Name: マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶマクロファージと腫瘍スフェロイドの3D共浸潤アッセイ。コラーゲンIマトリックス中でKIF16B欠損マクロファージががん細胞浸潤を抑制する機構を解析し、腫瘍微小環境における免疫細胞の役割を解明する方法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>3Dコラーゲンマトリックスセットアップにおけるマクロファージ-腫瘍スフェロイド相互作用の検討

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 &micro;-スライド血管新生&nbsp;</td><td>同上</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ファロイジン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>バインダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIラットテール&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio&セル</td><td>FBS。S 0613</td><td></td></tr><tr><td>フィジー&nbsp;</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2バージョン:2.3.0 / 1.53s</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド37%&nbsp;</td><td>252549-500ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>H1299-GFP細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843</td><td></td></tr><tr><td>ライカ TCS SP8 X</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>リンパ球分離培地 (LSM) 1077</td><td>PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>ペン 溶連菌</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 Well, BIOFLOAT, R&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2&nbsp;</td><td>科学産業</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

図1は、コラーゲンIマトリックス中でのインキュベーションのそれぞれの日に画像化されたH1299-GFPスフェロイドを示しています。0日目に撮影されたそれぞれの明視野画像も、スフェロイドと共培養された主要なヒトマクロファージを示しています。実験3日目に記録された代表的な画像は、処理後に拡大されます。侵入細胞の数、集団侵入の場所、スフェロイドの境界など、分析可能なさまざまなパラメーターが示されています。含まれている表は、この画像から得られた結果を示しています。検出された信号の数は、視覚的な印象と一致します。中央のスフェロイドの破壊は見られず、スフェロイドの破片に由来する細胞ではなく、実際の個々のがん細胞の浸潤を示しています。さまざまなスフェロイドと条件の結果は、統計分析によって比較できるようになりました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg"> 
図1:代表的な結果( 上段)コラーゲンIマトリックス中でのインキュベーションの0日目、1日目、2日目、3日目にH1299-GFPスフェロイドを画像化。(左中段)共培養された初代ヒトマクロファージを示すスフェロイドの明視野画像。(中央右パネル)3日目に取得した代表的な画像を処理後に拡大し、分析可能なさまざまなパラメーターを示しています(回転楕円体の周囲を赤で表示、視覚化のために手動でトレースしています)。(底面パネル)右中央パネルの画像から得られた結果。注:がん細胞の挙動を解明するためにGFPチャネルのみが記録されているため、マクロファージは見えません。スケールバー:100μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

私たちは、がん細胞と免疫細胞の相互作用を調査し、転移時にそれらがどのように相互作用するかをより深く理解したいと考えています。ほとんどの場合、in vivoモデルは、免疫系の文脈でがん細胞の3D浸潤に関する研究課題を追求するための日常的な方法であり、またはシステムの孤立したコンポーネントに焦点を当てています。この方法は、in vivoの状況の複雑さを模倣しながら、顕微鏡下で特定の環境特性をより直接的に操作できる細胞挙動の解析を可能にします。私たちは、未改変のがん細胞が、モータータンパク質KIF16Bのために枯渇したマクロファージと一緒に共培養されると、3DコラーゲンIマトリックスへの浸潤を減少させることを示しています。これは、腫瘍微小環境におけるマクロファージ表面タンパク質のKIF16B駆動型リサイクルの役割を示しています。マクロファージがん細胞の界面におけるマトリックス分解を可視化し、分解メカニズムや接着メカニズムの理解を深めることができるよう、この手法を引き続き強化していきたいと考えています。まず、H1299 GFP細胞をがん細胞培地で、摂氏37度の25平方センチメートルの細胞培養フラスコで、5%の二酸化炭素で80%のコンフルエントに達するまで培養します。細胞をDPBSで一度洗浄し、細胞が剥離するまで1ミリリットルのトリプシン-EDTAを2〜3分間加えます。2ミリリットルのがん細胞培地を添加して酵素反応を停止します。次に、分離した細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに入れ、245Gで5分間遠心分離します。ペレットを5ミリリットルのDPBSで洗浄する前に、トリプシン溶液を含む上清を取り除きます。.遠心分離後、ペレットを5ミリリットルのがん細胞培地に再懸濁します。ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントします。8, 000個の細胞を96ウェルの超低接着プレートに移し、最終容量は25マイクロリットルのがん細胞培地にします。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で3日間インキュベートします。3日後、顕微鏡でスフェロイドの均一性を確認します。ヒトの血液サンプルを採取した後、輸血バッグから20ミリリットルの血液を50ミリリットルの反応チューブに移します。15ミリリットルのリンパ球分離培地を新しい50ミリリットルのチューブに加えます。20ミリリットルの血液を混合せずにリンパ球分離培地含有チューブに慎重に移し、混合物を450Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離中に、10ミリリットルの冷たいRPMI 1640ミディアムを新しい50ミリリットルのチューブに加えます。遠心分離後、緻密な白色相を血液含有チューブから調製したRPMI含有チューブに移し、それに冷たRPMIを最大50ミリリットル充填します。懸濁液を450Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10ミリリットルの冷たいRPMIに再懸濁し、RPMI 1640で最大50ミリリットルまで充填します。混合物を再度遠心分離し、ペレットを50ミリリットルのRPMIに再懸濁します。再度、サンプルを遠心分離し、細胞ペレットを1.5ミリリットルの冷たい単球緩衝液に再懸濁します。次に、細胞懸濁液に250マイクロリットルの抗CD14マイクロビーズを加え、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、マグネティックセパレーターラックにフィルターを取り付けて分離カラムを調製します。900マイクロリットルの単球バッファーをカラムに加え、平衡化します。インキュベーション後、細胞懸濁液をフィルターに注ぎ、重力によって廃液チューブに流入させます。1ミリリットルの単球バッファーを添加して、磁気ビーズに結合した細胞を含むカラムを洗浄します。カラムの下の廃液チューブを、20ミリリットルのRPMIを含む新しい50ミリリットルのチューブと交換します。カラムに3ミリリットルの単球バッファーを加えます。マグネティックラックからカラムを取り外し、スタンプを取り付けます。調製した50ミリリットルのチューブにセルを押し込み、RPMIで最大30ミリリットルまで充填します。光学顕微鏡でノイバウアー計数チャンバーを使用して細胞をカウントし、RPMIを使用して細胞数を10の2倍に調整し、1ミリリットルあたり6細胞の累乗にします。1ミリリットルの細胞懸濁液を6ウェルチャンバーの各ウェルに播種し、5%の二酸化炭素と摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞が適切に接着したかどうかを確認し、RPMIを1.5ミリリットルのモノメディウムと交換します。単球がマクロファージに分化するまで、最大6日間インキュベーションを続けます。6ウェルプレート中のドナー血液サンプルからヒトマクロファージの初代マクロファージを導出した後、500マイクロリットルのアキュターゼを加え、40分間インキュベートしてマクロファージを分離します。次に、500マイクロリットルの培地を追加し、15ミリリットルの遠心分離チューブに移して遠心分離します。次に、細胞を2ミリリットルのDPBSで1回洗浄し、ノイバウアーチャンバーでカウントします。I mixした40マイクロリットルのコラーゲンで必要な数のマクロファージを希釈し、チューブを短時間ボルテックスします。スフェロイドを洗浄するには、300マイクロリットルのDPBSを96ウェルプレートのウェルに加えます。端がカットされた1ミリリットルの青いピペットチップを使用して、DPBSでステロイドを収集します。ステロイドが先端に落ち着いたら、ピペットをイメージングチャンバーの底に短時間押して、表面張力によって腫瘍ステロイドを転写します。ステロイドで転写された残留DPBSをできるだけ多く除去します。ステロイドを含むイメージングチャンバーに40マイクロリットルのコラーゲンIマクロファージミックスを迅速に追加します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートし、コラーゲンミックスを完全に重合させます。重合後、各ウェルに25マイクロリットルのがん細胞培地を慎重に加え、3日間インキュベーションを続けます。レーザー走査型顕微鏡を使用して、目的の時点でライブサンプルを画像化します。H1299 GFP回転楕円体の面積は、侵入の3日目に40,307平方メートルと測定されましたが、回転楕円体の周囲は1700.17マイクロメートルであることが判明し、時間の経過とともに成長していることを示しています。スフェロイドからのがん細胞の集団浸潤が観察され、51の孤立粒子が同定され、個々のがん細胞の浸潤の指標として役立った。回転楕円体はアスペクト比1.10、真円度0.18を維持し、変形が少ないことを示しています。

a-macrophage-tumor-spheroid-co-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

このビデオでは、腫瘍スフェロイドとT細胞の三次元共培養を確立する方法を示します。腫瘍スフェロイドを含むマイクロウェルを有するアガロースキャストを調製し、続いてT細胞を添加する。インキュベーション後、このセットアップにより、制御された3次元環境でT細胞と腫瘍スフェロイドとの相互作用を研究することができます。...

腫瘍スフェロイドにおける浸潤T細胞の三次元共培養モデル

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

癌の悪性挙動を理解するには、腫瘍細胞がマクロファージなどの腫瘍微小環境の構成要素とどのように相互作用するかについての正確なモデルを作成する必要があります。ここでは、膠芽腫細胞と腫瘍関連マクロファージおよびミクログリアとの相互作用を研究するための2つの方法について説明し、膠芽腫の浸潤への影響が評価されます。...

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro...

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

この記事は、マクロファージを引き付けるために腫瘍細胞から条件付き培地の能力を評価するのに有用なインビトロアッセイを表す。...

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

ここでは、腫瘍細胞が免疫応答を抑制するために使用する非接触パラクリンシグナル伝達の研究を容易にするために透過性膜支持体を用いる方法を提示する。このシステムは、マクロファージ活性化を減衰させる腫瘍分泌因子の役割を研究することに適している。...

透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。...

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

学ぶマクロファージと腫瘍スフェロイドの3D共浸潤アッセイ。コラーゲンIマトリックス中でKIF16B欠損マクロファージががん細胞浸潤を抑制する機構を解析し、腫瘍微小環境における免疫細胞の役割を解明する方法です。

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

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