Name: イメージング病因とのコーディングを解読し、マイコバクテリウム膿瘍ゼブラフィッシュ胚で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶMycobacterium abscessusの病原性とゼブラフィッシュ胚における自然免疫応答の相互作用。蛍光イメージングを用いてマクロファージと細菌の動態をリアルタイムで観察し、感染制御メカニズムを解明する方法です。

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著者は、有益な議論のために、それぞれtdTomatoとわさびの発現を可能にpTEC27とpTEC15の寛大な贈り物のためにリポ - クロドロネートとL.ラマクリシュナンを提供するためのK.喫茶に感謝しています。フランス国立研究機構（ANR ZebraFlam-10-MIDI-009とDIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01）と欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7-PEOPLE-2011-ITN）のプロジェクトのこの作品の一部を形成しますグラント契約に基づきなし。 PITN-GA-2011-289209マリー・キュリー初期研修ネットワークFishForPharmaため。私たちは、CMデュポンに資金を提供するために協会グレゴリーLemarchalとVaincreラMucoviscidose（RF20130500835）を​​感謝することも望みます。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ゼブラフィッシュは最近、リアルタイム36に広い視野と共焦点イメージングを用いて細菌感染症のダイナミクスを研究するための優れた脊椎動物のモデル系として浮上しています。一緒にマイクロインジェクション法（プロトコル4）と分散マイコバクテリア懸濁液（プロトコル2.2）の組み合わせは、再現性の全身感染症、およびその後のモニタリングとホストマクロファージと細菌の相互作用に焦点を当てた特別な感染の進行の可視化を可能にします。 Mの病原性生体内での膿瘍は、野生型ゴールデンゼブラフィッシュ 37の使用のおかげで調べることができます。 M.間の相互作用を研究するために、骨髄細胞を膿瘍 、ホスト、いくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュ系は、Tgは（MPEG1：mCherryを）として使用することができ、マクロファージ19を可視化します 。 38またはTgは（LYZ：DsRedを ）39ワット ：など<e...

マイコバクテリウム膿瘍は、ヒトにおける臨床症候群の広いスペクトルを引き起こす新興病原体です。これらは、主に、免疫不全にし、1,2,3,4、嚢胞性線維症患者に遭遇する皮膚の感染症だけでなく、重度の慢性肺感染症が含まれる。M.膿瘍はまた、ヒトにおける院内や医原性の感染症に関与する主要な急速に成長しているマイコバクテリア種とみなされています。また、いくつかの最近の報告は 、Mの可能性を強調膿瘍は、血液脳関門を通過し、中枢神経系（CNS）5,6において重要な病変を誘導することができます。急速な生産者であるにもかかわらず、M.また、 膿瘍展示肉芽腫性構造体内年間は黙秘し、肺7に乾酪病変を生成する能力を含む、結核菌のものに関連するいくつかの病原性機能。もっと憂慮すべきは、低銭ですMの sitivity抗生物質に膿瘍 、重要な治療の失敗率8,9につながる治療することが極めて困難これらの感染症をレンダリングします。この種の重要な脅威は、公衆衛生機関10と肺移植11禁忌の主要な関心事である、主に抗生物質に対する固有の抵抗です。 M.膿瘍ディスプレイ異なる臨床転帰につながるスムーズ（S）または粗い（R）コロニー形態型。 S株とは対照的に、R細菌はロープまたはひも状構造12,13につながる、エンドツーエンドを成長させる傾向があります。細胞性または動物モデルのいずれかに基づいて、いくつかの独立した研究は、R形態型14,15のハイパー病原性表現型を明らかにしました。疫学的研究、Mの最も深刻なケースから、 膿瘍肺感染症は、その唯一のバリアントです16バリアント Rに関連すると思われます感染したホスト3年間持続することが確認されています。形態型の違いは、表面結合glycopeptidolipids（GPL）12の（Rで）（S）に存在又は損失に依存しています。しかし、現在利用可能な携帯/動物モデルの固有の制限のためには 、M を研究するために使用膿瘍感染は、RまたはSの変異体の病態生理学的事象についての我々の知識が曖昧なままになります。静脈内またはエアロゾル経路を介して免疫適格マウスの感染は、持続感染およびin vivoでの薬剤感受性試験のための17を研究するためにマウスの使用を妨げ、一過性の植民地化につながります。したがって、宿主応答の操作に適した動物モデルを開発することは大きな課題です。この文脈において、感染の非哺乳動物モデルは、例えば、O、コスト、スピードおよび倫理的許容性など、いくつかの利点を提供するキイロショウジョウバエ 18を含め、近年開発されていますマウスモデルをVER。感染のゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）のモデルは、非侵襲的イメージング、Mの進行や年表により、可視化するために検討されています生きた動物19内膿瘍感染。重要なのは、コンセプトの証明はまた、Mに対するin vivoでの抗生物質の評価のための適合性を実証するために設立されました17,20 膿瘍 。 ゼブラフィッシュは、広く様々な病原体と宿主免疫系21との間の相互作用を研究するために、最後の二十年の間に使用されてきました。この代替脊椎動物モデルの増加成功はやる気と多数のウイルスや細菌感染19,22,23,24,25,26,27,28,29をより良く理解するためのその使用を検証し、主要な、ユニークな機会に依存しています。ほとんどの他の動物モデルとは対照的に、ゼブラフィッシュ胚は、非侵襲的な蛍光画像30を可能にする光学的に透明である。これは、HAS は 、M を研究するために導きました膿瘍は、細菌の形態学的可塑性の一例を表す外よれの説明で最高潮に達する、前例のない詳細をゼブラフィッシュ胚を感染させました。コーディングは、免疫系の転覆の新機構と急性Mの病因を促進する重要なメカニズムを表し膿瘍感染症19。 このレポートでは、Mの病態生理学的特徴を解読するためにゼブラフィッシュの胚を使用して、新しいツールと方法について説明します感染膿瘍と菌と自然免疫系との間の密接な相互作用を研究します。まず、 それ自体細菌接種、胚の準備、及び感染の処理を含む詳細なマイクロインジェクション手順は、提示されています。方法は、具体的にMを評価するように適合さそのような宿主の生存と細菌負荷など様々なパラメータを測定することによって膿瘍の病原性は、提示されています。特別な焦点は、どのように与えられています感染および M.に対する宿主免疫応答の監視、時空間レベルで、運命および進行へビデオ顕微鏡を用いて膿瘍 。また、M.間に寄与し、マクロファージの役割を調査するために感染膿瘍 、方法は、（遺伝的にまたは化学的ベースのいずれかの方法を使用して）、マクロファージ枯渇胚に記載されているが生成されます。最後に、固定または生きているいずれかの胚を用いて、マクロファージまたは好中球との特異的相互作用を可視化するプロトコルが記載されています。 このレポートの目的は 、Mに新たな光を当てるために、さらなる研究を刺激することです膿瘍病原性メカニズム、特に急性および制御不能な感染プロセスの確立によれの役割。

<table><tbody><tr><td>BBL MGIT PANTA</td><td>BD Biosciences</td><td>245114</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-E</td><td></td></tr><tr><td>ウシ肝臓由来カタラーゼ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (トリカイン)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>デルタMicroscopie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319244</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Gibco Life Technologie</td><td>30391-023</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスタント オーシャン シー ソルト&nbsp;</td><td>Aquarium Systems Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管&nbsp;</td><td>Sutter instrument Inc</td><td>BF100-78-10</td><td>1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー装置&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td></td><td>Flamming/Brown Micropipette Puller p-87</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td></td><td>デジタルmicroINJECTOR、MINJ-D</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sciences Tools inc</td><td></td><td>Dumont # M5S&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロローダーのヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ (Danio rerio) の胚は、宿主と病原体の相互作用における脊椎動物の自然免疫系の機能を研究するための感染モデルとしてますます使用されています。大量の胚の入手の容易さ、外部開発によるアクセスのしやすさ、光学的透明性、そして遺伝学的/免疫学的ツールとトランスジェニックレポーターラインコレクションの幅広い利用可能性、 この点で、本稿では、Mycobacterium abscessus感染の年代を研究するためのin vivoモデルシステムとしてゼブラフィッシュを使用することについて説明しています。このヒト病原体は、細胞壁の組成に応じて、滑らかな(S)変異体または粗い変異体(R)のいずれかとして存在し、それぞれの病原性をゼブラフィッシュの胚と幼虫で画像化して比較することができます。尾静脈を介して血液循環に直接SまたはR蛍光変異体をマイクロインジェクションすると、それぞれ慢性または急性/致死性の感染症を引き起こします。.この生物学的システムにより、膿瘍形成の促進におけるマイコバクテリアコードの役割を高解像度で可視化および分析できます。さらに、蛍光マクロファージを保有するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統とともに蛍光細菌を使用すると、宿主と病原体の相互作用のマルチカラーイメージングのユニークな機会が生まれます。この記事では、均質なM. abscessus接種物の調製と、マクロファージとの相互作用のその後の蛍光イメージングのためのゼブラフィッシュ胚の静脈内注射のための詳細なプロトコルについて説明します。これらの技術は、臍帯形成に欠陥のある変異体を含む将来の研究への道を開き、これが脊椎動物全体のM.abscessus病原性にどのように影響するかを理解することに専念しています。

様々な解剖学的部位32を注入することができるが、尾静脈注射は、多くの場合、生存実験では、細菌負荷の決意、食作用活性またはコード形成を含む後続の分析のための全身感染を生成するために使用されます。尾の筋肉内注射は、注射部位（ 図3A）でのマクロファージの動員を評価するために使用されます。 Mの RとSの変異体の病原性を調査し、比較するために、 膿瘍 、蛍光細菌の懸濁液は、30 HPFの胚（ 図3A）19の尾静脈内に注入されます。 S変異体とは対照的に、Rの形態型は、中枢神経系（CNS）（ 図3C）内膿瘍、細菌の急速な発展によって特徴付けゼブラフィッシュ胚（ 図3B）で、より堅牢で致命的感染を引き起こします。 RとSバリアントの両方で全身注射は、CNSの感染症と差につながります病理学および病原性の表現型は、蛍光顕微鏡観察（ 図3C）により、魚あたりCFU（ 図3D）を</stron...

光学的に透明なゼブラフィッシュの胚は、病原性微生物と自然免疫細胞との間の相互作用をリアルタイムで研究し、視覚化するために広く使用されています。Mycobacterium abscessusのマイクロインジェクションは、蛍光イメージングと組み合わせて、ゼブラフィッシュの胚における臍帯形成などの重要な病原性の特徴を精査するために使用されます。

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

この手順の全体的な目的は、Mycobacterium abscessus株の病原性を研究・比較し、透明なゼブラフィッシュ胚を用いて、これらの細菌と宿主の自然免疫系とのin vivoでの相互作用を明らかにすることです。まず、均質な細菌接種液を調製し、次に、受精後30時間の胚に細菌懸濁液を静脈内注射することでこれを達成します。さらに、感染制御におけるマクロファージの役割をより精密に調べるため、リポショート（lipo choate）を用いた注入手順によりマクロファージ除去胚を作製します。最後に、感染胚を調製し、蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡を用いてイメージングを行い、感染の進行をモニタリングします。最終的に得られる結果から、透明な胚内部における蛍光標識された食細胞とM. abscessusとの特異的な相互作用を、個々の桿菌または蛇行状のコード（serpentine cords）として観察することができます。マウスなどの他の動物モデルと比較してゼブラフィッシュを使用する主な利点は、感染プロセスをリアルタイムで特異的に調査でき、Mycobacterium abscessusとマクロファージまたは好中球との特異的な相互作用を画像として観察できることです。このステップは、ゼブラフィッシュへのその後の注入圧において極めて重要な点となります。粗いMycobacterium abscessusは大きな凝集体を形成しやすく、コードを産生する傾向があるため、マイクロインジェクションに先立って、均質で定量的に制御された接種液を調製するための特別な処理が必要となります。m abscessusを調製するため、150 cm²の組織培養フラスコで対数増殖期にある培養液を回収し、50 mLの滅菌プラスチックチューブに移して、室温で4,000 ×gで15分間遠心分離します。ペレットを再懸濁するために、OADC濃縮剤およびTween 80を添加したMiddlebrook 7H9（以下、7H9培地と呼ぶ）を1 mL使用します。細菌懸濁液を200 µLずつ1.5 mLチューブに分注し、26ゲージの針を用いて、分注した細菌懸濁液をそれぞれ15回均質化します。次に、ウォーターバスを用いて、10秒間の間隔を空けながら10秒間の超音波処理を3回行います。その間に7H9培地を1 mL加え、短時間ボルテックスした後、100 ×gで3分間遠心分離します。凝集塊を避けるため、マイコバクテリアを含む上清を慎重に回収し、50 mLの滅菌プラスチックチューブに均一な懸濁液として移します。懸濁液を4,000 ×gで5分間遠心分離し、200 µLの7H9培地を用いてペレットを再懸濁させ、最終的な細菌接種量を評価します。テキストプロトコルの視覚的な実演において、この方法は極めて重要です。なぜなら、顕微鏡下でのゼブラフィッシュ胚への

deciphering-imaging-pathogenesis-cording-mycobacterium-abscessus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している...

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

ゼブラフィッシュの急速な発展、小型サイズと透明性感染症の自然免疫制御の研究のための途方もない利点があります...

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

このビデオでは、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚の周辺領域への乳がん細胞送達のためのマイクロインジェクション方法を説明しています。インキュベーション後、蛍光顕微鏡で胚を可視化し、がん細胞の浸潤、播種、転移を観察します。...

zPDX-侵襲性の解析:ゼブラフィッシュ胚異種移植片における転移性がん細胞の侵襲性挙動の調査

出典: Zhang、X.、 et al.生体材料関連 黄色ブドウ球菌 感染のin vivo可視化と生体内分析のためのゼブラフィッシュはいモデル J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオでは、 黄色ブドウ球菌を注射したゼブラフィッシュ胚の蛍光イメージングを示しており、感染の進行と細菌の分布を定量化して、生体材料の微小球が in vivo...

 ゼブラフィッシュ胚における生体材料関連細菌感染の蛍光イメージング

出典: Niu, L. ほか。 ゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の生体内顕微鏡による可視化。 J. Vis. Exp.(2019年)このビデオは、 マイコバクテリウム・マリナム...

ゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死のライブ画像

出典: Bernut, A.ら、ゼブラフィッシュ胚における マイコバクテリウム・ブスペサスの 病因解析および解析。J . Vis. Exp. (2015)。このビデオは、感染したゼブラフィッシュ胚から マイコバクテリウム...

ゼブラフィッシュ胚からの細菌の単離および培養による感染負荷の評価

出典: Bernut, A.ら。ゼブラフィッシュ胚における マイコバクテリア・アブスペル の病因解析および解析。 J. Vis. Exp. (2015年)このビデオでは、蛍光マクロファージを発現し、蛍光性 のマイコバクテリウム・ブスペサス...

マイコバクテリウム・ブスペサスに感染したゼブラフィッシュ胚における宿主-病原体相互作用のライブ画像化

幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。...

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

&gt;jove_content&lt;細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin...

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

本研究では、生体内可視化と蛍光顕微鏡を基バイオマテリアル関連感染の生体内解析のためのゼブラフィッシュ胚モデルについて説明します。このモデルは、生体内での生体関連感染症を研究するためマウス...

ゼブラフィッシュ胚モデルにおける生体内可視化と生体材料の生体解析黄色ブドウ球菌感染症

このプロトコルは、マイコバクテリウム・マリナム感染時の胚性ゼブラフィッシュにおけるマクロファージ挙動および死を可視化する技術を記述する。細菌の調製、胚の感染、およびバイタル内顕微鏡検査のステップが含まれています。この技術は、感染または無菌炎症を伴う同様のシナリオにおける細胞行動および死亡の観察に適用され得る。...

バイタル顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の可視化

学ぶMycobacterium abscessusの病原性とゼブラフィッシュ胚における自然免疫応答の相互作用。蛍光イメージングを用いてマクロファージと細菌の動態をリアルタイムで観察し、感染制御メカニズムを解明する方法です。

イメージング病因とのコーディングを解読し、

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