糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用
November 28th, 2019
重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。
膜および細胞壁選択的蛍光色素は、細胞内ダイナミクスや生きた真菌細胞の解析に重要なツールです。当社のプロトコルは、真に重要な汚れとしてこれらの染料の選択の適用のための本質的な理論的背景と実用的なガイドラインを提供します。そのための重要なポイントは、高品質で長期間のライブセルイメージングに優れた信号対ノイズ比を提供しながら、飽和や色素毒性に関連する細胞アーティファクトを引き起こさない非常に低い色素濃度を使用することです。
医学大学核医学科の同僚と共に、最近、これらの染色技術を用いて、アパーギルス症の画像誘導診断のための新しいアプローチを開発しました。膜構造と細胞壁構造をリアルタイムで監視する能力は、実験薬化合物の取り込みダイナミクスを決定するために重要でした。この手順を開始するには、まず準備済みの前培養を取得する。
滅菌メスを使用して、前培養のコロニー端から非胞体を運ぶ小さな寒天ブロックを切断する。新鮮な固体培地プレートの中央に寒天ブロックを置き、実験培養を接種します。培養を意図した発達段階に従って実験培養をインキュベートする。
サンプル調製はやや繊細であり、画像取得設定の最適化はかなり複雑である。口頭で説明を伴う両方の手順の視覚的なデモンストレーションは、複製性を大幅に促進します。サンプルを取り付けるには、清潔な24 x 60ミリメートルのガラスカバースリップを準備し、18マイクロリットルの液体最小培地または生理塩溶液を中央に加えます。
蓋の中央にある液体に調製した20マイクロモル色素の作業溶液の2マイクロリットルを加え、気泡の生成を避けながら上下にピペット加工することによってよく混ぜます。きれいなメスを使用して、コロニーの周囲から15 x 15ミリメートルのサンプルを切り取り、カバースリップの中液滴の横に垂直に置きます。メスを使用してブロックの上端を支え、指でブロックの後部を所定の位置に保持します。
その後、液状に菌糸体を運ぶ側をゆっくりと下げる。準備したサンプルを顕微鏡のステージに取り付ける。まず、テキストプロトコルで概説されているように、個々の催眠術で立ちダイナミクスをキャプチャするために、基本的な画像取得設定を調整します。
エンドサイトーシス取り込みアッセイの場合、図1と表1のテキストプロトコルを参照して、顕微鏡システムで利用可能なFM 143またはFM 464の最適な励起および放出設定を特定し、システム内でこれらの設定を調整します。以前に調整した設定を使用して画像記録を開始し、結果を評価します。次に、実験に焦点を当てた血漿膜またはエンドサイトーシスダイナミクスの側面を捉えるために必要な空間的および時間的解像度に画像取得設定を最適化する。
セル壁ダイナミクスの場合、図4と表1のテキストプロトコルを参照して、適用された細胞壁色素に最適な励起および発光設定を特定し、顕微鏡システムの設定を適宜調整します。以前に調整した設定を使用して画像記録を開始し、結果を評価します。次に、実験に焦点を当てた細胞壁形態形成の側面を捉えるために必要な空間的および時間的解像度に画像取得設定を最適化する。
細胞プロセスを視覚化するだけでなく、ライブセルイメージングにより、記録されたデータから定量的な情報を抽出できます。FM 464取込アッセイの一例では、真菌サンプルはコロニーとして栽培され、逆方寒天ブロック法によって取り付けられる。このアッセイは、トリコデルマアトロビライドの真菌特異的タンパク質SFP2の遺伝子欠失および遺伝子過剰発現変異体におけるエンドサイトーシスの時空間組織における欠陥を同定した。
デンドサイトコンパートメントを標的とする蛍光融合タンパク質のFM464共染色の例をここに示す。この共染色は、膜貫通タンパク質にタグ付けされた2つの強化された緑色蛍光タンパク質の細胞内分布を、SFP2およびGPR1、トリコデルマアトロビライド中のエンドサイト経路に関連付けるために採用される。形態遺伝学的な違いを同定するためのFM 464共染色の一例は、この共染色が、敗血症および偏光性ヒphphal先端成長の形成などのいくつかの人身売買依存的プロセスの終わりまで、小麦粉に標識されたBUD-6極性複合体タンパク質の細胞内局在化ダイナミクスのさらなる関係を可能にすることを示している。
また、神経スポラ・クラッサの野生型と変異株の間の細胞内組織および催眠アーキテクチャの違いを特徴づける。代表的な細胞壁染色は、カルコフルオール白、ソロフェニルflavine、および細胞壁ポリマーを有するコンゴレッドの異なる相互作用特性が、デルタSFP2突然変異体とトリコデルマアトロビライドの野生型株との間の形態遺伝学的な違いを強調することを示している。色素濃度の上昇によって生じる細胞壁応力を高めることは、より迅速に起こり、野生型と比較して突然変異体でより顕著である。
さらに、同じ画像は、両方の株間の催眠直径および中隔距離に関する形態遺伝学的な違いを定量化することを可能にする。細胞壁生合成の代表的なリアルタイムモニタリングは、非常に低いカルコフルオール白濃度が色素分子による細胞壁の飽和を防ぎ、細胞壁生合成の定量的リアルタイムモニタリングを可能にすることを示している。これは、新しい細胞壁材料の堆積物が均一ではないことを明らかにするが、神経スポラ・クラッサにおける真核注入の前に細胞間の結合時に1細胞の相対的な変位に起因する局所的な物理的ストレスに非常に迅速に応答する。
少ない方が多いです。細胞プロセスで蛍光マーカーの干渉を排除するために、できるだけ少ない色素を使用してください。この手順に従って、光漂白実験後の蛍光回収を行い、輸送および生物発生性運動を定量化することができた。
ミレニアムの初めに糸状菌の膜と細胞壁染色の先駆的な導入は、文字通り私たちが真菌を見る方法に革命を起こしました。カルコフルオール白は眼刺激を引き起こす可能性があり、分類された癌性物質である。コンゴ赤は発火性と催奇性なので、これらの染料を扱うときは目と皮膚の保護を着用してください。
概要
この研究は、糸状菌における細胞膜ダイナミクス、エンド/エキソサイトーシス、細胞壁形態形成を追跡するための生細胞イメージングにおける蛍光染料の使用を探っています。細胞のアーティファクトを誘導することなく様々な染料を適用するための実践的なガイドラインを概説し、細胞プロセスの正確な観察を可能にします。
主要な研究構成要素
研究領域
- 生細胞イメージング
- 真菌細胞生物学
- 細胞膜と細胞壁のダイナミクス
背景
- 細胞プロセスを研究する上での重要な蛍光染料
- 細胞アーティファクトを防ぐための低濃度の染料の必要性
- 動的な細胞挙動のリアルタイムモニタリング
使用された方法
- 蛍光染色技術
- Trichoderma atrovirideやNeurospora crassaなどの糸状菌
- 画像取得と分析プロトコル
主要な結果
- 膜ダイナミクスとエンドサイトーシスの成功的な追跡
- 蛍光共染色を通じた形態形成の違いの同定
- ストレスに対する応答における細胞壁生合成の定量的モニタリング
結論
- この研究は真菌における生細胞イメージングの効果的な技術を示しています。
- 結果は真菌生物学における細胞組織とダイナミクスに関する貴重な洞察を提供しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging of filamentous fungi using selective fluorescent dyes enables mechanistic de-risking of target validation by resolving spatiotemporal dynamics of endocytosis and cell wall biogenesis. Quantitative imaging supports predictive confidence in phenotypic screening and assay development for antifungal target identification. The approach provides a disease-relevant system for evaluating compound effects on fungal morphology and trafficking pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genetic mutants to defects in endocytic spatio-temporal organization.
- Operational Value: Enables functional target validation through co-localization of GFP-labeled proteins with endocytic compartments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying morphogenetic cell wall defects in mutants via differential dye interaction with cell wall polymers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated fungal systems for downstream screening by establishing artifact-free staining protocols at low dye concentrations.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through optimized excitation/emission settings for FM dyes and cell wall stains.
- Scalability: Facilitates platform reuse across filamentous fungal species with adaptable cultivation conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time monitoring of cell wall biosynthesis in response to localized physical stresses, informing mechanism of action studies.
- Translational Continuity: Connects discovery imaging to preclinical validation by quantifying hyphal diameter and septal distance as morphodynamic biomarkers.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing differential cell wall deposition dynamics between wild-type and mutant strains under stress.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical morphodynamic profiling in filamentous fungal models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying endocytosis defects in genetic mutants via FM dye uptake assays.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized sample preparation using inverted agar block mounting and low-dose dye working solutions.
- Analytics: Enables quantitative extraction of transport and biogenesis kinetics via fluorescence recovery after photo-bleaching (FRAP) compatible protocols.
- Translational Research: Connects to preclinical work by monitoring real-time cell wall biogenesis and its response to cell-to-cell attachment stresses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for longitudinal studies of fungal cellular organization across multiple strains and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by resolving subcellular dynamics of membrane and cell wall processes.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through low-dye protocols that prevent saturation and toxicity while maintaining signal-to-noise ratio.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative morphodynamic readouts that reduce late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through comparative characterization of shared and distinct protein localization in endocytic pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fungal culture maintenance, sterile technique, and live-cell microscopy.
- Needs fluorescence microscopy with configurable excitation/emission settings and environmental control for long-term imaging.
- Demands cross-team standardization of dye working concentrations and mounting procedures to ensure reproducibility.
- Requires adaptation of incubation conditions and sample preparation for species-specific filamentous fungal models.
- Limited by photobleaching at high acquisition frequencies and potential dye-induced stress at supra-vital concentrations.
