Name: 患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぶ前立腺癌骨転移患者由来3Dオルガノイド培養法。ドーミング技術を用いて限られた材料から腫瘍異質性を維持したモデルを樹立し、病態解析や治療薬スクリーニングに応用する方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、レオとアンアルバート慈善財団とJM財団によって支援されました。カリフォルニア大学サンディエゴ・ムーアズがんセンターのメンバー、ジンヤン博士、ケイ・T・ヨン博士は、マイクロトームとランドール・フレンチ外科部の技術的専門知識を利用してくれたことに感謝します。

この研究は、カリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)機関審査委員会(IRB)のガイドの勧告に厳密に従って行われました。IRB #090401承認は、UCSD機関審査委員会(IRB)から、研究目的で患者から外科検体を収集するために受け取りました。各患者からインフォームド・コンセントを得て、手術骨前立腺癌転移標本は大腿骨の病的骨折の整形外科修復から得られた。動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)の動物福祉および制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が#S10298承認されたプロトコルの下で行われました。機械的および酵素的に解離した患者腫瘍組織からの細胞は、前に説明したように6〜8週齢の雄Rag2-/-γc-/-マウスに大腿内注射した。異種移植片腫瘍体積は、生体内生物発光イメージングシステムおよびキャリパー測定を用いて決定した。2.0cmまでの腫瘍増殖(IACUCによって承認された最大許容サイズ)に、腫瘍は3Dオルガノイドの確立のために収穫された。
注:図1は、実験手順の各ステップに対して3Dオルガノイドとプロトコル番号を確立するためのワークフローを示しています。
1. 患者由来異種移植片(PDX)腫瘍組織の処理
注:これは、異種移植片マウスモデルに由来する腫瘍のオルガノイド確立のための最初のステップです。このプロトコルは、Drostら5によって以前の出版物から適合され、我々はオルガノイド培地に血清補充を含むように培地条件を変更しました。
<ol><li>腫瘍標本を以下に記載する方法で処理する。<ol>
<li>1-3 mm3サイズの断片に腫瘍サンプルをミンチし、室温で45分間細胞解離液10mLでサンプルを消化します。</li>
		<li>消化を終了するには、サンプルに20 mLのDMEM完全なメディアを追加します。</li>
		<li>70 μmの細胞ストレーナーを通して懸濁液をフィルターします。無菌プランジャーフランジを使用して、70 μmの細胞ストレーナーの上に残ったティッシュを押します。</li>
		<li>4 °Cで5分間300xgで遠心分離。 </li>
		<li>新鮮なadDMEM完全な媒体で細胞ペレットを3回洗浄します。洗浄および再懸濁用のメディアのボリュームと、表 3に示されているメディアのボリュームを一致させます。例えば、24ウェルプレートの培養条件の場合、洗浄の体積は500μLである必要があります。 注 :表 3に示すように、プロトコルは異なるカルチャ条件に適用できます。</li>
		<li>トリパンブルー染料とヘモサイトメーターを使用して、最終的な細胞数を決定します。</li>
		<li>細胞数を得た後、2 x106腫瘍細胞あたりPBS中の80 μLの2%FBS中の細胞ペレットを再懸濁する。</li>
		<li>マウス細胞枯渇カクテル 2 x 106腫瘍細胞あたり 20 μL を追加します。.よく混ぜ、2-8 °Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>2 x 106腫瘍細胞当たりのPBSバッファーの2%FBSを使用して、体積を500μLに調整します。 注:細胞懸濁液の2.5 mLの1 x 107腫瘍細胞まで1つのLSコラムで処理することができる。</li>
		<li>LS カラムを磁気カラムセパレータにロードし、下のラックに 15 mL 円錐形チューブを配置して、フロースルーを収集します。</li>
		<li>PBS バッファーに 3 mL の 2% FBS を使用して各列をリンスします。洗浄フロースルーで円錐形チューブを捨て、新しい無菌15 mL円錐形チューブに交換します。</li>
		<li>カラムに細胞懸濁液(1 x 107腫瘍細胞の最大2.5 mL)を加えます。ヒト腫瘍細胞で濃縮されるフロースルーを収集します。</li>
		<li>PBS バッファーで 1 mL の 2% FBS でカラムを 2 回洗浄します。 注:列が空の場合は、すぐに洗浄手順を実行することが重要です。また、気泡の形成を避けるようにしてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切な細胞懸濁液の体積を、所望の培養用の1.5 mLチューブにアリコートする(表3)。</li>
	<li>1.5 mLチューブを300×g、4 °Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に取り出して捨てます。</li>
</ol>2. 患者原発腫瘍組織の処理
注:これはオルガノイドの確立のための最初のステップです。
<ol><li>マウス細胞の枯渇プロセスを除く全てのステップに従い、これは患者の原発性腫瘍組織の処理には必要ない。</li>
</ol>3. プレートに取り付けられた円形ドームを形成する
注: この原稿では、図1および図2に示すように、細胞ペレットと基底膜(例えば、Matrigel)の混合物からドームを作る3つの方法について説明します。ステップ2-4では、細胞と基細胞膜は、基細胞膜の凝固を防ぐために氷の上に保持する必要があります。
<ol><li>24ウェルプレートセット用の原元膜の適切な体積(例えば、40μL)に細胞ペレットを再懸濁する(表3)。</li>
	<li>細胞が元の膜でうまく再懸濁されていることを確認するために、ピペットを穏やかに上下させます。</li>
	<li>ピペットは、細胞基盤膜混合物の適切な容積(表3)(および任意の10μLのadDMEM完全培地)を予め温めた組織培養プレートの中心に入る。</li>
	<li>プレートを反転し、直ちに5%CO2、37°C、15分間のCO2細胞培養インキュベーターにプレートを逆さまに置きます。これにより、細胞が沈降し、底面に付着するのを防ぎ、基盤膜が固化します。</li>
	<li>ピペットは、各ウェルに10μM Y-27632ジヒドロクロリドを含む予め温めた培地の適切な容積(表3)を含む。</li>
	<li>プレートをCO2細胞培養インキュベーター(5%CO2、37°C)の内側に上に置きます。</li>
	<li>3~4日ごとにメディアを交換します。5-7日後、10μM Y-27632ジヒドロクロリドを用いない培養培地を使用して培養液を維持する。</li>
</ol>4. プレートに取り付けられた円形ドームから浮遊ドームを形成する
<ol><li>ステップ3.7の後、セルスクレーパーを使用してドームを取り外します。</li>
</ol>5. フローティングビーズの形成
注:このプロトコルは、基細胞膜、媒体、オルガノイドの混合物がビーズのように見えるので、浮遊ビーズとして命名されています。
<ol><li>2インチ×4インチのパラフィンフィルムをカットします。</li>
	<li>1000 μLプラスチックピペットチップボックスから空の先端保持ラックのディボットの上にパラフィンフィルムを置きます。</li>
	<li>パラフィンフィルムを軽く押し下げて、手袋をはめた人差し指を使ってディボットをトレースしますが、パラフィンフィルムを突破することなく。</li>
	<li>70%エタノールでパラフィンフィルムをスプレーし、少なくとも30分間調製したパラフィンフィルムを殺菌するために細胞培養フードのUVランプをオンにします。</li>
	<li>細胞と20μLの細胞の混合物を調製する。シード密度は、ドームあたり 50,000 ~ 250,000 個のセルにすることができます。</li>
	<li>ピペットは、ステップ1または2から処理された細胞の混合物を、調製されたパラフィン膜に形成されたディボットの型に20μLの基盤膜を形成した。</li>
	<li>細胞ペレットを原元膜に再懸濁し、調製したパラフィンで細胞懸濁液をピペットに処理し、調製したジボットを取り出した。</li>
	<li>固化ビーズとパラフィンフィルムを6ウェルプレートに入れる。6ウェルプレートに1つのウェルは、5ビーズまで収めることができます。</li>
	<li>パラフィンフィルムのビーズをやさしくブラッシングしながら、各ウェルに10μM Y-27632ジドロリドを含む予め温めた培地のピペット3〜5mL。 メモ:最小ボリュームとして、3 mL を推奨します。ウェルあたりビーズ(N=5)の最大数には、5 mLの培地を推奨します。</li>
	<li>プレートをCO2インキュベーター(5%CO2、37°C)内に入れてください。</li>
	<li>オルガノイド培地を3~4日ごとに交換します。5-7日後、10μM Y-27632ジヒドロクロリドを用いない培養培地を使用して培養液を維持する。</li>
</ol>6. インビボオルガノイド顕微鏡を用いた画像ステッチ8
注:特定の顕微鏡は、セルプレート(エッジ壁)の外周に到達することができません。したがって、画像ステッチ時にはセルプレートの周囲に近いウェルを使用することをお勧めします。
<ol><li>細胞培養プレートを上向きの位置にキーエンス顕微鏡のプレートホルダーに置きます。</li>
	<li>レンズをターゲットドームの中心に置きます。</li>
	<li>フレームの数を選択して自動ステッチ処理を設定します。例えば、3 x 3または5 x 5を選択して、合計で9枚の画像または25枚の画像を生成することができます。</li>
	<li>キャプチャボタンを押してイメージングプロセスを開始します。</li>
	<li>イメージ ビューア ソフトウェアを開き、手順 4 で撮影した画像のグループを読み込みます。</li>
	<li>[画像のステッチ]をクリックして、高解像度のステッチ画像を作成します。 メモ:シリアル9または25の画像をキャプチャするには、手動または自動設定してセルをフォーカスします。</li>
</ol>7. 組織学のためのオルガノイド処理:アガローススピンダウン法
注: このプロトコルは、以前の出版物から Vlachogiannis ら7.我々は、正常にオルガノイドのすべての集団を埋め込むためにアガロース埋め込みを含むステップを追加しました。
<ol><li>既存のメディアをウェルから取り出します。基盤膜ドームを吸引しないように注意してください。</li>
	<li>細胞回収液の体積(ステップ1から取り出した媒体の容積と等しい)を加え、4°Cで60分間インキュベートする。</li>
	<li>ピペットを用いて基盤膜ドームを取り外し、ピペット先端を用いて基盤膜ドームを潰す。解き起下ろしたドームと細胞回収液を1.5mLのチューブに集めます。</li>
	<li>遠心分離機 300 x gと 4 °C で 5 分間.</li>
	<li>上清(細胞回復溶液)を取り除きます。最終ペレット化ステップでオルガノイドの存在が確認された場合、最後まで、すべての上清を別々のチューブに保存します。</li>
	<li>冷たいPBSの所望の容積(表3)を加え、機械的に邪魔するペレットにピペットを軽く上下に加えます。</li>
	<li>遠心分離機 300 x gと 4 °C で 5 分間.</li>
	<li>上清(PBS)を取り除きます。</li>
	<li>ペレットを一致した体積(例えば、24ウェルプレート培養条件から1つのペレットに対して500 μL、表3)の4%PFAを室温で60分間固定します。</li>
	<li>固定後、遠心分離機は300×g、4°Cで5分間。</li>
	<li>上清(PFA)を取り外します。</li>
	<li>一致した容積(例えば、24ウェルプレート培養条件から1つのペレットに対して500μL、表3)のPBSおよび遠心分離機を300xgおよび4°Cで5分間洗浄する。</li>
	<li>温かいアガロース(PBSで2%アガロース)を準備します。 注:ここでは、凍結セクション用の細胞ペレットを、プロトコル7のさらなるステップなしで200 μLのOCT化合物に直接再懸濁することができます。</li>
	<li>細胞ペレットをアガロースの200μL(PBSで2%)で再懸濁した。<ol>
<li>アガロースを加えた直後、1mLシリンジに取り付けられた25G針を使用して、1.5mLチューブの壁から細胞ペレットを軽く取り外します。図3に示すように、細胞ペレットが1.5mLチューブの壁から物理的に剥離していない場合、アガロース埋め込みプロセス中に細胞ペレットの全部または一部を失う危険性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBSの2%アガロースが完全に固化するまで待ちます。</li>
	<li>固化したアガロースブロックを1mLの注射器に取り付けた25G針を使用して1.5mLチューブから切り離します。</li>
	<li>切り離されたアガロースブロックに細胞ペレットを含む新しい1.5 mLチューブを移します。</li>
	<li>70%のEtOHでチューブを充填し、組織脱水およびパラフィン埋め込みのための従来のプロトコルを使用してさらに進みます。</li>
</ol>8. オルガノイドの組織学と免疫蛍光性細胞化学(IFC)
<ol><li>ヒストロジーまたはIFCのスライドを選択します。</li>
	<li>染色プロセスを開始する前に、セルがスライド上のどこにあるかを調べ、マーカーを使用してスライド上のセルの周りに円を描きます。</li>
	<li>スライドのエッジまたはボーダーの周囲に周囲を描画し、ラボノートのスライド上の円が配置されている場所を描いて、その位置を記録します。</li>
	<li>所望の染色を行う。 注:このプロセス中に、通常のメーカーは化学物質に耐性がないため、マークされた円が消えます。いくつかのヒストロジー永久マーカーでさえ、染色プロセス中に消去される可能性があります。</li>
	<li>染色処理後、スライドを研究室のノートに置いて、スライド上のセルの位置を見つけます。</li>
</ol>

<ol><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051(2019).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+contribution+of+stem%2Fprogenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-%2F-TP53-%2F-+prostate+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li>
<li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PDX%2FOrganoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).</li>
<li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models%3A+an+engineering-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCSD1%2C+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer%2C+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275(2014).</li>
<li>Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019).</li>
</ol>

サンヒー・リーとクリスティーナ・A・M・ジェイミーソンは、JoVE Methodsコレクションのゲスト編集者です。

前立腺癌細胞の骨転移に由来する3Dオルガノイドは、依然として比較的稀である。ここでは、BMPCのシリアル3D患者由来オルガノイド(PTO)を正常に確立するための戦略およびさらに最適化されたプロトコルについて説明する。さらに、プロトコルはIFCおよびIHC分析のための低い細胞密度のサンプルのオルガノイドを確保するために記述されている。嚢胞、回転楕円体およびより複雑なオルガノイドの形態の差動表現型は、このプロトコルが患者のヘテロゴノス腫瘍細胞集団が細胞表現型および構造を保持することを可能にする培養条件を提供することを示す。従って、ここで述べる培養条件は、FBS血清補充で5種の修飾を加えたもので、患者のBMPC由来細胞の培養に最適であることが示された。
私たちの最適化されたプロトコルは、3Dオルガノイド培養をセットアップするために、原発性またはPDX腫瘍組織からの限られた出発物質からの複数のエンドポイントを備えた実験のために実用的です。一般に、患者原発腫瘍組織からの3Dオルガノイドの確立は、PDX腫瘍組織からの3Dオルガノイドの確立よりも少...

三次元培養オルガノイドは、生体内アーキテクチャ、細胞機能性および元の組織の遺伝的シグネチャを再現する可能性に注目されている1,2,3,4,5.最も重要なことは、患者腫瘍組織または患者由来異種移植片(PDX)モデルから確立された3Dオルガノイドは、腫瘍形成に関する細胞シグナル伝達のメカニズムを理解し、各細胞集団6、7、8、9、10、11、12、13に対する薬物治療の効果を決定する貴重な機会を提供する。Drostら5は泌尿器科の分野で広く採用されているヒトおよびマウス前立腺オルガノイドの確立のための標準プロトコルを開発した。また、3Dオルガノイドのさらなる特徴付けに多大な努力が行われ、腫瘍形成および転移の詳細なメカニズムを理解するために4,12,14,15.3D オルガノイド培養のための以前に確立され、広く受け入れられているプロトコルに加えて、我々は最適化された培養条件の3つの異なるドミン法を用いてPDOの3D培養のためのステップバイステップのプロトコルをここに記述する。
本稿では、3Dオルガノイドを骨転移性前立腺癌(BMPC)の元生体モデルとして確立した。これらの培養物に使用される細胞は、前立腺癌サンディエゴ(PCSD)シリーズから来て、患者前立腺癌骨転移性腫瘍組織(PCSD18およびPCSD22)または患者由来異種移植片(PDX)腫瘍モデル(PCSD1、PCSD13、およびPCSD17という名前のサンプル)から直接得られた。前立腺癌細胞の自発的な骨転移は遺伝子組み換えマウスモデル16ではまれであるため、ヒト腫瘍細胞の雄Rag2---γc-/-マウスへの直接の大腿内注射を使用して、骨転移性前立腺癌のPDXモデルを確立した17。
異種患者腫瘍細胞または異種移植片由来の患者から3Dオルガノイドが確立されたら、前立腺腫瘍細胞としての同一性を確認し、3Dオルガノイド培養でそれらの表現型を決定することが不可欠です。免疫蛍光化学(IFC)は、各細胞におけるその中のタンパク質発現の可視化を可能にし、特定の細胞集団2、4に対する潜在的な機能を示すことが多い。一般に、組織や細胞を含むサンプルの大部分に対するIFCプロトコルは、簡単で完全に最適化されています。しかし、細胞密度およびオルガノイドの数は、従来の培養物よりも有意に低くすることができる。したがって、オルガノイドのIFCプロトコルは、サンプル内のすべてのオルガノイドのパラフィンに適切な処理と埋め込みを確実にするために追加のステップを必要とします。アガロースの埋め込み前プロセスの追加手順と、特にオルガノイドのサンプルが所望よりも低い細胞密度を有する場合に、オルガノイド上のIFCの成功率を増加させるスライド上のセクション化オルガノイドの位置を標識するヒントを説明する。

<table><tbody><tr><td>1 mL ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>BD シリンジ</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>スペクトラム ラボ 製品</td><td>941-11326-ATP083</td><td></td></tr><tr><td>25G ニードル</td><td>BD プレシジョングライド ニードル</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド (PFA)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール (EtOH)</td> <td>VWR</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>トクリスバイオサイエンス</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>アキュマックス</td><td>・イノベーティブ・セル・テクノロジーズ(株)</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>adDMEM</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td></td></tr><tr><td>抗体 -サイトケラチン 5</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>サイトケラチン 8</td><td>Biolegend</td><td>904801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescence イメージングシステム IVIS 200</td><td>Perkin Elmer Inc</td><td>IVIS 200</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート - 24 ウェル</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート - 48 ウェル</td><td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート - 6 ウェル</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>細胞解離溶液, Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>細胞回収ソリューション</td><td>コーニング</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>Sarstedt</td><td>83.180</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>3546</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ベクター Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073-1ML</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>コーニング/セルグロ</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>ペプロテック</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ジェミニ バイオプロダクツ</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>ペプロテック</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ペプロテック</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>デンビル サイエンティフィック</td><td>S728696</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi</td><td>130-0420401</td><td></td></tr><tr><td>磁気カラムセパレータ: QuadroMACS セパレータ</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>マーカー</td><td>VWR</td><td>52877-355</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル (成長因子低減)</td><td>Mediatech Inc. (コーニング)</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>マトリゲル(高濃度)</td><td>BD(フィッシャーサイエンティフィック)</td><td>CB354248</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡イメージングソフトウェア、キーエンス</td><td>BZ-X800(最新ソフトウェア)BZ-X700(旧ソフトウェア)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、キーエンス</td><td>BZ-X700(2016-2017年型)/BZ-X710(2018-2019年型)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス細胞枯渇キット</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-TEK</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Mediatech Inc. (Corning)</td><td>30-002-CI-1</td><td></td></tr><tr><td>1 mL用ピペットチップ(ブルーチップ)</td><td>Fisherbrand Redi-Tip</td><td>21-197-85</td><td></td></tr><tr><td>プランジャー(3 mLシリンジから)</td><td>BDシリンジ</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 1</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>SB2021190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076-25MG</td><td></td></tr><tr><td>スモールテーブルトップ遠心分離機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002426</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーSci</td><td>2320</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3d)オルガノイドの確立と解析

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

ヒト患者の腫瘍標本からのオルガノイドの三次元(3D)培養および前立腺癌の患者由来異種移植片(PDX)モデルは、患者由来オルガノイド(PDO)と呼ばれ、そのメカニズムを研究するための貴重な資源である。前立腺癌の腫瘍形成と転移。彼らの主な利点は、彼らがそうしない従来の細胞株と比較して、元の組織の特徴的なゲノムと機能的不均一性を維持することです。さらに、PDOの3D培養は、個々の患者に対する薬物治療の影響を予測するために使用することができ、パーソナライズされた医療への一歩です。これらの利点にもかかわらず、いくつかのグループは、異なる患者のサンプルに必要な可能性のあるPDO培養条件の広範な最適化のために、この方法を日常的に使用しています。我々は、我々の前立腺癌骨転移PDXモデル、PCSD1が、抗アンドロゲン療法に対するドナー患者の骨転移の抵抗を再現したことを以前に実証した。我々は、PCSD1 3Dオルガノイドを用いて、抗アンドロゲン抵抗性のメカニズムをさらに特徴付けた。PDXおよびPDOモデルの現在発表されている研究の概要に続いて、我々は最適化された培養条件でドーム型または浮遊基基盤膜(例えば、マトリゲル)球を用いたPDOの3D培養のためのステップバイステッププロトコルを記述する。インビボでは、ヒストロジーのための細胞処理と画像化と細胞処理も記載されている。このプロトコルは、ウェスタンブロット、共培養、等を含む他の用途のためにさらに最適化することができ、薬剤耐性、腫瘍形成、転移および治療薬に関する3D培養PDOの特性を探索するために使用することができる。

3Dオルガノイドは、骨転移性前立腺癌(BMPC)の由来異種移植片(PDX)モデルから、ならびに患者の骨転移性前立腺癌組織から直接確立された(図4)。簡単に言えば、BMPCのPDXモデルは、大腿内(IF)が雄Rag2----c-----マウスに腫瘍細胞を注入することによって確立され、PDX腫瘍を採取し、この原稿に記載されているように処理した。図4に示すように、PCSDシリーズのPDX腫瘍組織は、このプロトコルを使用して形成された嚢胞、回転楕円、およびより高い複雑性オルガノイドとして現れる差動表現型を有する3Dオルガノイドをもたらした。
25の高解像度10倍の拡大画像からのステッチ画像は、地下膜とオルガノイドのドーム全体を示した(図5)。画像解析ソフトウェアを使用して、特定のサイズよりも大きい細胞または細胞クラスターを選別するか、または回転楕円体または嚢胞を手動で選...

患者のBMPC標本および骨転移性前立腺癌の異種移植片の三次元培養は、嚢胞、回転楕円および複雑な腫瘍様オルガノイドをもたらす元の腫瘍の機能的不均一性を維持する。本稿は、異種患者由来サンプルの3D培養とIFCを用いた解析のための最適化戦略とプロトコルを提供します。

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

骨転移性前立腺癌の連続3D患者由来オルガノイドを確立するための戦略とステップバイステッププロトコルについて述べています。当社の最適化されたプロトコルは、患者または患者由来の異種移植片腫瘍組織から直接限られた出発物質を使用して実験のための3D培養を設定するために実用的です。このプロトコルの3Dオルガノイドは、骨転移性前立腺癌病理の基本的なメカニズムを理解し、治療をテストするためにex vivoモデルとして使用することができます。このプロトコルの3Dオルガノイド培養培地は、前立腺由来細胞に特異的である。私たちのプロトコルの他の部分は、腫瘍組織および転移部位の異なるタイプに適用可能である。ドミン技術は、このプロセスの中で最も困難な部分であることが証明されるかもしれません。ドーム型の技術を実践することで、オルガノイド、メディア、マトリゲルのドーム型混合物の一貫したサイズが保証され、サンプル懸濁液中の気泡の形成を最小限に抑えることができます。この方法を視覚的に実証することで、低密度の細胞から低密度オルガノイドをうまく培養するための粘性マトリゲルの扱い方をよりよく理解できます。24ウェルプレートの設定のために、細胞ペレットを適切な量の原膜に再懸濁させることから始めます。ピペットは、細胞が再懸濁されることを確実にするために穏やかに上下し、その後、細胞懸濁液の適切な体積を、事前に温めた組織培養プレートの中央にピペットします。プレートを反転し、37°Cに設定された細胞培養インキュベーターに逆さまにして、15分間5%の二酸化炭素を置きます。ピペットは、各ウェルに10マイクロモルY-27632ジヒドロクロリドを含む適切な体積の予熱された培地を含む。付属の円形ドームから浮動ドームを形成するには、セルスクレーパーを使用してプレートからドームを取り外します。パラフィンフィルムを2枚4インチ切り、1ミリリットルのプラスチックピペットチップボックスから空の先端保持ラックのディボットの上に置きます。手袋をした人差し指を使ってパラフィンフィルムを軽く押し下げて、フィルムを突破しないように注意してディボットを追跡します。パラフィンフィルムに70%エタノールをスプレーし、細胞培養フードのUVランプをオンにして、少なくとも30分間、調製したフィルムを殺菌します。一方、前処理された細胞を20マイクロリットルの地下膜に再懸濁させる。その後、パラフィンフィルムに形成されたディボットに懸濁液をピペットする。固化ビーズとパラフィンフィルムを6ウェルプレートに入れ、10マイクロモルY-27632ジヒドロクロリドを含むプリウォーム培地を3~5ミリリットルのプリホットル培地に入れ、パラフィンフィルムからビーズを軽くブラッシングします。組織学のためのオルガノイドを処理するには、地下膜ドームを吸引しないように注意して井戸から既存の培地を取り除きます。等量の細胞回収液を加え、プレートを摂氏4度で60分間インキュベートします。インキュベーション後、ピペットを使用して地下膜ドームを外し、ピペットチップで粉砕します。解ciaされたドームと細胞回収液を1.5ミリリットルチューブに回収します。チューブを摂氏4度で300倍にして5分間遠心し、上清を取り除いて脇に置きます。オルガノイドの存在が冷たいPBSの所望の容積で確認され、オルガノイドを中断することなくペレットを機械的に取り除くために穏やかにピペットが上下に確認されたとき、最後のステップまですべての上澄み物を保存します。遠心分離を繰り返し、上清を取り除く。ペレットを室温で60分間4%PFAの一致したボリュームに固定します。固定後、遠心分離工程とPBS洗浄を繰り返します。その後、ゆっくりと暖かい2%アガロースの200マイクロリットルを追加し、すぐに、穏やかに1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージ針を使用してそれを中断することなく、チューブ壁から細胞ペレットを取り外します。アガローススピンダウン法では、25ゲージ針を用いてアガロースを添加した直後に、細胞ペレットをチューブの壁から取り外す必要があります。アガロースが完全に固まったら、1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針でチューブから取り外し、新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。70%エタノールでチューブを充填し、組織脱水およびパラフィン埋め込みのための従来のプロトコルを進めます。このプロトコルは、骨転移性前立腺癌の患者由来の異種移植片モデルから、また癌組織から直接3Dオルガノイドを確立するために成功した。オルガノイドは、嚢胞、スフェロイド、およびより複雑なオルガノイドとして現れる異なる表現型を示した。地下膜とオルガノイドのドーム全体が、25の高解像度、10倍の拡大画像からステッチされた画像で見ることができます。さらに腫瘍組織を調査するために、免疫蛍光細胞化学は、基底上皮細胞マーカーサイトケラチン-5、ルミナル上皮細胞マーカーサイトケラチン-8およびDAPIを標的とするオルガノイドの5マイクロメートル厚いパラフィンセクションに対して行った。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング、共培養、フローサイトメトリーなどの他のアプリケーションに最適化して、3Dオルガノイドの特性と薬物治療の効果を探求することができます。これらの実験は、薬剤耐性のメカニズムと、単独で、または現在の治療法と組み合わせて新しい治療法の有効性に対処することができます。この技術の3Dオルガノイドは、対象間および被験体内の異質性を保持し、したがって患者における疾患のより正確なモデルである。この技術は、研究者が患者の疾患進行と治療への応答をより予測可能にする可能性のある薬剤耐性、腫瘍形成、転移および治療のメカニズムを探求する道を開く。

establishment-analysis-three-dimensional-3d-organoids-derived-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

腫瘍由来のオルガノイドは、腫瘍の病理学的特徴と臓器特異的な細胞系統を維持できる3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコルの例では、科学者が遺伝子操作マウスモデルから前立腺腫瘍からオルガノイドを生成する様子を見ていきます。...

腫瘍からのオルガノイドの調製:3D In Vitro腫瘍モデル

この原稿は、循環腫瘍細胞(CTC)から前立腺癌患者由来異種移植片(PDX)を生成するために使用される方法を詳述しています。CTCからのPDXモデルの生成は、前立腺がんを研究するための代替実験モデルを提供します。最も一般的に診断される腫瘍であり、男性の癌による死亡原因として多い。...

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

前立腺癌は、米国で癌関連の死亡原因として2番目に多いものです。同所性がんモデルは、前立腺がんの生物学を理解し、治療レジメンの有効性を評価するための有用なアプローチを提供します。このプロトコルでは、同所性前立腺がんマウスモデルを確立するために必要な詳細な手順について説明します。...

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

ここでは、人間プライマリ前立腺における処理をガイドし、表現型を評価するためにエンドポイントを提案するプロトコルを提案する.播種、文化の維持、マトリックス ゲルからの回復形態の定量化、埋め込み断面、FFPE...

処理と人間プライマリ前立腺培養の評価

前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。...

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

ここで提示する前立腺上皮オルガノイドにおける薬理学的応答を研究するためのプロトコルである。オルガノイドは生体内生物学によく似ており、患者の遺伝学を再現し、魅力的なモデルシステムとなっています。前立腺オルガノイドは、野生型前立腺、遺伝子操作されたマウスモデル、良性ヒト組織、および進行前立腺癌から確立することができる。...

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

インビトロスクリーニングのために患者由来の異種移植片(PDX)を使用してオルガノイドを作成する方法が記載され、インビボ/インビトロモデルのペアが一致する結果となる。PDX腫瘍は、機械的または酵素的に小片に収穫/処理され、その後、元のPDXに対して通過し、凍結保存され、特徴付けられる腫瘍オルガノイドを成長させるCleversの方法が続いた。...

がん薬理学研究のためのPDXとPDX由来オルガノイドのインビボ/インビトロ患者由来モデルペアの作成

患者由来のオルガノイド(PDO)は、トランスレーショナルがん研究における強力なツールであり、疾患の遺伝的および表現型的な不均一性および個別化抗がん治療に対する応答の両方を反映しています。ここでは、表現型解析および薬物応答の評価に備えてヒト原発性膀胱癌PDOを生成するための統合プロトコールが詳述されている。...

精密医療ツールとしての膀胱癌オルガノイドの培養

患者由来の乳房腫瘍切除術または正常な乳房組織からヒト乳房オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルがここに提供される。このプロトコルは、ヒト患者由来の乳房オルガノイドを培養、凍結、解凍するための包括的なステップバイステップの手順を提供します。...

患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

腫瘍オルガノイドは、がん研究と個別化医療へのアプローチに革命をもたらしました。これらは、臨床的に関連性のある腫瘍モデルであり、研究者は診療所で腫瘍の一歩先を行くことができます。このプロトコルは、新鮮な膵臓腫瘍組織サンプルおよび膵臓腺癌起源の患者由来の異種移植片から腫瘍オルガノイドを確立します。...

膵臓癌由来腫瘍オルガノイドおよび線維芽細胞の新鮮組織からの樹立

前立腺がんの不均一性と治療抵抗性は依然として課題です。主要な親腫瘍の特徴を保持する患者由来オルガノイド(PDO)を生成するためのプロトコルについて説明します。この標準化されたモデルは、薬物スクリーニングと精密医療の進歩をサポートします。...

患者由来前立腺癌オルガノイドの確立と維持:詳細な実験プロトコル

学ぶ前立腺癌骨転移患者由来3Dオルガノイド培養法。ドーミング技術を用いて限られた材料から腫瘍異質性を維持したモデルを樹立し、病態解析や治療薬スクリーニングに応用する方法を解説します。

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

さらに動画を探す