ゼブラフィッシュの幼虫を用いて出血性脳卒中の病理学的結果を研究する
2019年6月5日
ここでは、ヒト脳内出血 (ICH) の文脈において、ゼブラフィッシュの幼虫における脳の出血について、脳損傷、運動欠損および神経炎症を定量化するためのプロトコールを提示する。
この方法は、出血性脳卒中後の脳内の血液に対する即時の細胞応答を研究するための無料の前臨床アプローチを提供する。げっ歯類モデルとは異なり、ゼブラフィッシュの幼虫の透明性により、生きた無傷の動物の脳内の細胞反応を蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで観察することができます。まず、ティーストレーナーを使用して、1人の雄と1〜2匹の雌の成虫ゼブラフィッシュから生産された繁殖箱の生産卵からすべての受精胚を収集します。
標準的なE3胚培地を含む各ペトリ皿に100個の胚を移す。標準ガイドラインに従って摂氏28度でインキュベートし、ステージを行います。受精後6時間で、パスツールピペットを使用して皿から死んだ胚と未受精胚を取り除き、食器を保育器に戻します。
受精後24時間で、明視野ステレオ顕微鏡の下で、鋭い超薄解離鉗子を使用して、アトルバスタチン治療のために胚を装飾します。その後、2つのきれいなペトリ皿に30ミリリットルのE3胚培地を加え、1つは治療用、もう1つはコントロール用です。治療皿から60マイクロリットルの胚水を取り除き、0.5ミリモルアトルバスタチンの60マイクロリットルを加えて、幼虫出血の80%を達成する。
パスツールピペットを使用して、各皿にできるだけ少ない水で100個の胚を移します。2つの料理を摂氏28度でインキュベートします。受精後50時間後、顕微鏡ではパスツールピペットを使用して、出血した魚を非出血集団から慎重に分離し、幼虫を新鮮なE3培地を含む新しい料理に移します。
出血陽性の幼虫を分離しやすくするために、赤血球中の蛍光タンパク質を発現する顔料や魚を使わずに魚を使うことができます。3日目には、蛍光顕微鏡下で幼虫をスクリーニングし、蛍光タンパク質の発現を確実にする。次に、麻酔用に0.2%MS-222を含むE3メディアでライトシート取り付けチャンバーを充填します。
パスツールピペットを使用して、1〜6匹の幼虫を含む単一の液滴を乾燥したペトリ皿表面に移して取り付けます。できるだけ多くの液体を除去するためにピペットを使用してください。45°Cの熱ブロックから幼虫に1.5%低溶融アガロースの低下を加え、800マイクロメートルの取り付け毛細管を使用して最初に幼虫の頭を引き上げる。
位置決めが正確でない場合は、幼虫をアガロースから追い出し、再度取り付ける。キャピラリーを冷却したままにしてから、ライトシートチャンバーに挿入します。ZENイメージングソフトウェアでは、連続して幼虫の向きを調整し、取得してアイレンズ間の頭部のZスタック画像を取得します。
処理タブで、各 z スタックから最大強度投影イメージを生成します。運動性アッセイを無作為に選択するには、麻酔後の24匹の幼虫を新鮮なE3培地に移し、動物が麻酔から回復することを可能にする。幼虫が麻酔から完全に回復した後、末端切り替えでピペットを使用して、メチレンブルーなしでE3培地に幼虫を回復した。
24ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルに1つの幼虫をプレートします。プレートをカメラチャンバーに積み込みます。EthoVision XTトラッキングソフトウェアでは、実験設定を調整して、自発的な水泳とアッセイのモーションを10分間増加させる白色光の驚くべきルーチンを設定します。
96時間と120時間後の受精後に移動アッセイを繰り返します。トランスジェニックユビキチン分泌型アキシンV M静脈レポーターラインを用いた脳細胞死の評価は、緑色蛍光によって示されたすべての非出血性幼虫に存在しない出血性幼虫中の死にかけている細胞の明確なクラスターをもたらす明るい視野画像は、脳出血の存在を示す。死にかけている細胞は、出血した幼虫のアトルバスタチンおよび気泡頭モデルの両方で観察された。
MPEG1陽性マクロファージの形態は、細胞が活性な丸みを帯びたアメーバ形状で採用するとして、脳内出血陽性幼虫の変化を示す。これらの活性化された丸みを帯びた細胞を、脳内出血陽性幼虫における死死細胞を発現するユビキチン分泌型アネキチンV M静脈の貪食応答の増加を示すために、時間をかけてモニタリングした。脳出血は、脳内出血陰性兄弟対照と比較して、受精後72時間および96時間で運動性の有意な減少に関連している。
受精後120時間の運動性はベースラインに近いレベルに回復する。この手順の最も重要な側面は、予言アッセイに進む前に、脳出血の有無について幼虫を徹底的に調べることである。このモデルは、出血後に表現型の重症度を改善できるかどうかを判断するための薬物スクリーニングにも使用でき、将来的に新しい薬剤候補を特定する可能性があります。
この技術は、私たちは今まで研究することが非常に悪名高い時点で脳内出血の直後に細胞応答を探索することができます。このプロトコルに記載されている試薬や機器は特に危険ではありませんが、化学物質、シャープ、レーザーを使用する場合は常に、標準的な注意と予防措置を講じる必要があります。
概要
本研究では、ヒトの重大な医学的疾患である脳内出血（ICH）後のゼブラフィッシュ稚魚における脳損傷、運動機能障害、および神経炎症を定量化するためのプロトコルを提示します。ゼブラフィッシュ稚魚の透明性を活用することで、出血性脳卒中後の生体脳モデルにおける細胞応答をリアルタイムで観察することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 神経炎症
- 脳卒中回復
背景
- 脳内出血（ICH）は、特異的な治療法が確立されていない深刻な疾患です。
- ゼブラフィッシュの幼魚は、その透明性から、脳の反応を研究するための革新的なモデルとして利用されています。
- リアルタイムイメージングにより、脳損傷後の細胞ダイナミクスに関する知見が得られます。
- 本研究では、蛍光顕微鏡を用いて、脳内の神経炎症およびその他の細胞反応を評価します。
研究目的
- 出血性脳卒中に対する細胞応答を研究するための前臨床モデルを開発すること。
- ICHが運動機能および神経炎症に及ぼす影響を調査すること。
- ICHの影響を軽減するための潜在的な候補薬を探索すること。
使用した手法
- 細胞応答のイメージングには、主に蛍光顕微鏡を用います。
- 生物学的モデルとしてゼブラフィッシュの幼魚を使用し、誘発された出血による脳損傷に焦点を当てます。
- 主なタイムラインには、胚の回収、処置の適用、および指定された受精後時間におけるその後のイメージングが含まれます。
- 重要な段階として、数日間にわたる運動性のモニタリングおよび神経炎症反応の評価が含まれます。
主な結果
- 出血した幼魚において、死細胞のクラスター形成を含む顕著な細胞応答が観察された。
- 出血後に運動性の低下が認められたが、120時間までに部分的に回復した。
- 活性化マクロファージは、ICH応答に関連する形態的変化を示した。
- 本モデルにより、脳卒中に対する潜在的な治療介入の評価が可能となる。
結論
- 本研究は、ICHとその細胞レベルでの影響を研究するためのゼブラフィッシュモデルを確立した。
- この手法は、脳出血後の転帰を改善するための薬剤スクリーニングへの寄与が期待される。
- 総じて、脳損傷後の細胞ダイナミクスおよび潜在的な回復メカニズムの理解を深めるものである。
よくある質問
業界における重要性と実用性
ゼブラフィッシュ幼魚モデルは、不透明な哺乳類システムでは捉えることが困難な、脳内出血に対する細胞応答のリアルタイム可視化を可能にすることで、出血性脳卒中研究における重要な空白を埋めるものです。このアプローチは、疾患に関連するin vivoシステムにおいて、神経炎症、細胞死、および機能的欠損を定量化することにより、早期のターゲット検証およびメカニズム的なリスク低減を支援します。本モデルはライブイメージングおよび運動能アッセイとの親和性が高く、出血誘発性の病理学的変化の軽減を目的とした治療候補物質のスクリーニングにおいて、予測的な信頼性を提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 脳内における血液への即時的な細胞反応を可視化することで治療仮説の検証を可能にし、出血性脳卒中経路におけるターゲットバリデーションを支援する。
- 運用の価値： 死細胞クラスターやマクロファージ活性化など、ヒトの脳内出血（ICH）反応を反映した保存的な病理学的表現型を通じて、生物学的なリスク低減を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 運動機能障害および神経炎症の標準化された定量的リードアウトを生成し、表現型スクリーニングにおける信頼性の高い化合物評価を可能にする。
- 運用的価値： 段階的な幼魚集団と自動追跡（例：EthoVision XT）により、アッセイの再現性と拡張性をサポートし、リード化合物同定のスループットを向上させる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：神経炎症、細胞死、運動機能欠損といったICHの主要な結果を再現することでトランスレーショナルな連続性を示し、メカニズムに基づいた介入策の前臨床検証を可能にします。
- 運用的価値：受精後72時間から120時間までの縦断的な評価を可能にし、表現型の回復または持続に基づいた、リスク調整後の進展判断をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
ゼブラフィッシュ幼魚ICHモデルは、ターゲットの検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、メカニズムの洞察と前臨床薬効試験を繋ぐ架け橋となります。
- ディスカバリーバイオロジー： 出血後のAnnexin V陽性の死細胞およびMPEG1マクロファージの形態変化をリアルタイムでイメージングすることを可能にし、仮説検証やパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 96 hpfおよび120 hpfでの定量可能な運動能アッセイを通じてアッセイの即応性を実現し、化合物スクリーニングのためのスケーラブルで再現性のある行動エンドポイントを提供します。
- アナリティクス： 細胞死レポーターの蛍光強度、マクロファージの形態変化、および移動追跡データを含む測定可能な出力を得られ、条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 保存されたヒトICH病理をモデル化することで、ディスカバリーから前臨床への継続性を繋ぎ、バイオマーカーに整合したターゲットエンゲージメント研究を支援します。
- エンタープライズ再利用： 非終末的で定量可能なリードアウトを備えているため、複数の治療モダリティにわたるメカニズムスクリーニングおよびターゲットのデリスキングに再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 出血誘発性の神経炎症および細胞死を直接的に観察することで、メカニズムの曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高める。
- 運用的価値： 定義されたステージング（例：24 hpfでの除冠、アトルバスタチン処理）および表現型アッセイ前の盲検化による出血分類を通じて、標準化と再現性を確保する。
- 戦略的価値： 疾患に関連したシステムで早期に有効性シグナルの検出を可能にすることで、脳卒中治療薬の開発における後半ステージの生物学的リスクを軽減し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 出血表現型を改善する化合物を特定することで、機能回復および細胞救済に基づいた推進判断を可能にし、リスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- ゼブラフィッシュの飼育、胚のステージング、およびライブイメージングのための蛍光顕微鏡観察に関する専門知識が必要です。
- ライトシート顕微鏡または蛍光顕微鏡、アガロース固定システム、および自動行動追跡ツール（例：EthoVision XT）などの機器に依存します。
- 表現型アッセイの妥当性を確保するため、出血スコア判定および幼魚の分離におけるチーム間での標準化が必要です。
- 出血の検出能と信号の明瞭性を向上させるため、色素欠損系統やトランスジェニック・レポーター系統への適応を検討する必要があります。
- 高等脊椎動物と比較して幼魚のサイズとスループットに制約がありますが、世代交代の速さと光学的なアクセスしやすさによって補われています。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Day 0: Egg Production and Collection
1:11
Day 1 - 2: Atorvastatin Treatment and ICH- and ICH+ Populations Separation
2:22
Day 3 - 5: Cell Death, Leukocyte Analysis and Motility Assay
4:24
Results: Intracerebral Hemorrhage (ICH) in Zebrafish Larvae
5:39
Conclusion
