Name: バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶ切除肺組織からの気管支上皮細胞単離と気液界面培養法。ロバストで費用対効果の高い手法により、長期バイオバンキングと高分化培養が可能になり、呼吸器疾患のメカニズム解明や治療薬スクリーニングに応用できます。

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この寄稿で説明されているモデルを使用した研究は、オランダ肺財団、オランダ健康研究開発機構(ZonMw、COVID-19 MKMD助成金)、オランダ動物実験代替協会(Stichting Proefdiervrij、助成金#114025007)、ベーリンガーインゲルハイムやガラパゴスなどの企業からの研究助成金など、さまざまな資金提供機関によってサポートされています。 図 1 は BioRender.com を使用して作成しました。

著者は、関連する利益相反がないことを宣言します。

ここで提示するプロトコルは、切除された肺組織からのヒト気管支上皮細胞の単離、分化能を失うことなく細胞を最適に増殖させる方法、凍結保存手順、および高分化型ALI-PBEC培養物を生成するための手順について説明しています。さらに、品質管理の説明、および差別化されたALI-PBECの監視と評価の手順が提供されます。
説明されているプロトコルは、肺がんの診断に関連する手術を受けている患者の肺葉から切除された肉眼的に正常な腫瘍のない気管支リングから始まります。したがって、これらのリングは厳密には健康な組織と見なすことができず、したがって細胞培養特性に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。気管支上皮細胞を得るための代替供給源には、気管支生検、気管支ブラッシング、または移植ドナーまたはレシピエント肺からの組織を使用することが含まれる。発生源に関係なく、肺組織を使用する場合、微生物汚染のリスクを考慮する必要があるため、細胞培養の微生物汚染のリスクを減らすために、さまざまな培養培地で抗生物質が使用されます。特に、マイコプラズマは、細胞培養に対する多種多様な影響、細胞培養で一般的に使用される抗生物質に対する耐性、およびマイコプラズマ汚染がマイコプラズマ検出アッセイによってのみ確認できるという事実のために、細胞培養における高い一般的なリスクです。したがって、肺組織から細胞を単離した後の細胞培養の初期段階では、広域スペクトル抗菌製剤プリモシンが使用され、培養プロセス中に、無作為に選択されたサンプルがマイコプラズマの存在について試験される。
気管支リングから始まる単離手順は、分化能力を損なうことなくALIで培養を開始するために必要なこれらの初代細胞の増殖の程度を可能にするのに十分な出発材料を提供します。しかし、限られた細胞数で単離された上皮細胞の増殖を開始することは、ALI培養のために播種することができる十分な細胞を有する十分な数のインサートを得ることに問題を引き起こす可能性がある。初代細胞の長期培養および反復継代は、複製老化をもたらす可能性がある。この制限を克服するために、さまざまなソリューションが提案されています。Horaniらは、Rhoキナーゼ阻害剤(ROCK)Y−27632が基底細胞の増殖を増加させることを示し30、Mouらは、分化した上皮細胞層31の特性を維持しながら基底幹細胞を拡張するために二重Smad阻害を使用し、Sachsらは、気道上皮細胞を拡張し、複数回継代の過程でそれらの分化能を維持するために使用することができる気道オルガノイド系を開発した32.後者の方法は、早産児(妊娠28週齢&lt;)からの気管吸引液(TA)や気管支肺胞洗浄(BAL)液などの細胞数が非常に少ないソースから細胞を増殖させるためにも使用され、ここで説明するようにALI培養に移しました33。BALおよびTAから単離された細胞は、気管支組織から生成された細胞と同様の分化能力を示したが、Notchシグナル伝達阻害またはTh2サイトカインIL-13を用いてより繊毛またはより多くの杯細胞含有培養物に分化が偏った場合、差異が観察された33。したがって、ALI-PBECを同様のアプローチで上皮細胞数の低い出発物質から培養する場合は、プロトコルのセクション6で説明されているように、基本的な品質基準について培養物を常に確認することをお勧めします。重要なことに、フィーダー細胞の使用は、時間と細胞数が不可欠な移植可能な足場工学の設定で不可欠な、より大きな細胞数の取得にも役立つ可能性があります。このことは、気管疾患患者由来の生検から自家上皮細胞を培養し、マウス胚フィーダー層(有糸分裂的に不活化された3T3-J2線維芽細胞)および上記のRho/ROCK経路阻害剤(Y-27632)の存在下で細胞を急速に増殖させた研究によって示されています34。得られた細胞培養は、気管足場の再増殖に有用であることが見出され、したがって、これは移植モデルに適したプロトコルと見なすことができる。
この貢献で説明されているプロトコルを使用する場合だけでなく、他の培養プロトコルを使用する場合も、必然的に選択バイアスが導入されます。培養を開始するために使用される細胞の起源、培地組成、およびその他のプロトコルの詳細などのプロトコルの詳細の違いは、培養物の細胞組成の変化、ひいてはALI培養の応答の変化につながる可能性があることを認識することが重要です33、35。加えて、気道細胞10、11を分化させるための異なる培地を比較すると、細胞特性の違いも観察された。PneumaCult培地とcBD培地を比較すると、杯細胞とクラブ細胞のmRNAマーカー、TEER値、および細胞層の厚さに違いが見られました。これらの観察に基づいて、統計的裏付けがないにもかかわらず、使用されるドナーの数が少なく、培地組成が顧客に知られておらず、PneumaCult培地のコストが高いため、私たちの研究室ではcBD培地を使用することが決定されました。
説明したように、細胞はオルガノイド培養を使用して最初に増殖させ、その後2D ALIインサートシステムに移すことができます。気道上皮オルガノイドは空気浮遊物質への曝露には適していないのに対し、ALI 2Dシステムを使用すると、タバコの煙23,36などの浮遊物質が培養気道上皮細胞に与える影響を評価できるため、これは重要です。ALI気道上皮細胞培養を確立するための別のアプローチは、ヒト多能性幹細胞(hiPSC)の分化によって気道上皮細胞を生成することです37。このようなプロトコルでは、近位気道前駆細胞への分化後の分化プロトコールの最終段階で、ここで説明したものと同様の手順を用いてALIへの培養によって細胞を分化させることができる。
現在のプロトコールでは、ALIでの培養にはcBD培地が用いられている。cBD培地は、Fulcherら38 および他の研究に触発された、異なるサプリメントの混合物を加えることによって調製される無血清培地である。サプリメント溶液には、52 μg/mLのウシ下垂体抽出物(BPE)、0.5 μg/mLのヒドロコルチゾン、0.5 ng/mLのヒトEGF、0.5 μg/mLのエピネフリン、10 μg/mLのトランスフェリン、5 μg/mLのインスリン、6.5 ng/mLのトリヨードサイロニン、および0.1 ng/mLのRA39が含まれています。BPEは組織抽出物であり、バッチごとの変動を受けるため、培地を完全に定義された培地と見なすことはできず、動物を含まないものでもありません。完全に定義された細胞培養培地は、バッチ間の差異を最小限に抑えるために好ましい。動物を含まない研究への移行を考慮すると、動物性食品を含まず、科学界にとって手頃な価格の定義された培地を作成するための努力がなされることが重要です。
研究課題に応じて、ALIモデルに基づいてさまざまな実験セットアップを使用できます。例えば、分化プロセスに影響を与える可能性のある化合物の影響を調べるために、これは、水中培養のさまざまな段階、分化中、または高分化段階で化合物を培養物に添加することによって対処できます。ALI-PBEC培養物の細胞組成は、特定の化合物を添加することによって影響を受ける可能性があります。例えば、IL-13の存在下でALI-PBECを分化させると、より多くの杯細胞とより少ない繊毛細胞を含む培養が生成されますが、分化中にγセクレターゼ阻害剤DAPT(Notchシグナル伝達をブロックするために使用)で処理すると、杯細胞を犠牲にしてより多くの繊毛細胞で培養されます23,40,41,42。
さらに、細胞を刺激するか、または特定のプロセスを遮断する薬剤は、基底区画に適用することも、培養物の頂端区画に(非常に少量で)適用することもできる。細胞は、頂端側から空気中の物質にさらされることもあります。このような暴露設計は、PBECに対するディーゼル排気ガスまたはタバコの煙全体の影響を研究するために使用されています23,43,44。培地は、培地を交換するたびに回収して、基底側で分泌されたタンパク質をモニターすることができます。基礎培地をリフレッシュしながらPBSで洗浄した細胞の頂端側についても同様である。いわゆる頂端洗浄液を採取し、オプションのジチオエリスリトール(DTE)を添加して、杯細胞によって生成される粘液をより効率的に解離します。細胞ライセートは、総タンパク質、RNA、染色体およびミトコンドリアDNAの単離のために得ることができます。細胞は、プラスチックインサートからポリエチレンテレフタレート(PET)膜を切断し、さらにこの膜を複数の免疫蛍光染色のためにより小さな断片に切断することによって、特異的マーカーに対する抗体を用いてさらに研究することができる45。さらに、フローサイトメトリーまたはFACSは、インサート内の細胞のトリプシン処理後に使用することもできる。ALI段階では、電気抵抗を測定し、続いて電気抵抗がメンブレンインサートの表面積に反比例するTEERを計算することにより、細胞バリアの発達をモニターできます。計算は、次の式を使用してオームの法則に基づいています:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;">ここで、Rmは測定された電気抵抗、Rbはコーティングおよびセルのないインサートのベースライン電気抵抗、SAはインサートの膜の表面積です。EVOM2およびSTX/箸電極を使用した電気抵抗の測定は簡単ですが、ウェルに導入する際の取り扱い手順に大きく依存します。また、電極の形状は比較的大きな表面積17のバリア機能の測定に影響することが示唆された。
正確な組織表現を増加させることを目的としたALI細胞培養システムのさらなる改善には、白血球、線維芽細胞または内皮細胞などの追加の細胞型の共培養が含まれる46,47,48。ALI-PBECと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)またはM-CSF分化マクロファージとの共培養は、自然上皮応答および修復に著しく影響することが観察されている48。このような共文化モデルでは、中程度の互換性が問題になる可能性があることに注意することが重要です。気道上皮細胞培養に使用される培地はPBEC専用に開発されており、他の細胞種には最適ではない可能性があるため、最適化が必要です。単離されたPBECを使用できる気道生物学の分野で見られる別のタイプの進歩は、臓器チップ(OoC)技術の使用です49,50。この技術を使用して、ストレッチ、空気、媒体の流れなどの呼吸と血流の機械的な力の影響を調べることができます29。
さまざまなドナーからのPBECを使用する場合、ドナー間の変動性は重要である可能性があるため、上皮細胞培養研究でこの変動性を説明するために、複数のドナーからの細胞を使用することを検討することが重要です。ALI-PBECの培養には時間がかかり、かなりのコストがかかるため、1つの細胞培養インサートで異なるドナーの細胞を混合してALI-PBEC培養を確立するオプションを検討します。このようにして、様々な個々のドナーに由来する培養物の応答を分析する前に、初代細胞を用いてパイロット実験を容易に行うことができる。さらに、異なる特性(例えば、異なる年齢カテゴリーまたは性別)を有するドナーを、探索的研究のためにグループ化することができる。ドナーミックスを使用する場合、より高い増殖率の結果として1人のドナーが結果を支配する可能性を防ぐために、異なるドナーの等しい細胞数が存在することを確認することが重要です。したがって、個々のドナーからの細胞は別々に増殖され、個々のドナーからの細胞の播種と比較してインサート内でより高い密度で播種され、ALIに移行する前のインサートでの増殖を最小限に抑える。ドナーミックスと対応する個々のドナーの反応は、SARS-CoV-2の感染動態を研究することによって比較されました。RT-qPCRおよび免疫蛍光染色を用いて、ドナーミックスは、産生されたウイルス粒子の数が同程度で、感染細胞の数が類似していることを示すことにより、様々な個々のドナーの良好な表現を提供することが観察された28。
動物モデルにとって許容可能な代替手段となるためには、培養気管支上皮細胞の遺伝子編集が実行可能であるべきである51。ALI-PBECに低分子干渉RNA(siRNA)を用いることによるRNA干渉技術を検討しているが、培養液中に細胞にsiRNAをトランスフェクトする必要があるため、培養中にsiRNAトランスフェクションを頻繁に繰り返さない限り、ALI培養中は培養期間が長いため、ノックダウンが十分に維持されない52.それにもかかわらず、siRNAは、水中基底細胞における遺伝子発現を改変するために首尾よく使用することができる。また、CRISPR/Cas9技術を用いて、リボ核タンパク質(RNP)送達を用いた初代ALI気道上皮細胞培養において遺伝子編集に成功した者もいる 53。このような技術を使用する場合、細胞が完全な分化能力を維持することが不可欠です。初代気道細胞培養は無期限に継代できないため、遺伝子編集細胞のクローン増殖は容易ではなく、トランスフェクト細胞を選択するための培地の追加は煩雑です。そのため、全ての培養細胞において望ましいノックダウンを達成することは困難である。ノックアウトクローンを生成するための代替案は、hiPSCにおけるノックアウト戦略の使用54 および気道上皮細胞を生成するためのこれらの細胞の使用である。最適ではないが別の代替案は、遺伝子編集細胞55をクローン的に増殖させるために不死化PBEC系統を確立することである。
ここで提示されたプロトコルは、高度に分化した疑似層別化ALI-PBECを生成する1つの方法ですが、提示されたプロトコルと比較して、より小さな違いと大きな違いで、そのような文化を確立する他のプロトコルも見出されています。私たちの意見では、ALI-PBECシステムおよび気道上皮細胞の同様の培養システムが動物実験の有効な代替手段になるには、培養方法の実験室全体の検証と厳格な品質管理が不可欠です。

様々な急性および慢性肺疾患における気道上皮の役割は、様々なレビューに記載されている1、2、3、4、5、6、7。気道上皮細胞の高分化培養は、気道上皮の役割を解明するための重要なツールです。気液界面(ALI)気道上皮細胞培養は、気道基底上皮細胞の分化を促進し、それによって気道上皮を確実にin vitroで研究するために広く適用されています8,9。過去数年間で、COVID-19パンデミックに関連する新しい研究イニシアチブと動物を含まない研究への世界的な移行の結果として、そのようなモデルの使用はさらに増加しました。したがって、このモデル細胞株の使用の増加は、堅牢な結果を得るための手順と経験を共有する必要性を強調しています。これにより、研究グループ間の結果の比較も可能になります。手順の堅牢性は重要な特性であるため、品質管理を受ける必要があります。いくつかの研究所は、ALIで一次気道上皮細胞を培養するためのプロトコルの開発に投資しています。これらの手順を詳細に共有することで、時間、労力、必要な予算を削減できます。これらの詳細には、例えば、様々な製造業者によって提供される細胞培養プラスチックおよび培地の選択が含まれ、これが得られる培養物の特性に影響を与えることが見出されたからである10、11、12。これは、そのような洞察がない場合、結果が影響を受けたり、さまざまなラボにわたる検証作業が妨げられたりする可能性があるため、培養手順の経験と詳細を共有することの重要性を強調しています。
ヒト肺上皮は、基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、クラブ細胞などの主要なタイプを含むさまざまな細胞タイプで構成されています。in vitroで気道の上皮細胞層を確実に模倣するためには、これらの細胞型を培養モデルで表し、それらの分極と機能を維持する必要があります13、14、15、16。ドナーの特性(疾患状態を含む)および細胞の解剖学的起源(すなわち、鼻、気管、大および小の気道)が細胞培養の細胞組成および機能応答に影響を与える可能性があることの認識も同様に重要である。関連する専門知識と実践は、初代気道上皮細胞を正常に培養し、直感的に(培養中の目視検査によって)そして定量的に培養の品質を評価するための前提条件です。この貢献の目的は、気管および小気道上皮細胞の培養にも適用できる、初代ヒト気管支上皮細胞(PBEC)の単離および培養のための費用効果と時間効率の高い方法を提供することです。切除された肺組織からそのような細胞を単離する方法を説明することに加えて、拡大およびバイオバンクのための方法、そして最後に妥当なコストと期間内での高分化型ALI培養の確立および特性評価のための方法が提示され、議論される。

<table><tbody><tr><td>1,000オームのテスト抵抗器</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>EVOM2 Epithelial Voltohmmeter</td></tr><tr><td>4-[2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)エチニル)-安息香酸(EC 23)</td><td>Tocris</td><td>4011</td><td>cBD培地で使用</td></tr><tr><td>6ウェルクリアTC処理マルチウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3506</td><td>気管支から単離された細胞を成長させるための最初のステップで使用されますリング&nbsp;</td></tr><tr><td>気道上皮細胞増殖培地キット</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>cBD培地と比較するために使用されます</td></tr><tr><td>ビーズバス 20リットルラボ</td><td>アーマー74220-720</td><td></td><td>細胞培養液を温めるために使用されます</td></tr><tr><td>BEGM 気管支上皮細胞増殖培地 BulletKit</td><td>LONZA</td><td>CC-3170</td><td>cBD培地と比較するために使用されます</td></tr><tr><td>牛アルブミン画分V(BSA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15260037</td><td>コーティング液に使用</td></tr><tr><td>ウシ下垂体抽出物(BPE)</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>37000-015</td><td>c-KSFM</td></tr>気<tr><td>管支上皮細胞増殖サプリメント(BEpiCGS)</td>に使用サイ<td>エンセル研究所</td><td>3262</td><td>cBD培地に使用</td></tr><tr><td>気管支上皮細胞培地-基礎(BEpiCM-b)</td><td>サイエンセル研究所</td><td>SCC3211-b</td><td>cBD培地</td></tr><tr><td>に使用細胞培養インサート;12 mmトランズウェル、0.4 & マイクロ;m細孔ポリエステル膜インサート</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>プロトコルで使用される細胞培養</td></tr><tr><td>インサート 細胞培養インサート; 12ウェルインサート、0.4 &micro;m PETクリア</td><td>CellQART 製 SABEU 製</td><td>9310412</td><td>細胞培養インサート Corning細胞培養インサートと比較するために使用</td></tr><tr><td>細胞培養インサート; 12ウェルThinCert 組織培養インサート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>Corning細胞培養インサートと比較するために使用される細胞培養インサート</td></tr><tr><td>CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td> 数<td>細胞を拡大するために使用されます</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>CFX384 システムで生成された qPCR データを解析するためのソフトウェアプログラム</td></tr><tr><td>CFX384 Touch リアルタイム PCR 解析システム</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484</td><td>qPCR 解析システム</td></tr><tr><td>チョップスティック電極セット</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td> ALI-PBEC <td></td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>PHCbi の電気抵抗の測定に使用</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>マイクプラズマフリー細胞培養に使用される細胞培養インキュベーター</td></tr><tr><td>CO2-インキュベーター</td><td>ヘラウス</td><td>ヘラセル 150</td><td>マイクプラズマに感染した可能性のある細胞培養に使用される細胞培養インキュベーター</td></tr><tr><td>クールセルコンテナ</td><td>コーニング</td><td>432006</td><td>-80°Cで細胞を凍結保存するために使用されます。液体N2</td></tr><tr><td>Countess 3 自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AMQAX2000</td><td>細胞の数をカウントし、細胞濃度を決定するために使用されます</td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td> D-グルコース<td>の細胞を凍結保存するために使用されます</td></tr><tr><td></td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>ソフトトリプシン</td></tr><tr><td>に使用 ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Avantor VWR</td><td>0231</td><td>細胞凍結培地</td></tr><tr><td>dNTP(10 mM)</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルス培地(DMEM)+ 4500 mg / l D-グルコース</td>の合成に使用 <td>STEMCELL Technologies</td><td>36250</td><td>cBD培地</td></tr>ダル<tr><td>ベッコ修正イーグル培地(DMEM)4.5 g / lグルコースとl-グルタミンLONZA</td><td></td><td>LOBE12-604F</td><td>で使用cBD媒体で他のメーカーのDMEMと比較するために使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルスメディウム(DMEM)、高グルコース、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>41966029</td><td>他のメーカーのDMEMと比較するためにcBD培地で使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>上皮成長因子(EGF)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>37000-015</td><td>c-KSFMエ</td></tr><tr><td>チレンジアミン四酢酸(EDTA)</td>に使用 <td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>軟質トリプシン</td></tr><tr><td>に使用 EVOM2 上皮電圧計</td><td>World Precision Instruments</td><td>91799</td><td>箸電極セットでALI-PBEC</td></tr><tr><td>フィブロネクチン溶液中の電気抵抗を測定するために使用&nbsp;</td><td>コーティング液に使用</td> <td>PromoCell</td><td>C-43060</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>cBD培地に使用</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>プロテアーゼの溶解に使用 XIV&nbsp;</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>qPCR 試薬</td></tr><tr><td>イソプロテレノール塩酸塩、(-)-</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td> に使用 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17005-034</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>に使用 Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>自動 RNA 単離システム</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>Maxwell RSC装置で全RNAを単離するために使用</td></tr><tr><td>M-MLV 逆転写酵素</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>m-MLVの合成に使用 逆転写酵素5X反応バッファー</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td>の合成に使用 <td>細胞培養サンプル中のマイコプラズマの存在を検出するために使用</td></tr><tr><td>N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630056</td><td>cBD培地に使用</td></tr><tr><td>オリゴ(dT)<サブ>15</>サブ</td><td>キアゲン</td><td>79237</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ペン/連鎖球菌</td>)の合成に使用サイ<td>エンセル研究所</td><td>SCC0513</td><td>c-KSFMおよびcBD培地の抗生物質として使用されます</td></tr> リン酸<tr><td>緩衝剤生理食塩水(PBS)</td><td>LUMCの薬局</td><td>N/A</td><td>プロトコルの異なるステップで使用</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI媒体</td><td>STEMCELL技術</td><td>05002</td><td>cBD培地と比較するために分化段階で細胞を成長させるために使用</td></tr><tr><td>Pneumacult-Exプラス培地</td><td>STEMCELL技術</td><td>05040</td><td>cBD培地と比較するために水中段階で細胞を成長させるために使用</td></tr><tr><td>プライマー、ATP5B、フォワード</td><td>統合DNATechnologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>Primer、ATP5B、逆</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>Primer、FOXJ1、フォワード</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer、FOXJ1、逆</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>プライマー、MUC5AC、フォワード</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>プライマー、MUC5AC、逆</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>プライマー、MUC5B、フォワード</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:GGGCTTTGACAAGAGAGT</td></tr><tr><td>プライマー、MUC5B、逆</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>ズ N/A</td><td>塩基配列:AGGATGGTCGTTGATGCG</td></tr><tr><td>プライマー、RPL13A、フォワード</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>ズ N/A</td><td>塩基配列:AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>プライマー、RPL13A、逆</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>ズ N/A</td><td>塩基配列:CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>プライマー、SCGB1A1、フォワード</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列: ACATGAGGGAGGCAGGCTC</td></tr><tr><td>プライマー, SCGB1A1, 逆</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>Primer, TP63, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列: CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>Primer, TP63, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>塩基配列:TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>c-KSFM培地の細菌、マイコプラズマ、真菌に対する抗菌剤として使用</td></tr><tr><td>プロテアーゼXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>気管支リングRNAsinの酵素治療に使用</td></tr><tr><td>組換えリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>大豆トリプシン阻害剤(SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>ソフトトリプシンT100の作用を阻害するために使用される</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>1861096 cDNAの合成に使用</td></tr><tr><td>TissueSAFE plus</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>生体試料用真空転写システム</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15250061</td><td>生細胞と死細胞のカウントに使用&nbsp;</td></tr><tr><td>トリプシン 1:250</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>27250-018</td><td>ソフトトリプシン</td></tr><tr><td>I型コラーゲン溶液(PureCol)</td>に使用高度な<td>バイオマトリックス</td><td>5005-B</td><td>コーティング溶液に使用</td></tr><tr><td>ユニバーサルコンテナ、PP、PEスクリューキャップ付き</td><td>アバンターVWR</td><td>216-2053</td><td>気管支リングのプロテアーゼXIV治療のプロトコルに使用</td></tr></tbody></table>

バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

気道上皮細胞層は、肺組織と外部環境との間の最初の障壁を形成し、それによって感染性病原体や大気汚染物質などの吸入物質に絶えずさらされます。気道上皮層は、多種多様な急性・慢性肺疾患において中心的な役割を果たしており、この上皮を標的とした様々な治療が吸入によって行われています。病因における上皮の役割と、それを治療の標的にする方法を理解するには、堅牢で代表的なモデルが必要です。 in vitro 上皮培養モデルはますます使用されており、制御された環境で実験を行い、細胞をさまざまな種類の刺激、毒物、または感染因子にさらすという利点があります。不死化または腫瘍細胞株の代わりに初代細胞を使用することは、これらの細胞が培養中に細胞株と比較して上皮のより良い表現を有する偽層別分極上皮細胞層に分化するという利点を有する。
ここでは、肺組織からの気道上皮細胞の単離と培養のために、過去数十年にわたって最適化されてきた堅牢なプロトコルを紹介します。この手順は、気液界面(ALI)で培養することにより、初代気管支上皮細胞(PBEC)の単離、増殖、培養、および粘液繊毛分化の成功を可能にし、バイオバンキングのプロトコルを含みます。さらに、細胞特異的マーカー遺伝子を用いたこれらの培養物の特性評価が記載されている。これらのALI-PBEC培養物は、タバコの煙全体または炎症メディエーターへの曝露、ウイルスまたは細菌との共培養/感染など、さまざまな用途に使用できます。 
この原稿で提供されるプロトコルは、手順を段階的に説明しており、実験室でそのような培養システムを実施または適応させることに関心のある人に基礎および/または参照を提供することが期待されています。

水中培養による拡大 ここに示す方法を使用すると、液体窒素中での長期保存のために、1つの6ウェルプレートから400,000細胞/クライオバイアルを含む平均8つのクライオバイアルを得ることができます(図2A)。これを達成するために、単離されたPBECは、微生物(特にマイコプラズマ)汚染を排除するために、プリモシンの存在下で最低7日間、最大14日間(図2B)6ウェルプレートで培養されます。図2A、Bは、さまざまなドナーからのさまざまな単離間で得られた細胞数と必要な培養時間に関する洞察を提供します。液体窒素中で保存するためにトリプシン処理によって細胞を回収する前に、コンフルエントは80%以上でなければならない。これが14日以内に達成されない場合、細胞は凍結保存されるべきではありません。重要なのは、保存および継代のために収穫する場合、細胞層のコンフルエントが~95%を超えてはならないということです(図2C)。液体窒素中で保存した後、細胞を解凍し、ALI培養に十分な細胞数が得られるまで増殖のために培養することができる。この段階で細胞の増殖に使用される培地はc-KSFMであり、気管支リング18からの収穫後の初期培養時と同様である。ただし、肺組織に起因する追加の微生物汚染のリスクがないため、この段階ではプリモシンは必要ありません。この培地は線維芽細胞よりも上皮細胞を優先するため、線維芽細胞をより早く増殖させることによって培養物の異常増殖の可能性を防ぎます19、20、21。c-KSFM培地を用いると、細胞はフラスコ内に広げられ、互いに連結しないため、この段階でcBD培地に浸漬した培養細胞の形態とは大きく異なります(図2D、E)。解凍した細胞をT75フラスコで5〜6日間培養した後、細胞層は80%〜95%コンフルエントになるはずであり、これは合計で約3 x 106細胞に相当します(図2F)。これにより、ALI培養用に約75個のインサート(12ウェルプレートサイズ)を作製することができます。
この貢献に記載されている単離および培養のための方法は、出発材料として気管支生検または気管支ブラシと共に使用するために適合させることもできる。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg"> 図2:凍結保存前後の基底細胞増殖。 記載されたプロトコールに従って細胞を単離し、c−KSFMを用いて培養した。ドナー当たりに生成された細胞数をモニターし、生細胞カウントを、6ウェルプレートから継代0(P0)細胞を採取する際の自動細胞カウンター(A)を用いて実施し(プロトコルのステップ2)、n=123ドナー、細胞数を、ウェル当たり採取した細胞数として提示した;各ドットは1人のドナーを表し、中央値は水平バーで示されます。(B)品質管理の一環として、P0細胞が6ウェルプレートで80%〜90%のコンフルエンシーに達するのに必要な時間をモニターし、c-KSFM(n=127人の異なるドナー)での水中培養を開始してから数日後として示した。個々のドナーはドットで示され、1日に属するすべてのドットは線にマージされます。線が広いほど、それはより多くのドナーを表します。細胞が培養されている日数の中央値は、より細い水平バーで示されます。(C)長期凍結保存のために細胞を回収した瞬間にc-KSFMに沈めて増殖したP0細胞の代表的な明視野画像。(D)細胞を回収し、cBD培地に沈めて増殖させた瞬間のc-KSFMに浸漬して増殖したP1細胞の代表的な明視野画像および(E)インサートに転写したP1細胞。(f)T75フラスコからP1細胞を採取する際に、ドナーごとに生成された生細胞の数を自動セルカウンターを用いてモニターした(プロトコルのセクション4)、n = 63の異なるドナー;細胞数はT75フラスコ当たりの細胞数として示され、各ドナーはドットで示され、細胞数の中央値は水平バーで示される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
気液界面(ALI)培養 ALI培養を開始してから7日後に、細胞層の電気抵抗を測定し、300 Ω以上である必要があります(図3A)。これが達成されない場合、タイトジャンクション形成の欠如の可能性があるため、培養は失敗したと見なされます。洗浄や吸引中の細胞層の損傷などに起因する個々のインサートの上皮層の損傷によって引き起こされる低いTEER値を得る可能性を排除することをお勧めします。これは、培養インサートの目視顕微鏡検査によって確認することができる。我々の経験では、電気抵抗のドナー間の変動は有意であり得(図3B)、これは文献14でも報告されており、観察されたように、使用されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の起源によっても著しく影響を受ける(図3C)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg"> 図3:ALI-PBEC培養の品質管理としての経上皮電気抵抗。 PBECを単離・増殖させ、分化したALI-PBEC培養を確立しました。培養中のいくつかの時点で、電気抵抗を測定し、続いてTEERを算出した(Ω・cm2)。(A)電気抵抗はALI後14日間にわたって測定した。n = 4人の異なるドナー。データは、平均値±標準偏差 (SD) として表されます。(B)ALI-PBEC細胞培養の品質管理の一環として、ALI後7日目(n = 50)および14日目(n = 25)に電気抵抗を測定しました。各ドットは1つのドナーを表し、中央値のTEER(Ω・cm2)は水平バーで示されます。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を用いてデータの有意性を検定したところ、有意差は認められなかった。(C)3つの異なるDMEMサプライヤーからのメディアは、TEER形成への影響を評価するためにテストされました。n = 4人の異なるドナー。平均値はSD±示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
高度に分化したALI-PBEC培養を確立する一方で、空気曝露の開始から、RAの濃度は22増加する。このようにして、細胞は増殖から粘液繊毛分化に切り替わり、明視野顕微鏡を使用して空気曝露後9日(ドナー依存)という早い時期に見ることができます。第1繊毛の動きはこの時点で可視であり、分化した管腔細胞のマーカーの遺伝子発現に基づくとやや早くなる23 (図4)。
プロトコルに記載されているように、粘液産生は、培地交換中に頂端表面をすすぐときにも観察できます。RAは光に非常に敏感であり、同じストック濃度で非常に変動する活性をもたらします。このため、RAは合成RA類似体EC23に置き換えられ、同じ濃度で使用され、実験的に決定されたものと同様の結果が得られます。この理由および手順の変更を避けるために、選択されたEC23濃度は、以前に使用したRA濃度と等しい(すなわち、50nM)24、25に保たれた(図5)。図5Aは、異なる濃度のEC23を使用した場合に達成されるTEER値を示し、試験したこの濃度範囲内の50nMにおける最大TEERを示す。図5Bに示す結果は、繊毛細胞および杯細胞についてのマーカーの遺伝子発現が、50nM EC23またはRAを用いた場合に類似していることを裏付ける。EC23は、この水没段階でそれを省略し、ALI段階でのみ添加すると、完全なコンフルエントに達することのない培養をもたらすため、水中段階での培養中にも必要である(ただし、はるかに低い濃度である)。目に見える繊毛拍動活性と粘液産生を備えた高分化型ALI-PBEC培養を生成するのに必要な時間は約14日であり、したがって、ほとんどの実験は14〜21日のALI培養の間に開始されます(図4)。ALI培養の14日間で、すべての主要な異なる細胞タイプ(基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞)が観察されますが、発現レベルはドナーに大きく依存します。これは、RT-qPCRによってTP63、FOXJ1、MUC5AC、およびSCGB1A1の遺伝子発現を評価することによって、または免疫蛍光(IF)染色によってp63、αチューブリン、Muc5AC、およびCC-16に対する抗体を使用してタンパク質発現を評価し、それぞれ基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞のマーカーを検出することによって実証されます25,26.ただし、ほとんどの実験では14〜21日が経験則と見なされる場合がありますが、一部の実験では、生体異物代謝、SARS-CoV-2感染、および粘液繊毛クリアランスの評価に見られるように、より長い分化期間を考慮することができます27,28,29。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg"> 図4:気液界面(ALI)培養。PBECを単離・増殖させ、分化したALI-PBEC培養を確立しました。ALI-PBEC培養は、ALI後14日間にわたってモニターされた。細胞培養物を、ALI後0、7、および14日目にRNAの単離のために溶解した。2つの異なるドナーからのデータが表示され、各ドットは経時的に監視された1人の個々のドナーを表し、中央値は水平バーで示されます。基底細胞マーカー、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞マーカー(それぞれTP63、FOXJ1、MUC5B、およびSCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRによって測定し、RPL13AおよびATP5B遺伝子発現について正規化した(詳細については参考文献23を参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg"> 図5:レチノイン酸(RA)とその合成類似体EC 23の比較。PBECを単離・増殖させ、分化したALI-PBEC培養を確立しました。PBEC培養物の空気曝露の開始時に、RA(50nM)を様々な濃度のEC23で置換した。(a)電気抵抗をALI後14日目に測定し、続いてTEERを算出し(Ω・cm2)、n=2ドナー、バーはSD±平均値を示す。 (B)ALI後14日目に、qPCRを用いて、それぞれ繊毛細胞および杯細胞(FOXJ1、MUC5AC)の細胞マーカーのRNA単離およびその後の遺伝子発現解析のために細胞培養物を溶解し、 RPL13A(n = 3ドナー)について正規化した。50 nM RAで培養したALI-PBECに対して倍増が示され、SD±平均値として表されます。 (詳細は参考文献23を参照) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
過去数年間、培地や培養プラスチックなどの培養システムにおける代替製品の性能が調査されてきました。このような評価には、メーカーによる培地組成の変更、新しいメディアの導入、COVID-19パンデミック(2020-2022)中の製品の不足など、さまざまな理由がありました。異なるサプライヤーからの類似製品は、上皮細胞タイプのマーカーの評価に基づいて分化した上皮細胞培養をもたらすという観察がなされたが、最終的な細胞組成は実質的に異なる可能性があるが(図6A)、TEERの違いはそれほど顕著ではなかった(図6B)。一方、異なるサプライヤーからの培地は、細胞組成に大きな違いをもたらしました。異なるブランドのインサートを使用する場合、そのような違いは限られていました(図6C)。特に、STEMCELL Technologiesの気道上皮細胞培養培地PneumaCultを使用した場合、異なる形態および目に見える繊毛活性のより迅速な形成が観察された。これらの観察に加えて、cBD培地と比較したALI-PBECのTEER値の違いおよび細胞組成の違いも注目された(図6D)。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg"> 図6:上皮細胞培地と細胞培養インサートの異なるサプライヤーの比較。 PBECを単離、拡張し、分化したALI-PBEC培養を確立しました。(A)ALI-PBECを14日間培養した後、RNA単離のために細胞層を溶解した。基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞マーカー(それぞれTP63、 FOXJ1、 MUC5AC、および SCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRによって測定し、 RPL13A および ATP5Bについて標準化しました。n = 2ドナー。バーはSD±平均値を示す。 (B)ALI後9日間にわたって電気抵抗を測定し、続いてTEERを算出した(Ω・cm2)。n = 3人の異なるドナー。平均値はSD±示されています。 (C)ALI-PBECを、3つの異なるサプライヤーから購入した細胞培養インサートを使用して14日間培養し、その後、RNA単離のために細胞層を溶解しました。繊毛細胞マーカー、杯細胞マーカー、およびクラブ細胞マーカー(それぞれFOXJ1、 MUC5AC、および SCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRによって測定し、 RPL13Aについて標準化しました。n = 18の異なるドナー、バーはSD±平均値を示す。 データは、一元配置ANOVAノンパラメトリッククラスカル-ウォリス検定を使用して有意性について検定され、有意差は見つかりませんでした。(D)ALI-PBECをcBD培地またはニューマカルト培地(STEMMCELLテクノロジー)のいずれかでALI後14日間培養し、その後、RNA単離のために細胞層を溶解しました。基底細胞マーカー、繊毛細胞マーカー、杯細胞マーカー、クラブ細胞マーカー(それぞれTP63、 FOXJ1、 MUC5B、および SCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRで測定し、 RPL13A について正規化し(バーはSD±平均値を示す)、ALI後5日目と12日目に電気抵抗を測定し、TEER(Ω・cm2)の計算に使用しました。n = 2;平均値はSD±示されています(詳細については、参考文献 23 を参照してください)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:プロトコルで使用される溶液および媒体の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、長期バイオバンキングのための初代気管支上皮細胞の単離と増殖、および気液界面での培養による分化上皮細胞の生成のための、再現性があり、手頃な価格で堅牢な方法を紹介します。

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

このプロトコルは、健康と病気における気道上皮細胞の機能と役割に関連するさまざまな研究課題に対処するために使用できる、堅牢で費用効果の高い方法のためのものです。この技術の主な利点は、粘液産生や繊毛活動など、ヒト上皮細胞層をよく表した細胞層が得られることです。この手法は用途が広く、病気に関連する侮辱や治療法の研究に使用できます。はじめに、ヒト肺組織から単離された気管支リングを10センチメートルのペトリ皿で10ミリリットルの滅菌PBSですすぎます。ピンセットでリングを持ちながら、小さなハサミを使用して余分な結合組織と血液の残りを取り除きます。リングを2つに切断し、密閉滅菌容器内のプリモシンを含むHBSS中の10ミリリットルの予熱したプロテアーゼ14溶液に2つの半分を沈めます。気管支リングピースを摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、小片を10ミリリットルの温かいPBSを含むシャーレに移し、曲がったピンセットを使用してリングの内側をこすり、細胞溶液を得る。リングを破棄します。細胞溶液を50ミリリットルのチューブに移し、温かいPBSを加えて50ミリリットルの最終容量を得る。細胞溶液を遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの温かいPBSに再懸濁する前に上清を吸引した。PBSで容量を50ミリリットルに作り、遠心分離を繰り返します。ペレットをプリモシンを含む温かい完全なKSFMに再懸濁します。次に、6ウェルプレートからのコーティング溶液を1ウェルあたり2ミリリットルの細胞懸濁液と交換する。80〜90%のコンフルエンシーに達するまで細胞を増殖させ、PBECの凍結保存のために、ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり2ミリリットルの温かいPBSで細胞を1回洗浄します。ウェルあたり500マイクロリットルのソフトトリプシンを加えて細胞をトリプシン化し、摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。トリプシン溶液を旋回させ、プレートを軽くたたいて細胞を放出します。剥離した細胞を大豆トリプシン阻害剤を含む50ミリリットルの遠沈管に移します。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄してから、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む10ミリリットルのKSFMにペレットを再懸濁する。自動セルカウンターで細胞を計数した後、凍結培地中に細胞を1ミリリットル当たり400, 000細胞の濃度に再懸濁し、そしてこの懸濁液を1ミリリットルクライオバイアルに加える。バイアルを冷たいセル容器に移し、摂氏マイナス80度に置きます。24時間後、バイアルをマイナス196°Cの液体窒素に移して長期保存します。T75細胞培養フラスコをコーティングするには、PBSに10ミリリットルのコーティング溶液を加え、蓋をしっかりと閉めてから、フラスコを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。翌日、フラスコからのコーティング溶液を10ミリリットルの完全なKSFMと交換します。インキュベーター内の培地を37°Cに温め、蓋を少し開いてインキュベーターに空気を入れます。凍結保存されたPBECを摂氏37度のビーズバスですばやく解凍します。予め温めたT75フラスコにクライオバイアルの内容物全体を加え、細胞を均等に分配します。細胞がしっかりと付着していることを確認した後、培地を10ミリリットルの新鮮で温かい完全なKSFMと交換し、80〜90%のコンフルエンシーに達するまで増殖させます。インサートあたり400マイクロリットルのコーティング溶液を加えて細胞培養インサートをコートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。2ミリリットルのソフトトリプシンを加えてフラスコ内のPBECをトリプシン化し、5〜10分間インキュベートします。フラスコを旋回させて軽くたたくことにより、細胞の剥離を促進します。次に、4ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤をフラスコに加え、細胞懸濁液を25ミリリットルのチューブに移す。懸濁液を遠心分離し、ペレットを6ミリリットルの完全BD培地に再懸濁します。自動セルカウンターでセルをカウントします。コーティング後、インサートからコーティング液を取り除きます。1ナノモルのEC23を添加した完全BD培地で細胞懸濁液を希釈し、インサートの膜の上部に500マイクロリットルを加えます。1.5ミリリットルの完全なBD培地をインサートの下のウェルに追加します。細胞を気液界面(ALI)に移す準備ができたら、インサートとウェルから培地を取り出し、50ナノモルのEC 23を添加した新しい完全なBD培地をウェルにのみ追加します。ウェル内の培地を週に3回交換してください。余分な粘液や細胞の破片を取り除くには、インサート内の細胞層の頂端側に200マイクロリットルの温かいPBSをそっと加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、過剰な粘液および細胞破片を含むPBSを吸引する。TEERを測定して、ALI PBEC培養物の品質を評価した。7日目に、300オームを超える細胞層の電気抵抗は成功した培養と見なされます。さらに、気液界面での培養の7日目から14日目までの電気抵抗のドナー間変動性は経時的に減少し、使用されるDMEMの起源によって著しく影響を受ける。基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、クラブ細胞などの主要な異なる細胞タイプはすべて、ALI培養の14日目に観察され、発現レベルはドナーに依存していました。試験したEC 23の異なる濃度の中で、最大TEERは50ナノモルで観察された。レチノイン酸とその合成類似体であるEC23の比較により、繊毛細胞および杯細胞に対するマーカーの遺伝子発現は、50ナノモルのEC23とレチノイン酸の間で類似していたことが確認される。異なる供給業者の培地を使用すると、細胞組成に大きな違いが生じましたが、TEERの違いはそれほど顕著ではありませんでした。一方、異なるサプライヤーのインサートを使用しても、細胞分解に大きな違いはありませんでした。また、ALI PBECおよびニューマカルト培地のTEER値および細胞組成に、完全BD培地と比較して差も観察された。細胞をALIに移行する準備ができたら、EC 23濃度を上げます。また、融解後の細胞は遠心分離せず、SBTI添加後速やかに細胞培養プラスチックから細胞を除去した。このプロトコルで提供されている方法で気道上皮細胞の培養を使用すると、さまざまな分析方法を使用して追跡し、たとえば、気道上皮細胞の機能、遺伝子発現、メディエーター産生を調べ、たとえば、タバコの煙への曝露の結果についての洞察を得ることができます。この細胞培養プロトコルの次のステップは、免疫細胞や血管細胞などの追加の細胞タイプの統合であり、これは組織の表現を増やすのに役立ちます。

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