バイタル顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の可視化

このプロトコルは、マイコバクテリウム・マリナム感染時の胚性ゼブラフィッシュにおけるマクロファージ挙動および死を可視化する技術を記述する。細菌の調製、胚の感染、およびバイタル内顕微鏡検査のステップが含まれています。この技術は、感染または無菌炎症を伴う同様のシナリオにおける細胞行動および死亡の観察に適用され得る。

このプロトコルは、マイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死モードを明確に区別することができる。複数の胚を並列に観察することで、マクロファージの細胞死過程全体を捕捉する確率が大幅に高まります。このプロトコルは、感染または無菌炎症を伴う同様のシナリオにおける細胞死および他の細胞行動の観察にも適用され得る。

拡張ライブイメージングの間、光の漂白や毒性を避けるために、レーザーの強度をできるだけ低く保つことが非常に重要です。原稿による接種後、培養物を10分間Gの3000倍にして、マイコバクテリウムマリナムをペレットとして採取する。上清の300マイクロリットルを除くすべてを捨て、ペレットを再中断します。

さらに10%グリセロールで7H9培地の3ミリリットルを追加し、ペレットをさらに再中断し、15秒オンと15秒オフで100ワットのウォーターバスで懸濁液を超音波処理し、合計2分間、単一のセルホモジネートを達成します。細菌懸濁液を10ミリリットルのシリンジに移し、5ミクロンのフィルターを通過して細菌の塊を取り除く。分光光度計を用いて、懸濁液の光学濃度を測定し、10%グリセロールを含有する7H9培地で1枚でOD600に希釈する。

懸濁液を10マイクロリットルのアリコートに分け、さらに使用するためにマイナス80°Cの冷凍庫で保管します。まず、アガロースを95°Cの加熱ブロックで完全に溶けるまで加熱します。45°Cの加熱ブロックに置くことによって液体の形でアガロースを維持します。

幹領域の筋肉内感染のためにマウントするには、ガラススライド上に均一に体積アガロースによって1%重量の0.5ミリリットルを注ぐことによって底アガロース層を作成します。スライドを氷箱または冷たい表面に3分間置いて固めます。ゼブラフィッシュの胚を麻酔した後、最大60個のゼブラフィッシュ胚を下アガロース層に配置し、2列に慎重にレイアウトします。

下部アガロース層に残った水をティッシュペーパーで取り除き、0.5%重量の0.3ミリリットルを体積アガロースで添加して上層を作ります。胚がアガロースに完全に埋め込まれていることを確認します。グラススライドを再びアイスボックスに戻してアガロースを固める。

余分なE3卵水で表面を覆うことによって、アガロースの最上層を湿らせておいてください。次に、マイクロインジェクターとマイクロマニピュレータを適切な位置に調整し、マイクロインジェクションを行います。マイクロローダーを使用して、調製した細菌培養物の3マイクロリットルを調製された針に移す。

気泡を形成しないようにゆっくりと慎重にピペット。トランク領域に 100 CFU を注入します。マイクロインジェクションの後、シマウマの魚の胚をプラスチックピペットで淡い卵水に慎重に洗い流します。

中脳感染症のためにマウントするには、プラスチックピペットを使用して、4〜6トリセン麻酔化胚をアガロースに移します。各胚の頭部を10ゲージの針で慎重に上方に置きます。すべての胚の位置が固定されたら、ガラススライドを氷箱または冷たい表面に移してアガロースを固めます。

中脳に500 CFUを注入します。マイクロインジェクションの後、ゼブラフィッシュの胚をプラスチックピペットで淡い卵水に慎重に洗い流します。アガロースが完全に固まったら、アガロースを卵水の層で覆います。

環境室を設置した後、環境室にゼブラフィッシュと35ミリメートルガラス底皿を置きます。405ダイオード、アルゴンを20%パワーで開き、DPSS 561ナノメートルレーザーを開きます。スペクトラム設定で適切なレーザーパワーを設定します。

XYZ シーケンシャル スキャン取得モードを選択し、画像形式を 512 x 512 ピクセルに設定します。ライブデータモードに切り替え、最初のゼブラフィッシュの位置をターゲットにし、開始位置と終了Z位置をマークします。残りの胚ごとにこのプロセスを繰り返します。

プログラムの最後に一時停止を追加します。プログラムのループとサイクルを定義し、ファイルを保存します。本研究では、以前に報告されたトランスジェニックコロ1a:eGFP;lyzDsRed2、およびトランスジェニックmpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFPを利用して、マクロファージおよび生体内の好中球を区別した。

細菌を大量に包み込んだマクロファージは丸くなり、運動性が低下し、最終的には細胞質の腫脹、細胞膜の破裂、細胞質含有量の迅速な普及が見られた。UV照射マクロファージは、細胞収縮、核断片化、クロマチン縮合などの典型的なアポトーシス細胞表現型を示した。また、マクロファージが積極的に食細胞化し、M.メリナムを普及させたことも観察された。

しかし、好中球は食作用能力が限られており、明らかな細菌のエンゴテージなしにすぐに溶菌細胞死を受けた。強力な遺伝子編集ツールと組み合わせることで、このプロトコルは、生体内の宿主と病原体の相互作用に対する様々な要因の影響をさらに理解するための効果的なプラットフォームを提供することができます。