臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

この手順の全体的な目標は、臍帯血から前駆細胞B細胞のサブセットを単離することです。これは、最初に密度勾配遠心分離によって臍帯血から単核細胞を単離することによって達成されます。第2ステップでは、細胞表面抗原をビオチン標識抗体で標識し、残りの非B細胞のいずれかを磁気的に枯渇させます。

次に、単離されたB細胞を、CD19、CD34、およびCD45細胞表面抗原に対する抗体で蛍光標識する。最終ステップでは、細胞をフローサイトメトリーでソートし、前駆体B細胞サブセットを回収します。最終的には、十分な数と品質の細胞を取得し、高品質のDNAとRNAを必要とするダウンストリームアッセイに利用することができます。

他の方法と比較した場合のセルソーティング戦略の利点の1つは、フローサイトメーターで必要な時間が短縮され、蛍光抗体が3つだけであるため、実験のコストが大幅に削減されることです。一般に、この方法に不慣れな方は、フローサイトメトリー用の臍帯血細胞の調製に利用できるさまざまな方法や、フローサイトメーターの調製の複雑さに苦労するでしょう。この方法は、健康な前駆細胞B細胞に関する洞察を提供するだけでなく、T細胞などの臍帯血中に存在する他の細胞タイプや、白血病やリンパ腫などの造血細胞が関与する疾患の研究にも適用できます。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、細胞の生存率を最大化し、汚染破片の存在を減らす方法で臍帯血と細胞を処理するために必要な適切な技術を説明することが難しいため、非常に重要です。臍帯血から単核細胞を単離するには、まず臍帯血の8ミリリットルのアリコートを24ミリリットルのDPBSで希釈します。次に、希釈した各血液混合物を、15ミリリットルのALIワットのfipaプラスの上にゆっくりと50ミリリットルの円錐管に重ね、層を分離するように注意します。

次に、血液を400倍Gおよび摂氏20度で40分間遠心分離し、細胞を密度勾配ラベル7つの5ミリリットル丸底チューブで分離し、サンプルIDの日付と表に概説されているその他の適切な情報を示します。分離後、単核細胞は血漿不透明プラス界面に留まりますが、顆粒球と赤血球は沈殿物が上部血漿層を吸引し、単核細胞層との接触を回避します。次に、10ミリリットルのガラスピペットを使用して、50ミリリットルのチューブのうち3つから単核細胞層を1つの新しい50ミリリットルのチューブに慎重に収集します。

この新しいチューブにPBSを充填し、細胞懸濁液を穏やかに混合し、次に細胞をGの300倍と摂氏20度で10分間2回洗浄します。最初の洗浄後、ペレットを再懸濁し、単一の50ミリリットルの円錐管に移します。2回目の洗浄後、細胞ペレットを200マイクロリットルのPBSに穏やかに懸濁し、1マイクロリットルの細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内のPBS1ミリリットルに移してカウントします。

次に、50ミリリットルのチューブ内の細胞をより多くのPBSで洗浄し、その後、ペレットを乱すことなく上清を完全に除去します。単核細胞からB細胞を単離するために、まずResusは洗浄したばかりのペレットを摂氏4度の160マイクロリットルに懸濁します。作りたてのDGAのE-D-T-A-P-B-Sバッファー。

次に、40マイクロリットルのB細胞単離キット、バイオITIN抗体カクテルを細胞懸濁液と混合します。細胞を4°Cで10分間インキュベートした後、遊離抗体を1000万細胞あたり4°Cの1ミリリットル、E-D-T-A-P-B-Sバッファーで洗い流します。次に、細胞ペレットを摂氏4度の320マイクロリットルのE-D-T-A-P-B-S緩衝液に再懸濁します。

次に、80マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズを細胞懸濁液と混合し、摂氏4度で15分間インキュベーションします。細胞が回転している間に細胞を再度洗浄します。LSカラムを最大セパレーターの磁場に置き、カラムに4°CのE-D-T-A-P-B-Sバッファーを3ミリリットル滴下します。

次に、洗浄した細胞のうち最大1億個を摂氏4度の500マイクロリットル、E-D-T-A-P-B-S緩衝液に再懸濁します。次に、細胞懸濁液をカラムにピペットで移し、カラムを通過する非標識細胞を50ミリリットルの円錐チューブに集めます。元の円錐管の壁に摂氏4度のE-D-T-A-P-B-S緩衝液を一度に1ミリリットルずつ追加し、その後、残留細胞懸濁液を毎回カラムに穏やかに混合してピペットで動かし、すべての細胞を確実に回収します。

最後に、標識されていない細胞を含む円錐形のチューブにPBSを充填します。遠心分離後、細胞は細胞ペレットを乱すことなく、上清を慎重に除去します。次に、細胞を200マイクロリットルのE-D-T-A-P-B-S緩衝液に穏やかに懸濁します。

抗体の標識を開始します。まず、1マイクロリットルの細胞懸濁液を、以前に標識した未染色チューブに移します。500マイクロリットルのE-D-T-A-P-B-Sバッファーをチューブに加え、氷上に保存します。

すべての照明を消し、残りの細胞懸濁液に100万細胞あたり20マイクロリットルのCD 19、CD 34、およびCD 45抗体をそれぞれ追加します。よく混ぜて、チューブを室温で30分間暗所に置きます。次に、抗体標識細胞懸濁液の40マイクロリットルを7つのAおよびD標識チューブに移します。

細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄し、パレットを100マイクロリットルの結合緩衝液に再懸濁します。これらの細胞に7マイクロリットルの7 A a dを添加し、次いで、細胞が7つのA a dで標識されている間に室温で10分間インキュベートし、抗体標識細胞のチューブからPBSで抗体標識細胞を洗浄し、次いでペレットを500マイクロリットルのE-D-T-A-P-B-S緩衝液に再懸濁する。次に、抗体標識細胞懸濁液の全容積をCD19陽性、CD34陽性、CD45陽性標識チューブに移します。

さらに1ミリリットルのE-D-T-A-P-B-S緩衝液でチューブをすすぎ、残留細胞懸濁液をCD 19陽性CD34陽性CD45陽性標識チューブに移します。最後に、300マイクロリットルの結合バッファーを7つのA A Dチューブに加え、MO flow XDPフローサイトメーターを使用して細胞を選別します。まず、ソーティング用の MO フローを設定し、適切な補正制御を実行してから、この図に示すようにプロットを含むプロトコルを作成します。

エアロゾル排出システムが常に稼働していることを確認してから、未染色のサンプルを使用して、前方散布図と側面散布図の電圧とゲインを設定します。負の蛍光集団を特定するため。閾値を1%以下に設定して、破片を含むDNAが回収されたサンプルを汚染しないようにします。

CD 19 ポジティブ CD 34 ポジティブ CD 45 ポジティブサンプルの約 50 、 000 イベントを実行します。ゲーティング戦略を今示したように設定するには、非結合 CD 19 正の CD 34 陽性の母集団をサイド スキャッター プロットとフォワード スキャッター プロットにバック ゲートします。リンパ球の歩行に潜在的なプロB細胞が含まれていることを確認するため。

このサンプルを使用して、7 a a d 染色の陰性蛍光集団も設定します。次に、死んだ細胞が無差別に染色され、現在、集団CD19陽性、CD34陽性CD19陽性、 CD 34、ネガティブ、CD 45、低、CD 19、ポジティブ、CD 34、ネガティブ、CD 45、ミディアム、CD19。CD 34 ネガティブ CD 45 高。

詰まりを防ぐために、すべての集団の分類決定にリンパ球とダブレットの識別ゲートを含めます。ソーティングチップで、ソーティングの直前に40ミクロンのセルストレーナーを介してCD19陽性CD34陽性CD45陽性サンプルをろ過します。次に、PBS中の2%FBSでコーティングされた標識収集チューブを氷で固めたチューブホルダーに入れ、選別が完了した直後に細胞を適切な収集チューブに選別します。

サンプル間のDNA抽出は、細胞の成功に役割を果たすバリエーションで、良好なソートでソートします。リンパ球の歩行には高い割合の細胞があります。成功率の高いサンプルには、ゲートリンパ球集団の下と左側に落ちるイベントの数が少ないことからも明らかなように、汚染破片のレベルが低くなっています。

成功率の低いサンプルには、高レベルの汚染破片が含まれています。サンプルが不十分なほど、これらのイベントが著しく増加しています。フローソーティングされた細胞と、各前駆体B細胞サブセットから単離されたその後のDNAは、ダウンストリーム分析を実行するための量と質を備えています。

我々は、CD19陽性CD34陽性細胞CD19陽性、CD34陰性CD45低細胞CD19陽性、CD34陰性CD45中細胞およびCD19陽性CD34から単離された、ここでDNAをメチル化DNAから濃縮するためにマイラでこのDNAを日常的に利用してきた。ネガティブCD 45高細胞を合計9分間高で超音波処理し、カラム精製した後、このレーンでサイバーグリーン核酸ゲル染色を含む1%アロスゲル上で可視化した。Myraの後にもアクティブモチーフ法コレクターウルトラキットPCRを用いてコントロールメチル化SLC25A37およびコントロール非メチル化APC1遺伝子を用いてコントロール100塩基対ラダーを実行し、メチル化DNAの濃縮を確認した。

SLC 25の高増幅化。A 37は、前駆体B細胞サブセットにおけるメチル化DNA濃縮を確認する 一度習得すると、この技術は適切に実行されれば10時間で完了することができる。この手順を試みる際には、細胞を非常に穏やかに扱い、最適な量の抗体を使用して、この手順に従って汚染破片の発生を最小限に抑えることを忘れないでください。

次世代シーケンシングのような他の方法を実行して、どの遺伝子がメチル化されているか、前駆体B細胞サブセットなどの追加の質問に答えることができます。生きたヒト細胞を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、エアロゾル排出システムの実行などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。