Name: 原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶ 原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための誘導型発現システムとピペット電気穿孔法を用いた効率的な転写制御プラスミド発現システム。この手法は細胞生理への影響を最小限に抑え、遺伝子発現の翻訳後調節を詳細に解析可能にします。

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フランシス・ミニョーは、ケベック呼吸器保健ネットワークとカナダ保健研究所(CIHR)肺トレーニングプログラム、FRSQの学生シップ、およびエチュード・シュペリエール研究所の学生シップによって提供されたフェローシップによって支えられ、他のポスドクダレス、モントリオール大学。この研究は、臨床研究におけるゴセリン・ラマール議長とカナダ保健研究所[YBMOP-79544]によって支えられた。

すべての動物の手順は、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って行われ、モントリオール大学センター(CRCHUM)の研究センターの施設動物ケア委員会によって承認されました。
1. 目的遺伝子を発現する反応プラスミドの設計と生成(GOI)
<ol><li>pTRE-Tightなどの誘導可能なテトラサイクリンオフベクターを使用します。</li>
	<li>ベクトルの GOI とマルチクローニングサイト (MCS) の順序を分析して、GOI 内に内部的に存在しない MCS 内の制限サイトを特定します。</li>
	<li>先に説明したように、雄のスプレイグ・ドーレーラット肺から原発性肺胞上皮細胞を単離する。</li>
	<li>フェノール/クロロホルム抽出やシリカベースのRNAスピンカラムの使用などの標準的な方法を使用して、RNA抽出によって肺胞上皮細胞から全RNAを精製します。</li>
	<li>オリゴ(dT)と高忠実度の逆転写酵素を使用して、mRNAを相補DNA(cDNA)に逆転写します。</li>
	<li>高忠実度のTaqポリメラーゼと標準オーバーラップPCR技術を使用して、設計されたプライマーを使用して2つの選択された制限酵素認識部位でGOIを横取りします。<ol>
<li>前進プライマーは、mRNA安定性と並行してタンパク質発現を研究する発現レベルを改善するために、コザックコンセンサスリボソーム結合部位21を含有させる。トランスフェクトされたGOIの発現を内因性発現と区別するために、GOIの上流のV5エピトープをコードする配列を含めなければならない(表1)。</li>
		<li>逆プライマーに、停止コドンの後にポリアデニル化シグナルを含まなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>変異体は、GOI 3'UTRの3'末端を徐々に削除するポリアデニル化部位をコードする逆プライマーを用いて、異なる3'UTR領域がGOIのmRNAの安定性に及ぼす影響を研究するために、順次欠失によって生成することができる(図6)。あるいは、PCR指向変異誘発を用いて、3' UTR22の特定の対象領域を標的にすることができる。</li>
	<li>誘導性ベクターとインサートを適切なインキュベーション温度で1時間の適切なインキュベーション温度で消化し、その後、自己結紮を避けるために30分間のベクター反応中にホスファターゼで処理します。</li>
	<li>1-1.5%アガロースゲル(インサートの大きさに応じて濃度)で電気泳動により、消化されたベクターと挿入セグメントを分離します。</li>
	<li>ブレードとUV光を用いて、連結する所望のインサートおよびベクターを含むDNA断片を収集する。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>シリカベースのPCR精製キットを用いてアガロースゲルから採取したセグメントを精製し、260nmの分光光度法で濃度を測定します。</li>
	<li>GOIとT4 DNAリガーゼを用いた誘導性ベクターをベクター:インサートモル比1:3を使用してリゲートし、ライゲーションの確率を高めます。反応を室温(RT)で3時間インキュベートする。</li>
	<li>ライゲーション反応を有能な大腸菌(DH5α)に変換します。<ol>
<li>100 μLの有能な細胞を含むチューブに、1~10 ngのベクターと遺伝子を加えます。細胞を氷上で30分間インキュベートし、42°Cで45秒熱ショックセルを熱ショックし、チューブを氷の上に2分間置き、900 μLのRT LB培地を加えます。225rpmで振盪して37°Cで1時間培養します。</li>
		<li>LB寒天プレートに100μLの反応を適切な抗生物質(例えば、pTRE-Tightベクター用の100μg/mLアンピシリン)で広げ、形質転換した細菌を選択します。プレートを一晩37°Cでインキュベートする。</li>
		<li>接種ループまたは20μLチップを使用して個々のコロニーを選択し、振盪で37°Cで適切な抗生物質を含む5mL LB培地で一晩インキュベートする。形質転換菌は、-80°Cのグリセロールに対するLB培地の400:600の割合でグリセロールストックに貯蔵することができる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリカ系プラスミドカラムを用いてプラスミドDNAを抽出し、260nmの分光光度法により濃度を測定する。制限分析によるGOIの挿入とその向き、およびシーケンシングによるRT-PCR中に潜在的に導入される突然変異の欠如を確認します。</li>
</ol>2. 目的遺伝子(GOI)を原発性肺胞上皮細胞に発現する反応プラスミドのトランスフェクション
<ol><li>ラット肺からII型肺胞上皮細胞を単離する。</li>
	<li>完全な最小必須培地(完全なMEM)を備えた100 mmペトリ皿の1 x 106細胞/cm2の密度で細胞をシードします。完全なMEMは10%FBS、0.08 mg/Lトブラマイシン、セプトラ(3 μg/mLトリメトプリムおよび17 μg/mLスルファメトキサゾール)、0.2%NaHCO 3、0.01 M HEPES(pH = 7.3)、および2 mM L-グルタミンを補充するMEMである。加湿インキュベーターで5%CO2で37°Cで24時間培養した。</li>
	<li>翌日、新しい12ウェルプレートの各ウェルに抗生物質を含まない完全なMEMの500 μLを置き、37°Cでプレートを30分間前温めます。このステップの間に、汚染テトラサイクリンの無い胎児ウシ血清を使用するか、または不用さを妨げるために低すぎるレベルで使用することが重要です。</li>
	<li>誘導性GOI(GOIプラスミド)と制御ベクトル(例えばpTet-Off)を用いてプラスミドを含む1.5mLチューブを、RTで1μgのGOIプラスミドと1μgの調節ベクトルを添加して調製します。RNA結合タンパク質(RBP)を用いた共発現実験では、1μgの構成ベクター(例えば、pcDNA3)を発現するRPBをDNAミックスに添加する(図7)。</li>
	<li>培地を吸引し、37°Cで予熱したPBS(カルシウムおよびマグネシウムを含まない)で細胞を穏やかにすすいだ。</li>
	<li>37°Cでプリウォームした0.05%トリプシンの5 mLを加え、細胞が剥離するまで細胞をインキュベートします(2〜4分)。抗生物質なしで完全なMEMの10 mLを加えることによってトリプシンを中和する。</li>
	<li>50 mLチューブに細胞懸濁液を回収し、ペトリ皿を4 mLの培地で洗浄してできるだけ多くの残りの細胞を採取し、300 x gで細胞懸濁液を遠心分離して5分間送ります。</li>
	<li>優しく吸引し、上清を捨て、PBSの1mLでペレットを再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用してセル数をカウントし、計算します。</li>
	<li>300 x gの細胞を 5 分間遠心分離し、上清を軽く吸引し、再懸濁液バッファー内のペレットを 4 x 107 細胞/mL の濃度で再懸濁します。ステップ2.4で作製した1.5mLチューブから、ウェルあたり40万個の細胞の濃度で細胞を加え、上下にピペットを入れて穏やかに混合します。</li>
	<li>チューブをエレクトロポレーション装置に入れ、3.5 mLの電解バッファーで満たします。</li>
	<li>ピストンを完全に押し込んで、金めっきの電極チップをピペットに挿入します。1.5 mLチューブの内容物を軽く混ぜ、ピペットで細胞を慎重に吸引します。これは、エレクトロポレーション中に電気アークを引き起こし、トランスフェクション効率の低下につながるので、気泡が先端に入るのを防ぐために注意してください。</li>
	<li>クリック音が出るまで、エレクトロポレーションステーションにピペットを挿入します。</li>
	<li>肺胞上皮細胞の適切なエレクトロポレーションプロトコルを選択し、幅20msのパルス電圧1,450Vと2パルスに対応し、タッチスクリーン上でStartを押します。</li>
	<li>トランスフェクションの直後にピペットを取り除き、37°Cに予熱した抗生物質を使わずに完全なMEMで満たされたウェルに細胞を移します。</li>
	<li>残りのサンプルについて、手順 2.11 ~ 2.14 を繰り返します。</li>
	<li>プレートを軽く振って、ウェルサーフェス上に均等に細胞を広げます。加湿インキュベーターで5%CO2で37°Cの細胞をインキュベートします。2日後、培地を完全なMEMと抗生物質で交換してください。</li>
	<li>eGFPの発現を蛍光顕微鏡で観察するか、または制御ベクターを用いたフローサイトメトリーによりトランスフェクションの成功を確認する(図1)。 注: このステップはオプションで、pcDNA3-EGFP のような eGFP を発現する別のプラスミドを使用して追加のトランスフェクションステップを必要とします。</li>
</ol>3. GOIの転写抑制の誘導
注:細胞は、mRNAの安定性への影響を評価するために、ドキシサイクリン誘導前に所望の処置で前処理することができる(図5)。
<ol><li>脱イオン水に1mg/mLのドキシサイクリンストック溶液を調製します。ストック溶液は、光から保護された-20°Cで保管してください。テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリンは、テトラサイクリンよりも長い半減期(2x)を有するため、テトラサイクリンの代わりに使用される。さらに、テトオペロン23の完全な不活性化には、より低濃度のドキシサイクリンが必要である。 注: ドキシサイクリンは内因性 GOI の mRNA 発現に影響を与える可能性があります。これを確かめるために、肺胞細胞に対するドキシサイクリンによる24時間処理の効果を試験して、GOI発現に変化がないことを確認する必要がある(図2)。</li>
	<li>トランスフェクション後のMEM 72時間で新鮮な1μg/mLドキシサイクリン溶液を調製し、37°Cに温めます。</li>
	<li>1 μg/mL ドキシサイクリンを含む完全なMEMの培地を1 mLに交換して、GOIの転写を阻害します。</li>
	<li>GOIのmRNA半減期を評価するために、5%CO2の37°Cで複数のウェルを15分から6時間の異なる時間にインキュベートし、mRNAの半減期を評価します。</li>
	<li>処理の最後に、細胞を氷冷PBSで洗浄し、市販のフェノールクロロホルムRNA抽出キットで、ウェルあたり500μLのバッファーを追加し、プレートを振って細胞を均質化します。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従ってRNAを分離します。230、260、および280 nmの分光光度法によりRNAの収率と純度を測定します。260:230および260:280の比率がそれぞれ1.8および2.0のRNAサンプルは純粋であると考えられる。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>4. GOIのmRNA安定性の決定
<ol><li>RNAAseフリーDNAAse I(増幅グレード)で1μgのRNAを処理し、その後のDNA増幅を妨げる可能性のあるプラスミドDNAの痕跡を除去します。<ol>
<li>0.2 mL PCRチューブで、1μgの総RNA、10倍のDNase I反応バッファーの1 μL、1 μLのDNAse I(1 U/μL)、およびRNAseフリー水を組み合わせて、合計体積10μLを得ます。</li>
		<li>RTで20分間インキュベートします。</li>
		<li>15 mM EDTAの1 μLを10 μLの反応ミックスに加え、70°Cで10分間インキュベートして、DNAse Iを非活性化します。</li>
	</ol></li>
	<li>オリゴ(dT)とランダム六方体プライマーをブレンドした市販のcDNA合成キットを使用して、DNAを枯渇させた全RNAをcDNAに逆転写し、逆転写効率を向上させます。<ol>
<li>簡単に言えば、DNAを使い果たした全RNAミックスの11μLに、4μLの5倍反応ミックス、1μLの逆転写酵素、および4μLのRNAを含まない水を加えて、20μLの総反応量を得る。</li>
		<li>25°Cで5分間反応をインキュベートし、続いて46°Cで20分間インキュベートし、95°Cで1分間インキュベートして反応を不活性化する。各反応は、cDNA生成物の50 ng/μLを生成します。</li>
		<li>20 μLの反応ミックスに180 μLの分子生物学グレードの水を加えて、cDNA反応を5 ng/μLの濃度に希釈します。cDNA製品を-80°Cに保存するか、リアルタイム定量PCR(qPCR)をすぐに実行します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>GOIに固有の前方および逆のqPCRプライマーを設計します。<ol>
<li>細胞中のGOIの内因性発現のために、プライマーは、GOIに結合されたV5エピトープの100-150 bpアンプリコンを増幅するように設計されなければならない(表1)。</li>
		<li>内部参照遺伝子プライマーも正規化制御として使用する必要があります。通常、β-アクチンや低酸素リン酸化酵素リン酸化転移酵素1遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が、参照遺伝子として使用される。しかし、トランスフェクション効率のばらつきにより、この誘導系では使用できません。代わりに、tTA-Ad転写物の発現は、サイトメガロウイルスプロモーターの活性に起因する細胞内での発現が構成されるため、正規化を目的として評価される。qPCRで測定された発現の変動は、トランスフェクション効率の代表となる(プライマー:フォワード5'-GCC TGA CGA GGA AAC TC-3'および逆5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3;129 bpアンプリコン)、トランスフェクションクローンの発現の正常化を可能にする(図3)。</li>
	</ol></li>
	<li>SYBRグリーン染料マスターミックスを使用して、各qPCR反応を三重に調製します。<ol>
<li>分子生物学等の水を用いて、5 ng/μL cDNAミックスを1.25 ng/μLの濃度に希釈します。</li>
		<li>SYBRグリーン色素マスターミックス(2x)の5μL、分子生物学グレードの水の0.1μL、7.5 μMフォワードプライマーの0.45 μL、7.5 μMリバースプライマーの0.45 μL、1.25 ng/μL cDNAの4 μLを組み合わせて、10 μLの総反応量を得る。光学粘着フィルムを使用して、プレートカバーが密閉され、汚染や蒸発を防ぎます。</li>
		<li>遠心分離によって反応ミックスを短時間スピンダウンし、プレートをqPCRサーモサイクラーに入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>次のqPCR条件を使用してV5タグ付きGOIとtTA-Adアンプリコンを増幅:変性ステップとして10分間95°C、10sの場合は95°Cの40サイクル、15 sの場合は58°C、20sの場合は72°C。増幅サイクルが実行された後に高分解能の融解曲線を生成して、目的のアンプリコンの特定の溶融温度を評価し、ノイズアンプリコンのピークがないことを確認する必要があります。<ol>
<li>逆転写酵素のないテンプレートとしてRNAを用いてqPCRを実行し、cDNAをqPCRミックスに加えない場合の制御として機能し、プライマーダイマーの不足を確実にするためにqRT-PCRの陰性制御を含める汚染 物質。</li>
		<li>最適なcDNA濃度、プライマー効率、および濃度は、標準曲線アッセイによりGOIに従って最適化する必要があります。これを行うには、未処理の細胞からcDNAを用いて連続希釈を行う(ドキシサイクリンを含まない培養)。Cq 値を cDNA 希釈係数の対数に対してプロットすることにより標準曲線が生成され、次の式を使用して標準曲線の傾きに従って増幅効率 (E) が計算されます。 E = 10-1/スロープ 注: 増幅効率は約 0.9 ~ 1.05 です。それ以外の場合は、プライマーを再設計する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>比較Cq法を用いて、GOIの発現値をtTA-Adの発現に正規化してGOIの相対発現レベルを取得し、その発現を開始点(t=0)の同じ動物由来の細胞中のGOIのmRNA発現の割合として報告することにより、qPCRデータを分析する(図4)。</li>
	<li>半減期は、以下の式を用いて、GOI mRNA分解曲線の速度定数(K)から決定されます。 t1/2 = ln 2/K.</li>
</ol>

<ol><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li>
<li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li>
<li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li>
<li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+GADD45+and+JNK%2FSAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li>
<li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+isoforms+of+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%2C+NCX1+and+NCX3%2C+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt%2Fprotein+kinase+B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li>
<li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li>
<li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL%3A+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li>
<li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li>
<li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).</li>
<li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+functions+of+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li>
<li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lengthening+of+3%27UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li>
<li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li>
<li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells%3A+involvement+of+purinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li>
<li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+%27megaprimer%27+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGossen%2C+M+%22Tetracyclines+in+Biology%2C+Chemistry+and+Medicine%22">Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine</a>. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).</li>
<li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells%3A+Involvement+of+its+3%27+Untranslated+Region%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li>
<li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modulation+de+la+stabilit%C3%A9+de+l%27ARNm+alphaENaC+dans+les+cellules+%C3%A9pith%C3%A9liales+alv%C3%A9olaires%3A+d%C3%A9termination+du+r%C3%B4le+des+s%C3%A9quences+3%27+non+traduites%22">Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites</a>. , Université de Montréal. (2015).</li>
<li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li>
<li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li>
<li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation-London%22%5BJournal%5D)">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).</li>
<li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+doxycycline%2C+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+pathways+of+RNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li>
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著者らは開示する利益相反を持っていません。

一次培養における肺胞上皮細胞のトランスフェクション率が低いのは、これらの細胞におけるmRNA安定性を評価するTet-Offシステムの使用に対する重大な制限であった。しかし、この制限はピペットエレクトロポレーションによって克服され、25〜30%のトランスフェクション効率を可能にした(図1および図3)26。
トランスクリプト安定性の測定は、特定のmRNAの変調と細胞恒常性および代謝への影響を理解するための基本です。GOIのバイオアベイラビリティの変動は、翻訳効率を変化させ、細胞内のGOIの発現に直接影響を与える可能性があります。これらの理由から、mRNAの半減期を決定するためにいくつかの技術が開発された。上記で説明したように、これらの各手法には、関心のあるトランスクリプトの適切な研究を妨げる制限と制約があります。他の技術と比較して、ここで開発されたTET-offモデルは、任意の実験条件下で与えられたmRNAの半減期推定を...

mRNAの半減期を決定するためにいくつかの技術が開発された。標識された mRNA を利用するパルス追跡減衰技術は、最小限の細胞妨害で mRNA の大きいプールの同時評価を可能にする。しかし、このアプローチは、単一の遺伝子転写物の半減期の直接的な推定を可能にせず、成長因子、ROS、アリン、または炎症1を伴う刺激後のmRNAの転写後変調を研究するために実施することができない。
アクチノマイシンDやα-アマニチンなどの転写阻害剤の使用は、mRNA分解動態を時間の経過とともに測定するための比較的簡単な方法です。以前の技術(パルスチェイス)に対するこのアプローチの主な利点の1つは、所定のトランスクリプトの半減期を直接推定し、異なる治療法がその劣化キネティクスにどのような影響を与えるかを比較する能力に依存しています。しかしながら、転写阻害剤が細胞生理学に及ぼす重大な有害な影響は、アプローチ2の大きな欠点を表す。実際、これらの薬剤による全細胞転写物の阻害は、マイクロRNA(miRNA)などのmRNA安定性に関与する主要元素の合成を摂氏化する悪影響を及ぼし、また、mRNA分解および安定性にとって重要なRNA結合タンパク質の発現および合成を妨げる悪影響を及ぼす。したがって、これらの薬物による遺伝子転写の重度の摂動は、実際にトランスクリプトの分解曲線を変更する可能性がある。
プロモーター誘導系は、特定のmRNAの半減期を測定する第3のアプローチを表す。この方法は、転写阻害剤を使用する方法と同様の方法で特定のmRNAの分解を測定する。2種類の誘導系が頻繁に使用される:血清誘発c-fosプロモーター3およびTet-Off誘導システム4.c-fosシステムでは、細胞に有毒であり得る転写阻害剤の使用は必要ない。しかし、この方法では細胞周期同期が必要であり、これは、フェーズ間5の間に転写物の実際の安定性の評価を防ぐ。対照的に、Tet-Offシステムは、目的の遺伝子(GOI)の強力な発現を、テトラサイクリン調節促進剤の制御下で可能にする。このシステムは、機能するために細胞にコトランスフェクションする必要がある2つの要素の存在を必要とします。第1のプラスミド(pTet-Off)は、ウイルスタンパク質HSV VP16から3つの転写トランス活性化ドメインに融合した原核代圧抑制剤TetR(大腸菌由来)で構成されるハイブリッド合成転写因子である調節タンパク質tTA-Advを発現する。GOIは、合成プロモーター(PTight)の制御下でpTRE-Tightプラスミドにクローン化され、テトオオペレータ配列の7回の繰り返しに融合したサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの最小配列を含む。PTightの下流の遺伝子の転写は、テトオとテトアの相互作用に依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体の存在下で、ドキシサイクリンは、TetRリプレッサーがテトオオペレータに対する親和性を失い、転写4の停止を招く。Tet-Offシステムの特性は、真核細胞6における原核生物調節配列の欠如に対する二次的な多球的効果を回避しながら、真核細胞における特異的mRNA発現の研究に理想的なモデルとなる。通常、二重に安定なテトオフ細胞株(HEK 293、HeLa、およびPC12)は、制御可能な遺伝子発現7、8、9に簡単にアクセスするためのレギュレータおよび応答プラスミドのコピーを統合するためにこのシステムと共に使用される。
培養中の肺胞上皮細胞のいくつかのモデルは、肺胞上皮の細胞および分子生物学を研究するために使用されてきた。何年もの間、研究者は、ヒトまたはげっ歯類の一次細胞10、11だけでなく、ヒトA549またはラットRLE-6TN細胞12、13のような不死化細胞株を広範囲に利用してきた。それらは一般的に増殖が少なく、培養が困難であるが、一次培養における肺胞上皮細胞は、生理学的および病理学的状態における肺胞上皮の機能および機能不全の研究のためのゴールドスタンダードのままである。実際、A549細胞のような不死化細胞株は、初代細胞の複雑な特性および表現型を示さないが、一次培養における肺胞上皮細胞は肺胞上皮の主な特性を再現する一方、特に偏極性および狭いバリア14、15を形成する能力である。残念ながら、これらの細胞は、リポソームを利用するような従来のトランスフェクション技術に対して非常に耐性があり、Tet-Offなどのプロモーター誘導システムの使用は非常に困難です。
mRNAの転写後変調は、転写産物16の遺伝子発現を迅速に調節する最も有効な方法の1つである。mRNA 3'非翻訳領域(3'UTR)は、このメカニズムにおいて重要な役割を果たしている。5'UTRとは異なり、3'UTRの長さと生物の細胞および形態学的複雑性との間には指数関数的な相関関係があることが示されている。この相関は、3'UTRが、mRNA符号化領域と同様に、進化17を通してますます複雑な転写後変調を可能にする自然選択を受けていることを示唆している。3' UTRには、転写物の安定性と翻訳に影響を与えるタンパク質およびmiRNAに対する結合部位がいくつか含まれています。
本研究では、3'UTRのGOIにおける高度に保存されたドメインの役割を調べて、転写安定性を制御するツールを開発しました。我々は、肺胞上皮生理学18において重要な役割を果たす上皮ナトリウムチャネル、αサブユニット(αENaC)に焦点を当てた。一次培養中の肺胞上皮細胞は、Tet-Offシステムの2つの成分に一時的にトランスフェクトされ、他のプロトコルを有する転写阻害剤の使用と比較して細胞生理および代謝に最小限の影響を与えるシステムを用いてmRNA安定性における3'UTRの役割の研究を可能にした。非内因性エピトープ(V5)を用いて、内因性遺伝子の発現とGOIの発現を区別するクローニング戦略が開発された。応答および調節プラスミドは、ピペットエレクトロポレーション技術を用いて肺胞上皮細胞に移された。続いて、異なる時間間隔でドキシサイクリンを細胞にインキュベートすることにより、転写物の発現を測定した。転写物の半減期を、トランスフェクトされたtTA-Ad mRNA産物を正規化に用いて改変Cq法でRT-qPCRにより評価した。我々のプロトコルを通じて、我々は異なる条件下で転写後の変調を研究し、より詳細に未翻訳領域の関与を定義するための便利な方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>アクチノマイシン D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム - 分子生物学グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED INVERTED MICROSCOPE WITH PHASE CONTRAST</td><td></td> <td>Leica-DNase</td><td></td></tr> <tr><td>I, Amplification Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'カルシウムおよびマグネシウムのないリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>エタノール - 分子生物学グレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>エクセラE25コンソールインキュベーターシェーカー</td><td>エッペンドルフ</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol - 分子生物学グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth with agar (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>緑膿菌由来のリポ多糖10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM、粉末</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage Class II 生物学的安全キャビネット</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・サイエンティフィック・イ51025413</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-exU電気泳動システム</td><td>タカラバイオ</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>ネオン・トランスフェクション・システム 10 & マイクロ;L キット</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System スターターパック</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 ベクター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP プラスミド</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Advanced vector</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight vector</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>Purified alveolar epithelial cells</td><td>n.a.n.a.QIAEX</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>II Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN プラスミド マキシ キット</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップ キット</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 および 7 Flex リアルタイム PCR システム ソフトウェア</td><td>Applied Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td><td>R&アンプ;D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸</td>ナトリウム <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TET システム承認済み FBS</td><td>タカラバイオ</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>トブラマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Water, Molecular biology Grade</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table> (英語)

原発性歯槽上皮細胞におけるmrna転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

転写後の調節を研究することは、与えられたメッセンジャーRNA(mRNA)の変調と細胞恒常性および代謝への影響を理解するための基本である。実際、トランスクリプト発現の変動は、翻訳効率と最終的にはトランスクリプトの細胞活動を変える可能性があります。mRNAの半減期を調べるいくつかの実験的アプローチが開発されているが、これらの方法のいくつかは、転写後変調の適切な研究を妨げる限界がある。プロモーター誘導系は、テトラサイクリン調節促進剤の制御下で目的の遺伝子を発現することができる。この方法は、細胞恒常性を乱すことなく、任意の実験条件下での与えられたmRNAの半減期推定を可能にする。この方法の大きな欠点の1つは、従来のトランスフェクション技術に対して非常に耐性のある単離プライマリ細胞でのこの技術の使用を制限するトランスフェクト細胞の必要性である。初等培養における肺胞上皮細胞は、肺胞上皮の細胞および分子生物学を研究するために広く使用されてきた。原発性肺胞細胞のユニークな特徴と表現型は、これらの細胞に関心のある遺伝子の転写後の調節を研究することを不可欠にします。そこで、我々の目的は、一次培養における肺胞上皮細胞に関心のあるmRNAの転写後変調を調査するための新しいツールを開発することであった。我々は、転写制御されたプラスミド発現系を原発性肺胞上皮細胞に挿入するための迅速かつ効率的な一時的なトランスフェクションプロトコルを設計した。このクローニング戦略は、ウイルスエピトープを使用して構築物にタグを付け、内因性mRNAの構造発現から容易に識別することを可能にする。改変ΔΔ定量サイクル(Cq)法を用いて、転写物の発現を異なる時間間隔で定量して半減期を測定することができる。我々のデータは、原発性肺胞上皮細胞における様々な病態生理学的状態における転写後調節を研究する上で、この新しいアプローチの効率を示している。

このプロトコルは、テトオフ転写制御プラスミド発現系を生成し、一次肺胞上皮細胞における転写安定性の変調におけるαENaC 3'UTRの異なる部分の重要性を評価するために成功した。
このシステムの導入の第一歩は、一次培養において肺胞上皮細胞に対する迅速かつ容易で効率的なトランスフェクション技術を確立することであった。図1に示すように、ピペットエレクトロポレーション技術は、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって検出されたeGFP細胞の比率によって示されるように、25〜30%のトランスフェクション効率率を可能にした。
テトラサイクリンとその誘導体によって制御されるこの誘導系を適用する前に、この薬剤がGOIの発現に及ぼす影響が確認されました。肺胞上皮細胞を1.0 μg/mLドキ...

ここでは、ピペットエレクトロポレーション技術に結合した誘導発現系を用いて、一次肺胞上皮細胞における転写物の転写後変調を研究するために使用できるツールを提示する。

原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

そこで我々のモデルは、一次培養中の肺胞上皮細胞における特定の転写産物の転写後調節とその生理学的および病的生理学的状態の研究を可能にする。したがって、原発性肺胞上皮細胞の一過性トランスフェクションは、細胞生理学および代謝に対する影響を最小限に抑え、転写阻害剤を使用した古典的なプロトコルよりも明確な利点をもたらす。目的の遺伝子を発現する応答プラスミドの生成については、その遺伝子の配列、および誘導可能ベクターの複数のクローニング部位を分析して、遺伝子内に存在しない複数のクローニング部位の認識配列を同定する必要がある。高忠実度のtaqポリメラーゼおよび標準的なオーバーラップPCR技術を使用して、デザイナープライマーを使用して2つの選択された制限酵素認識部位で目的の遺伝子を横取りする。対象となる遺伝子のV5エピトープ上流をコード化する配列は、遺伝子の発現と内在性発現を区別するために含まれなければならない。変異体は、連続的な欠失によって生成され、未翻訳領域の3つの素端を徐々に削除するポリアデニル化部位をコードするリバースプライマーを用いて遺伝子のmRNAの安定性に対する異なる3つの素数未翻訳領域の影響を研究することができる。最終的には、対象遺伝子の挿入は制限分析によって確認できる。rtPCR中に導入される可能性のある遺伝子の向きおよび変異の欠如は、シーケンシングによって確認することができる。原発ラット肺型2つの肺胞上皮細胞のトランスフェクションのために、完全な最小必須培地の存在下で100ミリメートルペトリ皿で10〜6平方センチメートルの細胞を1回10〜6番目の細胞に播種する。湿度の5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間培養。翌日、新しい12ウェルプレートの各ウェルに抗生物質なしで完全な培地の500マイクロリットルを追加し、30分間摂氏37度でプレートを予熱します。このインキュベーション中に、応答プラスミドのマイクログラムを1マイクログラム、1マイクログラムの調節ベクトルをウェルあたり1.5ミリリットルチューブに加えます。カルシウムやマグネシウムを含まない37°CPBSのウェルあたり10ミリリットルで肺胞上皮細胞を洗浄し、細胞培養インキュベーターで摂氏37度のウェルあたり5ミリリットルで細胞を処理します。細胞が剥離したら、抗生物質なしで完全な培地の井戸あたり10ミリリットルでトリプシンを中和し、新しい50ミリリットルのチューブに細胞を収集します。新鮮な培地の4ミリリットルで皿を洗い、残りの細胞を収集し、遠心分離によって細胞を沈めます。細胞をカウントし、遠心分離するためにPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。ペレットを再懸濁バッファーのミリリットル当たり4倍の密度で10倍から7番目の細胞に再懸濁し、プラスミドおよびベクターの各チューブに5番目の細胞に4倍10を加え、穏やかな混合を行います。エレクトロポレーション装置にチューブを1つ入れ、電解バッファーの3.5ミリリットルでチューブを充填します。ピストンを完全に押し込んで、金めっき電極チップをピペットに挿入し、チューブの内容物を軽く混ぜます。ピペットで細胞を慎重に吸引し、クリック音が聞こえるまでピペットをエレクトロポレーションステーションに挿入します。肺胞上皮細胞に適したエレクトロポレーションプロトコルを選択し、タッチスクリーン上でStartを押します。トランスフェクションの直後に、ピペットを取り出し、予め温めた12ウェルプレートの1つのウェルに細胞を移します。すべての細胞が電気ポレートされ、メッキされたら、プレートを細胞培養インキュベーターに入れ、2日後に完全な培地で各ウェルの上清を置き換える。トランスフェクションの成功は、制御ベクターを用いた蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで観察されるEGFPの発現によって確認できる。関心のある遺伝子の転写を阻害するために、トランスフェクション後72時間は、新たに調製されたアドキシサイクリンのミリリットル当たり1マイクログラムで補った完全な培地のウェルあたり1ミリリットルで上清を置き換える。目的の遺伝子のmRNA半減期を評価するために、プレートを細胞培養インキュベーターに15分から6時間戻す。1ミリリットルの氷冷PBSで1つよく洗浄してから、市販のフェノールクロロホルムRNA抽出キットから500マイクロリットルの溶菌バッファーで細胞を溶かし、各実験時間で穏やかな揺れを行う。次に、キットの指示に従ってRNAを分離し、230、260、および280ナノメートルで分光光度法によってRNAの収量と純度を決定します。単離されたRNAの安定性を決定するために、まず、各サンプルから全RNAの1マイクログラムをRNaseフリーDNase 1で処理し、プラスミドDNAの痕跡を除去します。市販のcDNA合成キットをオリゴdTとランダムヘキソマープライマーのブレンドで使用して逆転転写効率を向上させ、メーカーの指示に従ってDNA枯渇した総RNAをcDNAに逆転転写します。180マイクロリットルの分子生物学グレードの水を反応ミックスの20マイクロリットルに加え、cDNA反応をマイクロリットル当たり5ナノグラムで希釈し、新鮮な分子生物学グレードの水でcDNAミックスをすぐに希釈して、マイクロリットル濃度あたり1.25ナノグラムに達します。5マイクロリットルのサイバーグリーン染料マスターミックスを0.1マイクロリットルの分子生物学グレードの水、0.45マイクロモルフォワードプライマーの0.45マイクロリットル、7.5マイクロモルリバースプライマーの0.45マイクロリットル、およびcDNAのマイクロリットル当たり1.25マイクログラムの4マイクロリットルを組み合わせて、10マイクロリットルの総反応量を得る。サンプルをqPCRサーモサイクラーに入れ、示されたqPCR条件を使用して目的のV5タグ遺伝子およびテトロサイクリントランスアクティベーターアドバンスアンプリコンを増幅し、高分解能融解曲線を生成して、所望のアンプリコンの特定の溶融温度を評価し、ノイズアンプリコンピークがないことを確認します。このピペットエレクトロポレーション技術は、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって検出されたEGFP細胞の比率によって観察される25〜30%のトランスフェクション効率率を促進する。ドキシサイクリンの1ミリリットル当たり1マイクログラムの肺胞上皮細胞の治療は、治療期間中の任意の時点で内因性αENaC mRNAの発現に有意な影響を及ぼさない。実証したように転写制御プラスミド発現系を用いて、V5αENaCシグナルはテトラサイクリントランスアクティベーターアドバンストシグナルに従って正規化し、二重デルタ定量サイクル法を用いてトランスフェクションの効率を決定することができた。αENaC mRNAの半減期は、テトラサイクリンオフシステムの存在下でアクチノマイシンDの存在よりも最大7倍短く、アクチノマイシンDがアーティファリファαENaC mRNA安定化につながることを確認する。また、シクロヘキサミド及び腫瘍壊死因子α治療は転写物の安定性を著しく低下させるが、リポ多糖類は低下しない。V5 α ENaC mRNA 安定性の変調の有意な変化は、3つの素数未翻訳領域の削除および含まれる領域に応じて誘導され得る。さらに、特異的RNA結合タンパク質の過剰発現は、空のpcDNA3種のプラスミドを用いたトランスフェクションと比較して、5-α ENaC mRNAの安定性を低下させる。このツールは、肺胞上皮の機能およびその生理学的または病理学的状態に関与する主要遺伝子の転写後の調節に関する新しい洞察を問い合わせるための有用なツールです。

efficient-transcriptionally-controlled-plasmid-expression-system-for

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。...

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

この動画では、目的の遺伝子を含むプラスミドと制御プラスミドをトランスフェクションして、培養細胞の遺伝子発現を制御する方法を説明しています。このプラスミドの発現は、テトラサイクリンまたはその合成類似体によって制御できるため、このシステムは調節可能な遺伝子発現を研究するための有用なモデルとなっています。...

誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

トランスジェニックマウスまたはウイルスベクターは、肺内のタンパク質の発現を増加させるために使用されてきた。しかしながら、これらの技術は、技術的に困難な、時間がかかり、その結果を混乱させることができオフターゲット作用を有する。当社タンパク質トランスフェクションプロトコルは、脂質ベースのトランスフェクション試薬と一様に肺細胞に活性なタンパク質を提供する超microsprayerを使用しています。...

マウス肺のタンパク質トランスフェクション

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

初代ヒト気管支上皮細胞は形質導入が困難です。このプロトコルは、レンチウイルスの産生とその濃度、および偽層別皮への分化を通じてこれらの細胞で非常に効率的な形質導入を達成するために必要な最適な培養条件について説明しています。...

正常に伝達する初代ヒト気管支上皮細胞に必要な最適なレンチウイルスの生産および細胞培養条件

異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。...

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

マクロファージ、特に一次マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化しているため、トランスフェクトに挑戦しています。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。...

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

ここでは、長期バイオバンキングのための初代気管支上皮細胞の単離と増殖、および気液界面での培養による分化上皮細胞の生成のための、再現性があり、手頃な価格で堅牢な方法を紹介します。...

バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

このプロトコルは、新生児、幼獣、成体のマウス肺(感染者・非感染者問わず)から生存可能な肺胞タイプII上皮細胞(AECII)を分離するためのフローサイトメトリー法を提示します。このアプローチにより、AECIIの分子および/または機能的研究が下流で、肺の炎症や感染におけるその役割を特定することが可能になります。...

感染性実験環境に適応可能な新生児、若年、成体のマウス肺から肺胞II型上皮細胞の単離

学ぶ 原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための誘導型発現システムとピペット電気穿孔法を用いた効率的な転写制御プラスミド発現システム。この手法は細胞生理への影響を最小限に抑え、遺伝子発現の翻訳後調節を詳細に解析可能にします。

原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム

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