DコラーゲンIマトリックスへの浸潤を減少させることを示しています。これは、腫瘍微小環境におけるマクロファージ表面タンパク質のKIF16B駆動型リサイクルの役割を示しています。マクロファージがん細胞の界面におけるマトリックス分解を可視化し、分解メカニズムや接着メカニズムの理解を深めることができるよう、この手法を引き続き強化していきたいと考えています。

まず、H1299 GFP細胞をがん細胞培地で、摂氏37度の25平方センチメートルの細胞培養フラスコで、5%の二酸化炭素で80%のコンフルエントに達するまで培養します。細胞をDPBSで一度洗浄し、細胞が剥離するまで1ミリリットルのトリプシン-EDTAを2〜3分間加えます。2ミリリットルのがん細胞培地を添加して酵素反応を停止します。

次に、分離した細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに入れ、245Gで5分間遠心分離します。ペレットを5ミリリットルのDPBSで洗浄する前に、トリプシン溶液を含む上清を取り除きます。.遠心分離後、ペレットを5ミリリットルのがん細胞培地に再懸濁します。

ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントします。8, 000個の細胞を96ウェルの超低接着プレートに移し、最終容量は25マイクロリットルのがん細胞培地にします。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で3日間インキュベートします。

3日後、顕微鏡でスフェロイドの均一性を確認します。ヒトの血液サンプルを採取した後、輸血バッグから20ミリリットルの血液を50ミリリットルの反応チューブに移します。15ミリリットルのリンパ球分離培地を新しい50ミリリットルのチューブに加えます。

20ミリリットルの血液を混合せずにリンパ球分離培地含有チューブに慎重に移し、混合物を450Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離中に、10ミリリットルの冷たいRPMI 1640ミディアムを新しい50ミリリットルのチューブに加えます。遠心分離後、緻密な白色相を血液含有チューブから調製したRPMI含有チューブに移し、それに冷たRPMIを最大50ミリリットル充填します。

懸濁液を450Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10ミリリットルの冷たいRPMIに再懸濁し、RPMI 1640で最大50ミリリットルまで充填します。混合物を再度遠心分離し、ペレットを50ミリリットルのRPMIに再懸濁します。

再度、サンプルを遠心分離し、細胞ペレットを1.5ミリリットルの冷たい単球緩衝液に再懸濁します。次に、細胞懸濁液に250マイクロリットルの抗CD14マイクロビーズを加え、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、マグネティックセパレーターラックにフィルターを取り付けて分離カラムを調製します。

900マイクロリットルの単球バッファーをカラムに加え、平衡化します。インキュベーション後、細胞懸濁液をフィルターに注ぎ、重力によって廃液チューブに流入させます。1ミリリットルの単球バッファーを添加して、磁気ビーズに結合した細胞を含むカラムを洗浄します。

カラムの下の廃液チューブを、20ミリリットルのRPMIを含む新しい50ミリリットルのチューブと交換します。カラムに3ミリリットルの単球バッファーを加えます。マグネティックラックからカラムを取り外し、スタンプを取り付けます。

調製した50ミリリットルのチューブにセルを押し込み、RPMIで最大30ミリリットルまで充填します。光学顕微鏡でノイバウアー計数チャンバーを使用して細胞をカウントし、RPMIを使用して細胞数を10の2倍に調整し、1ミリリットルあたり6細胞の累乗にします。1ミリリットルの細胞懸濁液を6ウェルチャンバーの各ウェルに播種し、5%の二酸化炭素と摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞が適切に接着したかどうかを確認し、RPMIを1.5ミリリットルのモノメディウムと交換します。単球がマクロファージに分化するまで、最大6日間インキュベーションを続けます。6ウェルプレート中のドナー血液サンプルからヒトマクロファージの初代マクロファージを導出した後、500マイクロリットルのアキュターゼを加え、40分間インキュベートしてマクロファージを分離します。

次に、500マイクロリットルの培地を追加し、15ミリリットルの遠心分離チューブに移して遠心分離します。次に、細胞を2ミリリットルのDPBSで1回洗浄し、ノイバウアーチャンバーでカウントします。I mixした40マイクロリットルのコラーゲンで必要な数のマクロファージを希釈し、チューブを短時間ボルテックスします。

スフェロイドを洗浄するには、300マイクロリットルのDPBSを96ウェルプレートのウェルに加えます。端がカットされた1ミリリットルの青いピペットチップを使用して、DPBSでステロイドを収集します。ステロイドが先端に落ち着いたら、ピペットをイメージングチャンバーの底に短時間押して、表面張力によって腫瘍ステロイドを転写します。

ステロイドで転写された残留DPBSをできるだけ多く除去します。ステロイドを含むイメージングチャンバーに40マイクロリットルのコラーゲンIマクロファージミックスを迅速に追加します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートし、コラーゲンミックスを完全に重合させます。

重合後、各ウェルに25マイクロリットルのがん細胞培地を慎重に加え、3日間インキュベーションを続けます。レーザー走査型顕微鏡を使用して、目的の時点でライブサンプルを画像化します。H1299 GFP回転楕円体の面積は、侵入の3日目に40,307平方メートルと測定されましたが、回転楕円体の周囲は1700.17マイクロメートルであることが判明し、時間の経過とともに成長していることを示しています。

スフェロイドからのがん細胞の集団浸潤が観察され、51の孤立粒子が同定され、個々のがん細胞の浸潤の指標として役立った。回転楕円体はアスペクト比1.10、真円度0.18を維持し、変形が少ないことを示しています。