イメージング病因とのコーディングを解読し、マイコバクテリウム膿瘍ゼブラフィッシュ胚で

この手順の全体的な目標は、Mycobacterium abscessus株の病原性を研究および比較し、透明なゼブラフィッシュ胚を使用して、これらの細菌と宿主の自然免疫系との間の相互作用をin vivoで説明することです。これは、最初に均質な細菌の無眼を調製することによって達成されます。次に、受精後30時間で胚に細菌懸濁液を静脈内注射します。

さらに、感染制御におけるマクロファージの役割をより正確に研究するために、リポチョートベースの注入手順を使用してマクロファージ枯渇胚を生成します。最後に、感染した胚を調製し、蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡を使用して画像化し、感染の進行をモニターします。最終的に、得られる結果は、蛍光食細胞とM膿瘍との間の特異的な相互作用を、個々の基底または透明な胚内の蛇行性索として示しています。

マウスなどの他の動物モデルよりもゼブラフィッシュを使用する主な利点は、感染プロセスをリアルタイムで具体的に調査し、マイクロバクテリウム膿瘍とマイクロファージまたは好中球との間の特定の相互作用を画像で研究できることです。このステップは、ゼブラフィッシュのその後の注入圧力にとって重要な問題です。粗いマイコバクテリウム膿瘍は大きな凝集体を形成し、コードを産生する傾向が高いため、マイクロインジェクションの前に均質で定量的に制御された内眼を調製するための特定の処理が必要です。

膿瘍を調製するために、150平方センチメートルの組織培養フラスコから指数関数的に成長する培養物を50ミリリットルの滅菌プラスチックチューブに、4, 000倍のGと室温で15分間遠心分離する。ミドルブルックセブンHナインの1ミリリットルを使用し、OADC濃縮を添加し、さらにトゥイーン80を以下セブンHナインミディアムと称してペレットとEloquaを再懸濁する。26ゲージの針で1.5ミリリットルのチューブに200マイクロリットルの細菌懸濁液を15回均質化します。

次に、水浴を使用して、10秒間、それぞれ10秒間、10秒間の休憩を挟んで、超音波処理を行います。その間に、7 H 9、中程度および短時間の渦巻きの1ミリリットルを追加し、その後、3分間Gの100倍で遠心分離します。上清を含むマイコバクテリアを慎重に収集して、塊を避け、50ミリリットルの滅菌プラスチックチューブに均質な懸濁液を引っ張ります。

5分間、4、000倍Gで懸濁液を遠心分離し、200マイクロリットルの7 H 9媒体を使用してペレットを再懸濁し、最終的な細菌接種を評価します。テキストプロトコルによれば、この方法の視覚的なデモンストレーションは、顕微鏡下でのゼブラフィッシュ胚への注射の正確な穏やかな操作、およびマイクロインジェクション技術の習得には、約24時間でM膿瘍のマイクロインジェクションを実施するために時間が必要であるため、手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。受精後またはHPFは、ピンセットを使用して100ミリメートルのペトリ皿に胚をコーティングし、摂氏28.5度に保ちます。

30 個の 48 HPF 胚を、トリカ 1 リットルあたり 270 ミリグラムの魚水を含む 25 ミリリットルの魚水で満たされた V 字型の位置決めチャンバーに移植します。胚をチャネルに適切に配置して、操作を容易にします。PBSTを0.05%80で使用して、微生物接種物を目的のCFUに希釈し、10%フェノールレッドを含めて、マイクロローダーチップで適切な注入を確認します。

マイクロインジェクション針に5〜10マイクロリットルの細菌接種液をロードします。マイクロインジェクション針をインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターのホルダーに接続し、細いピンセットを使用して針の上部を折ってください。5〜10マイクロメートルの開口径を得るため。

マイクロインジェクションの圧力と時間を調整して、注入量をキャリブレーションします。次に、必要な注入量を得るために、1つの胚の卵黄に排出された液滴の直径を測定して、こよちん静脈にマイクロ注入します。腹側を針に向けて胚を配置し、針先を泌尿生殖器の開口部の近くに置きます。

そして、針の先端を胚にそっと押し込み、ちょうど甘えん坊静脈領域を突き刺すまで押し込みます。次に、所望の量の細菌懸濁液(通常はナノリットルあたり約100CFUを含む1〜3ナノリットル)を送達します。テキストプロトコルに従って胚をインキュベートおよびモニターし、リポチョート、マクロファージおよび胚の枯渇を24HPで実施します。運命、胚、そしてトリカと魚の水で満たされた注射皿にそれらを移します。

次に、背側を下に向けています。リポソームカプセル化クロドロン酸溶液をボルテックスした後、マイクロキャピラリーニードルをロードし、注入量をキャリブレーションします。前に示したように、こじん静脈領域を穿孔し、2〜3リットルの溶液を注入します。

注入を3回繰り返します。胚を摂氏28.5度でインキュベートし、蛍光顕微鏡を使用して、感染する前にマクロファージの適切な枯渇を制御します。このビデオで前述したように、目的の時点でのコロニー形成単位またはCFUを列挙します。

感染状態ごとに5つの胚を採取し、各胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。胚を1リットルあたり300〜500ミリグラムで安楽死させた後、氷上で10分間インキュベートすることにより、胚に凍結麻酔をかけます。トリカ。滅菌水を使用して、新しいチューブで胚を2回洗浄します。

次に、1つのXPBSで2%Triton X 100の水分を各胚に除去した後、26ゲージの針を使用して組織を均質化し、完全に溶解します。懸濁液を遠心分離した後、1つのX-P-B-S-Tを使用してペレットを再懸濁します。その後、ミドルブルック7H10OADC上の均質なプレートの連続希釈。

B-B-L-M-G-I-Tパンタを添加し、プレートを摂氏30度で4日間インキュベートしてから、コロニーをカウントし、M膿瘍感染のライブイメージングを行い、トリカ麻酔胚を1%低融点のアロスでマウントし、倒立顕微鏡用の35ミリメートルガラス底のペトリ皿または直立共焦点顕微鏡用の単一キャビティ陥凹スライドに取り付けます。胚を所望の位置に向け、固化したアロスをトリカを含む魚水で覆い、M膿瘍感染の固定イメージングを行います。胚を安楽死させた後、1.5ミリリットルの微小遠心チューブに移し、1つのX-P-B-S-Tで胚を4%パラホルムアルデヒドに2時間固定します。

室温で、胚を1つのX-P-B-S-Tで10分間2回洗浄することにより、パラフォームアルデヒドを除去し、組織と蛍光の完全性を連続して維持します。胚を高濃度のグリセロール溶液中で1条件につき10分間インキュベートします。50%グリセロールに埋め込まれた胚を観察室に置きます。

最後に、10 x 対物レンズを備えた蛍光顕微鏡、または 40 x または 63 x 対物レンズを備えた蛍光共焦点顕微鏡を使用して、胚のシーケンシャル蛍光取得および透過イメージングを行います。粗いM膿瘍変異体と滑らかなM膿瘍変異体の病原性を調査および比較するために、蛍光細菌を30のHPFC熟練した胚に静脈内注射しました。滑らかな変種とは対照的に、粗い変種は、中枢神経系内の膿瘍の発生により、より強力で致命的な感染を誘発します。

病原性の差は、CFUを列挙するか、相関する蛍光ピクセル数を決定することによって定量化しました。この図に見られるように、臍帯形成の動態は、ビデオ顕微鏡法によって非侵襲的に監視および画像化することができ、ここに示すように、粗い変異体が細胞外に複製する傾向を示しています。マクロファージが枯渇した胚に粗いM膿瘍を感染させると、細菌負荷と臍帯産生が大幅に増加し、幼虫が急速に死亡します。

このことは、マクロファージがM膿瘍の感染を制御し、マクロファージとM膿瘍との相互作用をリアルタイムで観察する必要があることを明確に示しています。赤色蛍光マクロファージを産生するEG one M cherryトランスジェニックラインが使用できます。感染症は、個々の細菌の効率的な食作用を伴うマクロファージの顕著な動員を誘発しますが、マイコバクテリアの臍帯は、貪食を避けるためにam膿瘍によって進化した戦略を表しています。

この技術は、免疫回避の新たなメカニズムとしてのコーディングの重要な役割を探求する道を開きました。ゼブラフィッシュの感染のほくろのおかげで、マイコバクテリウム膿瘍の病因におけるコードのin vivo寄与を観察し、記述することが可能になりました。