バイオマーカー分析のための臨床試験サイトにおける単一の血液引き出しからの末梢血単核細胞ペレットと血漿の調製
March 20th, 2021
このプロトコルは、翻訳バイオマーカー分析に使用できる臨床試験サイトでの高品質PBMCおよび血漿バイオサンプルの臨床実施可能な調製を詳述する。
PBMCおよび血漿サンプルは、早期臨床開発において入手が容易で、非常に有益です。この強い議定書は臨床現場で導入される前分析の変動を最小にする。このプロトコルは速く、容易で、PBMCおよび血漿に血液を処理するために基本的な実験室装置および最低のオペレータの専門知識を要求する。
病院での忙しい研究室の日と互換性があります。このプロトコルから生じる血液成分の下流分析は、薬物動態および薬物力学関係、薬物用量スケジューリングおよび標的関与の証明を知らせ、リアルタイムおよび内省的分析の両方をサポートする薬物作用機序に関する洞察を提供することができる。このプロトコルは、特にDNA損傷応答機構を分析するために、腫瘍学の研究に使用します。
しかし、このプロトコルによって収集された材料は、多くの疾患領域および複数の治療様式に関連する可能性がある。サンプルあたり8ミリリットルのドナー血液を受け取った後、血液が採取された時間を記録し、各チューブを8〜10回穏やかに反転してから、抗凝固剤処理血液サンプルを放射線用に標識された各チューブに移す。臨床サンプルの場合、チューブを反転した直後に遠心分離します。
0.2グレーのチューブを事前に温めたX線キャビネットに入れ、ドアを閉め、チューブに0.2グレーの線量を適用します。低線量照射チューブを7つのグレーチューブに交換し、高線量照射サンプルに7つの灰色の放射線量を適用するように線量を調整します。両方のサンプルを照射した後、37°Cで3つのチューブすべてを1時間インキュベートします。
高速遠心分離で細胞を分離する前にサンプルを細胞調製チューブに移し、単位をx gまたは同等のRCFとして設定してください。遠心分離後、暗い背景にチューブを見て、血漿、赤血球、およびバフィーコート層を識別します。血清学的ピペットを使用して、バフィーコート層を乱すことなく、プラズマの約半分をラベル付きの15ミリリットル円錐形遠心分離機に移し、プラズマのチューブを湿った氷の上に保管します。
次に、牧草地のピペットを使用して、バフィーコート層を含むPBMC全体を新しい15ミリリットルチューブに移し、室温PBSをPBMCに加えて、サンプルあたり15ミリリットルの最終体積にします。細胞を反転によって5回軽く混合し、遠心分離により細胞を収集し、遠心分離ユニットを確認してください。ペレットを乱すことなく、上清の最後の500マイクロリットルを除くすべてを吸引します。
各チューブに10ミリリットルの最終体積に新鮮なPBSを加え、チューブをそっと反転して再中断します。カウント用に細胞の40マイクロリットルアリコートを使用してください。カウント後、別の遠心分離で細胞を収集し、ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を除去します。
後で処理するためにPBMCを保存するには、ペレットを穏やかなピペットでサンプルあたり50マイクロリットルの新鮮なPBSで再懸濁し、各細胞懸濁液全体を湿った氷の上でラベル付けされた1.5ミリリットルのクライオビアルに移します。その後、フラッシュは、好ましい方法で細胞を凍結し、マイナス80度で凍結ボックスに配置します。セルが凍結された時刻を記録します。
あるいは、サンプルごとに1ミリリットルまたは凍結混合物中のペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を個々の標識された凍結に移す。その後、マイナス80度の貯蔵のためのチューブと事前に冷やされた冷凍ボックスを置きました。プラズマを凍結するには、残りのペレットを乱すことなく、最大5つの2ミリリットルマイクロチューブのそれぞれにプラズマの1ミリリットルのアリコートロットを追加し、各チューブ内のプラズマの総量を記録します。
次に、プラズマアリコートを直立方向にマイナス80°Cの冷凍庫で直ちに凍結します。サンプルのウェスタンブロット分析の場合、各チューブ内のペレットを、穏やかなピペットで細胞ペレットの容量と同等のタンパク質およびホスファターゼ阻害剤を添加した適切な量のリシスバッファーで再懸濁し、氷上で10分間細胞サンプルをインキュベートします。インキュベーションの最後に、サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で30秒オフサイクルで30秒で30秒で超音波処理します。
遠心分離によってサンプルを収集し、新しい1.5ミリリットルチューブに上清を転送します。次に、サンプルあたり40マイクログラムをローディングバッファと混ぜ、サンプルを5分間沸騰させます。4-12%Bis-Trisタンパク質ゲルに各レーンの各サンプルの20マイクログラムを重複してロードし、SDS-PAGEを実行します。
血液の8ミリリットルから得られる細胞の数は、患者と病気の設定によって異なります。一般に、細胞ペレットはサイズが小さく、透明な白色である。時にはペレットは、いくつかの赤血球汚染を有することができ、これは調製物の品質に悪影響を及ぼす。
このプロトコルを使用する慢性リンパ性白血病患者からの典型的な収量は、1ミリリットル当たり1.62〜19.77ミリグラムの範囲の最終的なタンパク質濃度を有する8ミリリットル単核細胞調製あたり1.62倍から4番目から1.99倍の10〜1.99倍の10〜1.99倍の範囲で変化する。3人の患者サンプルの本代表分析では、より高い電離放射線量で翻訳後修飾の増加が観察された。興味深いことに、運動失調-毛帯拡張症のリン酸化は0.2グレイの低用量で相当であったため、これらの翻訳後修飾は、腫瘍の良好な動的範囲を有するDNA二重鎖の生成を伴う治療のための薬物力学的バイオマーカーとして現実的に尋問される可能性があることを示唆している。
最適なサンプル調製のために、採取から1時間以内に血液を室温で処理し、サンプルを正しく遠心分離し、チューブを暗い背景に対して見て、バフィーコートを区別することができます。
概要
このプロトコルは、臨床試験における翻訳バイオマーカー分析のための高品質のPBMCと血漿バイオサンプルの調製について概説しています。サンプル調製前の変動性を最小限に抑え、忙しい臨床環境での使いやすさを重視しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 臨床試験方法
- バイオマーカー分析
- 腫瘍学研究
背景
- PBMCと血漿サンプルは初期臨床開発において重要です。
- 堅牢なプロトコルはサンプル調製の変動性を減少させます。
- 標準的な実験室機器と最小限の専門知識に対応しています。
- 様々な疾患領域と治療モダリティに適用可能です。
研究目的
- PBMCと血漿サンプルを調製するための信頼性の高い方法を提供すること。
- 薬物動態および薬力学研究を支援すること。
- 薬物作用メカニズムの分析を容易にすること。
使用方法
- 血液サンプルの採取と即時の処理。
- 血漿とPBMC層を分離するための遠心分離。
- 後日の分析のために適切な温度でサンプルを保管。
- タンパク質発現研究のためのウェスタンブロット分析。
主要な結果
- PBMCの収率は患者と疾患のコンテキストによって異なります。
- 異なる放射線線量で観察された翻訳後修飾。
- リン酸化の変化は潜在的な薬力学的バイオマーカーを示唆しています。
- 最適な処理条件はサンプル品質を向上させます。
結論
- このプロトコルは高品質のバイオサンプルを調製するのに効果的です。
- 様々な臨床および研究用途に適応可能です。
- 適時な処理と正確な遠心分離が品質にとって重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable biomarker analysis from peripheral blood is essential for establishing proof of mechanism and guiding therapeutic dose scheduling in clinical trials. This protocol minimizes pre-analytical variability at clinical sites, enabling consistent, high-quality PBMC and plasma sample preparation across multi-center studies. It supports translational biomarker workflows by providing standardized biosamples for pharmacodynamic and mechanistic hypothesis testing in oncology and other therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through analysis of protein biomarkers and post-translational modifications in PBMCs.
- Operational Value: Provides a robust, easy-to-implement method for isolating PBMCs and plasma from a single blood draw with minimal technical expertise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems suitable for downstream biomarker assays, including circulating tumor DNA, cytokine, and metabolomics analysis.
- Operational Value: Ensures sample reproducibility and standardization through defined processing steps, reducing variability across clinical sites.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by enabling longitudinal sampling to track biomarker evolution and immunological landscape changes.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by providing storable, high-quality biosamples for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification and preclinical work by delivering quantitative, reproducible biosamples for biomarker-driven decision making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via analysis of DNA damage response markers and post-translational modifications in irradiated blood samples.
- Screening: Delivers assay-ready PBMC and plasma samples with standardized isolation and storage protocols for reliable compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurements of protein markers, circulating tumor DNA, and metabolomics to compare treatment conditions and inform pharmacodynamic relationships.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through longitudinal biomarker analysis and mechanistic hypothesis testing in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across therapeutic areas and trial phases due to its adaptability and minimal equipment requirements.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through measurable pharmacodynamic biomarkers such as phosphorylation of ATM and RAD50.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of sample processing across sites, reducing pre-analytical variability in biomarker analysis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable proof of target engagement and mechanism of action insights.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on consistent biomarker data from early clinical samples.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory expertise in centrifugation, pipetting, and sample handling.
- Depends on access to centrifuges, pipettes, cryovials, and ice for sample processing and storage.
- Necessitates cross-team standardization of timing, irradiation (if applicable), and storage procedures to maintain consistency.
- Requires adaptation considerations for non-irradiated samples or alternative downstream assays such as flow cytometry or nucleic acid extraction.
- Practical limitation: PBMC yield and pellet quality can vary by patient and disease state, affecting downstream protein concentration and analysis sensitivity.
