Name: 臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: 学ぶ、臍帯血から前駆B細胞サブセットを分離する方法。密度勾配遠心とフローサイトメトリーにより高品質な核酸を取得し、免疫発生学や血液学研究に応用できる効率的な技術です。

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この作品は、KTに国立衛生研究所（NCI R00 CA132784）によってサポートされていました

1。臍帯血から単核細胞の単離<ol><li> 95ミリリットルすすぎバッファ（1:20希釈）にEDTA-PBS緩衝-addを5ミリリットルウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を調製します。ドガバッファと氷の上でバッファを保つ重要：気泡が分離カラムをブロックする可能性があるため、CD19 + B細胞を単離する際に脱気に失敗すると、バッファが最適な結果未満になることがあります。 </li><li>密度勾配遠心法を50mlコニカルチューブを準備します。臍帯血を処理するために必要な管の数（1管は8ミリリットルの血液を処理することができます）を決定し、各チューブへのFicoll-Paque PLUSの15ミリリットルを追加します。 </li><li> 24ミリリットルのDPBS（1X）と​​臍帯血の8ミリリットルを希釈し、慎重に50 mlコニカルチューブの各々でのFicoll-Paque PLUSの上の層薄めた臍帯血の混合物を。血液とのFicoll-Paque PLUSを混ぜて使用しないでください重要：臍帯血とのFicoll-Paque PLUSの混合を避けるために、45度の角度でチューブを保持し、層血液混合物にゆっくりと。 </li><li> 20℃で40分間、400×gで遠心分離し、単核細胞（MNC）はプラズマのFicoll-Paque PLUSのFicoll-Paque PLUSの浸透圧で高密度に堆積物による顆粒球や赤血球に対しインターフェースのままになります。サンプルID、日付、次のとパート3で使用されるラベル7 5ミリリットル丸底チューブ： </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> チューブ </td><td> ラベル </td><td> 目的 </td></tr><tr><td> 1 </td><td>染色されていない</td><td>フローサイトメトリーの間に正規化のための非染色細胞</td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td>フローサイトメトリーの間に生存率を決定するために、 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + + </td><td>ソートされた細胞が含まれています</td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> CD34 + / CD19を収集するには+（後期プロB - 早期プレBI）の細胞</td></tr><tr><td> 5 </td><td> 低い 45 </td><td> 低 / CD19 + / CD45（プレBI）の細胞- CD34を収集するには</td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 MED </td><td> / CD19 + / CD45 MED（プレBⅡ） -細胞CD34を収集するには</td></tr><tr><td> 7 </td><td> 高さ 45 </td><td> / CD19 + / CD45 高 （未熟B）細胞- CD34を収集するには</td></tr></tbody></table>コー​​トチューブ4、5、6、2％FBSを含む7と氷の上で全てのチューブを配置します。 <ol start="5"><li>慎重に上部の血漿層を吸引除去し、単核細胞層との接触を避ける。 10ミリリットルガラスピペットを用いて、慎重に新しい50 mlコニカルチューブに単核細胞層を転送します。シングル50 mlチューブに一緒に3つの管から単核細胞を兼ね備えています。 </li><li>穏やかに混合し、10分間、300×gで遠心分離し、PBSでチューブを埋める20℃慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。 1xを繰り返します。最初の洗浄後、ペレットを再懸濁し、単一の50 mlコニカルチューブに移す。 </li><li>穏やかに200μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。 、細胞懸濁液の1μlを取り外し1.5 mlマイクロチューブに1mlのPBSに追加して（遠心機で50mlの細胞懸濁液を配置した後にセルをカウント）カウントするために脇に置きます。 PBSでチューブを記入し、血小板を除去するために15分間、200×gで遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく、完全に上清を取り除きます。 </li></ol> 2。 MACS分離を用いて単核細胞から修正されたB細胞の単離<ol><li> 160μlの冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液でステップ1.7からペレットを再懸濁します。 </li><li> 40μlのB-CLLビオチン抗体カクテルを追加します。 4℃でよく混ぜ、10分間インキュベートしたピペット</li><li>細胞を洗浄 - 10万セル（セルNU当たり1ミリリットル冷（4℃）、EDTA-PBSバッファー追加mberは、ステップ1.7）で決定し、10分間300×gで遠心分離します。完全に上清を吸引除去し、その後、320μlの冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 80μlの抗ビオチンマイクロビーズを追加し、4℃でよく混ぜ、15分間インキュベート</li><li>細胞を洗浄 - 10分間、300×gで1 mlの冷（4℃）で10万個の細胞と遠心当たりEDTA-PBSバッファーに追加します。冷（4℃）、EDTA-PBSバッファー500μlに億セルまで再懸濁する。細胞数に応じてスケールバッファ量。 </li><li>遠心分離（ステップ2.5）中にMACSカラムとMACSセパレータを準備します。 、MACSセパレータの磁場中でのLSカラムを配置するカラムに冷（4℃）、EDTA-PBS緩衝液3mlを加えるとバッファがカラムを垂れることができます。を通る流れをキャッチするためにレセプタクルを使用します。フロースルーを捨てる。 </li><li>列の下に50 mlコニカルチューブを配置し、カラムに細胞懸濁液をピペット。非標識細胞はthrougドリップすることができますH列及び50 mlコニカルチューブに。重要：これらの抗体標識と細胞選別のために使用される細胞である。フロースルーは捨てないでください。ステップ2.5からの細胞のすべてを回復するには、コニカルチューブの壁に冷（4℃）、EDTA-PBSバッファーの追加の1 mlを加える。静かに混和し、カラムに残っている細胞懸濁液をピペット。 1xを繰り返します。カラムを通過した後、コニカルチューブに収集する非標識細胞を用いて2.8に進みます。 </li><li> 10分間300 xgでPBSおよび遠心分離機で標識されていない細胞を含む円錐管を埋める。慎重に細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去する。 EDTA-PBSバッファー200μlを加え、穏やかに細胞を再懸濁します。 </li></ol> 3。細胞選別のための抗体標識と準備<ol><li> （ステップ1.4）、 &quot;染色&quot;というラベルの付いたチューブに細胞懸濁液と場所の1μlを吸引します。 500μlのEDTA-PBSバッファーを加え、チューブを氷上に保存してください。 </li><li> 20を追加残りの細胞懸濁液中に万個の細胞あたりの各抗体液（CD19、CD34およびCD45）。よく混和し、室温で30分間、暗闇の中でチューブを配置します。ライトがオフになっているCD抗体は2-4光感受性、完全な手順は次のとおりです。 </li><li>抗体とのインキュベーションの30分後、細胞懸濁液40μlを吸引し、 &quot;7AAD&quot;というラベルの付いたチューブに入れます。 2分間、500×gでチューブと遠心分離機に1mlのPBSを追加します。上清を除去し、結合用緩衝液100μlの中に細胞を再懸濁します。 7AADの7μlの（7-Aminoactinomycin D）を追加し、室温で10分間、暗所でインキュベートする。 10分間のインキュベーションの完全なステップ3.4の間。 </li><li> CDの抗体で標識され、残りの細胞を含むチューブの上部にPBSを追加します。 3分間、500×gでチューブを遠心分離します。上清を除去し、500μlのEDTA-PBSバッファーを添加し、細胞ペレットを再懸濁します。 &quot;+ + +&quot;というラベルの付いたチューブに細胞懸濁液の全量を移す。細胞懸濁液の全てを回復するには&quot;+ + +&quot;というラベルの付いたチューブに50 mlコニカルチューブおよび転送するためには、ddには、追加の1ミリリットルEDTA-PBSバッファー。 </li><li>インキュベーション後（ステップ3.3）、7AADチューブに300μlの結合バッファーを加える。 &quot;染色&quot;、 &quot;7AAD&quot;や&quot;+ + +&quot;サンプルと&quot;34 +&quot;、 &quot; 低 45&quot;、 &quot;45 MED&quot;と&quot;45 高い &quot;チューブは、フローサイトメトリーのための準備が整いました。 </li></ol> 4。 MoFloのXDPフローサイトメーターを用いて細胞ソーティング<ol><li>ソート用MoFloアップセット：レーザーの位置を合わせ、液滴の流れを安定させる、廃棄遅延を決定する。 </li><li>製造元の指示に従って、インビトロジェンABCマウスビーズキット（あるいは同様のもの）を使用して、単一の色補正コントロールを準備します。正と負の集団の最適な分離のための蛍光チャンネルの電圧を調整して、単一のカラーコントロールを実行します。補正係数を設定し、収集プロトコルに補正パラメータを適用します。再確立補償係数抗体の新しいロットが得られるたびに。 </li><li> 図2に示すように、プロットなどのプロトコルを作成します。 </li><li>前方および側方散乱のために染色されていないサンプル、セット電圧とゲインを実行して、負の蛍光集団を同定する。 DNAの回収は、ソートの目標であるため、しきい値が低く設定されるべきです（≤1％）ので、DNA含有破片は回収試料を汚染しない。 *エアゾール避難システムは、人間の細胞がMoFlo上で実行されている生きているすべての回で実行されていることを確認します。 </li><li>ゲーティング戦略（ 図2）を設定するには、+ + +のサンプル（〜50,000イベント）の小アリコートを実行します。 B細胞の前駆細胞が成熟B細胞と同様に散布しないため、リンパ球ゲートは、潜在的なプロB細胞を含むことを確認するために、+ / CD34 +集団SSC対FSCのプロット上にゲートなしCD19をバックゲート。このサンプルからも7AADで負の蛍光人口を設定します。 </li><li>サンプルの実行可能性を判断するために7AADサンプルを実行します。で高生存率を有する試料からの種の細胞のみ死んだ細胞のように冒頭（≥95％）が無差別に染色するとソート集団を汚染する可能性がある。 </li><li> 4つの集団を収集するためにソートの決定を設定します。CD19 + / CD34 +、CD19 + / CD34 - / CD45 低い ; CD19 + / CD34 - / CD45 MED、およびCD19 + / CD34 -ハイ / CD45。すべての集団の一種の意思決定におけるリンパ球とダブレット判別ゲートを含む。 </li><li>ソーティングチップに目詰まりを防止するために、フィルタ+ +任意の集約は、ソート中に試料中に発生した場合に、ソートや再フィルタ直前40μmのセルストレーナーを通して+サンプル。 </li><li>冷却または氷パックチューブホルダーにPBS中2％FBSで被覆された採血管（ステップ1.4）に細胞をソートします。 </li><li>ソートが完了した直後には、DNAを抽出する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

プロトコルの成功に最も大きな影響を与える要因は、破片を汚染の存在である。臍帯血バンクから血液を要求するなら、それは可能な限り採取後できるだけ早く出荷血を持つことが重要です。また、リンパ球に分類されているサンプルでは、​​リンパ球の高い数字が含まれていますが、これらのサンプルは、前駆体B細胞の十分な数を持っていないので、使用しないでください。前駆体のサブセットごとに細胞の十分な数を得る確率を高めるために私たちは、臍帯血の少なくとも85ミリリットルで始まるをお勧めします。 それは成人末梢血の分離とは異なり、臍帯血単核球を分画したときに層がしばしば赤血球12で汚染されていることに注意することが重要です。このプロトコルは、汚染血小板を除去するために余分な洗浄工程が含まれています。臍帯血から単核球分離を記述するプロトコルは溶解ステップt含めて示唆している不要な赤血球を除去O。それは汚染瓦礫を生成し、細胞種の成功に悪影響を及ぼしますので、我々は、この手順をお勧めしません。 フローサイトメトリーによって区別されなければならないセルの数を削減するためには、事前の細胞選別へのB細胞の濃縮を行う必要がある。 B-Cellアイソレーションキット（B-CLL）に付属Miltenyi Biotec社、によって提供されるプロトコルは、末梢血のために最適化し、10万個の細胞あたり10μlのB-CLLビオチン抗体カクテルを使用することをお勧めされています。 、CD4（T細胞）は、CD11b（顆粒球、単球、マクロファージ）、CD16（NK細胞、マクロファージ、マスト細胞）、CD36（血小板）、CD235a（赤血球）、このステップは、CD2（NK細胞、T細胞）に対する抗体を使用しています臍帯血から非B細胞を枯渇させる。旧キットはプロB細胞上に存在するCD43に対する抗体が含まれているため、B細胞分離キットIIに記載していないキットを使用することが重要です。私たちの中にOPこのプロトコルのtimization、我々は、B-CLLビオチン抗体カクテルを40μlの合計が陽性細胞のソート結果を生成するのに十分であることがわかった。加えて、我々は、B-CLLビオチン抗体カクテルのわずか5μlの詳細を使用してセルのソートに悪影響を持っていたことが分かった。したがって、我々は非常に175から250000000の間の全単核細胞数のため、B-CLLビオチン抗体カクテル40μlの使用をお勧めします。細胞の低い、または高い数字で始まる場合、それはそれに応じて試薬をスケーリングする必要があるかもしれません。 B細胞の亜集団を区別するために使用することができるマーカーを記述する多数​​の競合の出版物があります。食い違いのほとんどは分化が進行中のプロセスであり、細胞表面マーカーの有無が緩やかな方法で代わりにオール·オア·ナッシングの方法で発生したという事実によって説明することができます。 / CD19 +およびCD45 +（の強さのレベル-このプロトコルは、CD34で）、低、中、高発現は、分化6の進行に対応した、CD45発現レベルの増加に伴って、事前のBI、プリBIIと未熟なB細胞を区別するために使用されていました。プロB細胞は、他の人がプロB細胞はCD19であることが示されている一方、CD19 + / CD34 + 13であることがいくつかによって記載されている+と-のプレBIの細胞/ CD34、CD19 + / CD34 + 9,10です。これらの相違に基づいて、我々は遅れてプロB細胞/早期プレBIの細胞としてCD19 + / CD34 +細胞を指定している。それは、この戦略は前駆疾患急性リンパ芽球性白血病の影響を受けた細胞に相当するB細胞のサブセットを分離するために開発されたことに注意することが重要です。しかし、目的の細胞サブタイプに応じて採用することができる複数の選別戦略があります。 抗体蛍光色素の組み合わせが利用できるセルソーターの能力に基づいて選択されるべきである。属としてリットルルール、パネルの中で最も明るい蛍光色素は、少なくとも人口の多い抗原およびその逆にラベルを付けるために使用されるべきである。特に二重染色集団、このような稀な事象を検出する際に、二重差別（ 図2B）は、ゲーティング戦略の極めて重要な部分です。これは、ダブルポジティブイベントは、抗体ではなく、単に互いに接着2単一染色した細胞の両方で染色真に単一細胞であることを保証。 高速、4ウェイ細胞選別は、必ずしも制御エアロゾル環境を作成します。従って、ヒト細胞選別を生きるには細心の注意を払って行う必要があります。公開された安全性と除染ガイドラインが利用可能であり、ソート前に14日、実施されるべきである。インスティテューショナル·バイオセーフティ委員会、あるいはそれと同等の承認は、ソートする前に必要になることがあります。ソート後の適切な除染については、漂白剤を10％の最終濃度に廃棄容器に入れておいてください。シmilarly、すべてのサンプルチューブと同様に即時のエリア内のすべての表面が十分にたて10％漂白剤溶液を用いて除染すべきである。 要約すると、このプロトコルは、前駆体B細胞の珍しい個体を得るための戦略を提供し、造血幹細胞とT細胞未熟含む臍帯血中に存在する任意の希少な個体群を単離するために変更される場合があります。最近では、未熟なB細胞が進行したHIV 15の個体の末梢血中に同定されている。したがって、この方法の有用性は、血液のがんの研究を越えて延びている。最後に、我々はまだ流れ選別された細胞にRNAの単離を行っていないが、この方法は、細胞を選別する時のセルがTRIZOLや、RNeasyキットからRLTとして同等のRNA互換性のあるソリューションに直接ソートされている必要があるという警告と適応する必要がありますキアゲンから入手。

病気に存在する収差を識別するためには、それは我々が病気に罹患した組織または細胞型に対応して、健康な組織や細胞を使用することは非常に重要です。この理由の1つは、組織の種類間のエピジェネティックな変化は、遺伝子発現を調節するための責任があり、正常な人間開発の1,2時の細胞分化のために重要です。 2番目の理由は、異常な組織特異的遺伝子発現制御は、通常の開発に悲惨な結果があるかもしれません、癌などの疾患状態の多数に寄与することが知られています。したがって、造血細胞を伴う疾患のより良い理解は、健康な造血細胞の知識が必要です。 細胞表面マーカー3の発現の変化によって特徴付けられる事象の体系的な順序を通じて骨髄進行中の造血細胞の開発。大人の参加者を対象とした研究があり小児科の参加者を対象とした研究では、前駆体B細胞の割合が5年未満6歳の個体では比較的高いことが示されているのに対し、骨髄は通常B細胞前駆体4,5の数が少ないが含まれていることを示す。臍帯血は、血液関連疾患や悪性腫瘍の治療に造血幹細胞の供給源として使用臍帯血バンクを介して容易に利用可能で、白血病を含む複数の疾患の標的細胞である未熟なB細胞およびT細胞7用に濃縮されており、リンパ腫。 骨髄中の前駆B細胞が広範囲に8,9表現型解析されており、異なるサブセットにこれらの細胞を選別するために使用することができ、特定の細胞表面マーカーの存在によって定義することができます。最古のプロB細胞と骨髄初めに一連のステージを介した通常のB細胞分化が進み、未熟またはナイーブB細胞で最高潮に達する。従ったCD19（プリBI）バンZELMら10に、プロB細胞は、CD34の存在によって特徴付けられるとステージ2への移行期に獲得されます。もはやステージ3（プリBII）細胞はCD34を発現し、細胞質IgMを発現し始める。最後に、ステージ4の決定的な特徴は、（B細胞未熟）表面IgMの発現である。このプロトコルで説明されたソーティング戦略は、まずコールドウェルら6で説明され、大幅に複雑と細胞選別実験を行った場合のコストを低減するだけで3つの細胞表面マーカーの使用が含まれていた。自分の仕事では、CD45およびB細胞分化の段階との関係が確立されました。彼らは、骨髄中のB細胞はCD45の発現の可変レベルを表示することを観察した。具体的には、CD45の高レベルで発現した細胞が表面IgMを発現した細胞（未熟なB細胞）に対応し、CD45の中間レベルを表明したものはcytoplを発現する細胞に相当するasmic IgM型（プレBII細胞）、およびCD45を低レベルで発現しているものは、（事前のBI細胞）細胞質IgMを発現していない細胞に相当した。このプロトコルは、B細胞などのメチル化CpGアイランドの回復アッセイ（MIRAのような高品質の核酸を必要と下流のアッセイに使用することができる臍帯血（ 図1）から前駆体のサブセットを分離するコールドウェルら6によって開発された戦略を使用しています）11および定量的リアルタイムPCRアッセイ。この方法は、臍帯血からのすべての非B細胞を枯渇させるために磁気ビーズを用いた初期分離を採用しており、わずか3抗体（CD34、CD19およびCD45）で染色する必要があります。回収された細胞は、B細胞分化の4段階を表す：1）CD34 +、CD19 +（後期プロBおよびpre-BI早い）、2）、CD34 - 、CD19 +、CD45低い （後期プレBI）; 3）CD34 - 、CD19 +、CD45 MED（プリBII）、4）、CD34 - 、CD19 +、CD45高 （未成熟B細胞）。

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS マルチスタンド</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS セパレーター</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>B細胞分離キット(B CLL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (1.5 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555415</tr><tr><td>DB Pharmingen PE マウス 抗ヒト CD34</td><td>BD Biosciences 560941</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS リンス ソリューション</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA ストック ソリューション</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD ファルコン 5 ml ポリスチレン丸底チューブ</td><td>BDBiosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml チューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck Alignment ビーズ</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Alignment ビーズ</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe エアロゾル排気フィルター</td><td>Beckmanコールター</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC マウス ビーズ キット</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・サイエンティフィック <td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャー・サイエンティフィック 血球計算盤</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin モデル 3R 卓上遠心分離機</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP フロー サイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>エアロゾル排気ユニット</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

臍帯血から前駆b細胞サブセットの分離

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

臍帯血は、高度の異なる系統のコミットメントの段階で造血前駆細胞が濃縮されています。我々はB細胞分化の4つの異なる段階で前駆体を単離するためのプロトコルを開発してきました。遺伝子が発現し、エピジェネティックな修飾は、組織特異的な方法で行われているので、それはゲノムと疾患の発症につながる可能性エピゲノムの変化を識別できるようにするために、組織や細胞の種類を区別することが重要です。このメソッドは、分化のどの段階で臍帯血中に存在する細胞の任意の型に適合させることができます。 この方法は、4つの主要なステップを含む。まず、単核細胞密度遠心分離によって分離されている。第二に、B細胞は単核細胞から非B細胞を認識して削除するビオチン標識抗体を用いて濃縮されている。第三のB細胞は蛍光個々の段階に特異的な細胞表面タンパク質抗体で標識されているB細胞の開発。最後に、蛍光標識された細胞は、ソートされ、個々の集団が回収される。回収された細胞は、下流の核酸アッセイに利用するのに十分な量と質である。

サンプル間のばらつきは、セルのソート（ 表1）の成功に重要な役割を果たしている。良い成功率を持つサンプルが汚染瓦礫のレベルが低い（ 図3A）を持っていると貧しい成功率を持つサンプルが汚染瓦礫の高レベル（ 図3B）を持っています。臍帯血サンプルは出荷の24時間（O / N最優先）内で収集された場合は、サンプル間のばらつきが多少制御することができます。 各前駆B細胞サブセットからの流れ選別された細胞は、核酸アイソレーションを実行するのに十分な量と質である。単離されたDNAは、高品質のものであり、下流の分析に使用することができます。我々は日常的にメチル化DNA（ 図4）を濃縮するためにミラ11でこのDNAを利用しています。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 臍帯血ファシリティデータ </td><td> 悪い並び替え </td><td><stチョロン&gt;グッド替え</td></tr><tr><td>抗凝固剤とワーキング血液量（ml）を</td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td>白血球[10 3 /μlで] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td>リンパ球[10 3 /μlで] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td>リンパ球（％） </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td>赤血球[10 6 /μL] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> 社内データ </td></tr><tr><td>のFicoll-Paque後の細胞数</td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> MACS分離後の細胞数</td><td> 22男</td><td> 16.5 M </td></tr><tr><td>合計イベント数（MoFlo XDP） </td><td> 30.57 M </td><td> 19.97 M </td></tr><tr><td>生存率（％） </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td>リンパ球ゲート内の細胞（％） </TD&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 88パーセント</td><td> 88パーセント</td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / 低 CD45 </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 89パーセント</td><td> 87パーセント</td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 MED </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 89パーセント</td><td> 89パーセント</td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 -ハイ / CD45 </td></tr><tr><td>総細胞数</td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td>合計イベント数の％ </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td>効率性</td><td> 91パーセント</td><td> 90パーセント</td></tr></tbody></table> 表1。代表的な細胞ソート統計。行1-5は、臍帯血機能により提供される回数です。残りの行は、我々の研究室で収集したデータです。貧しいソートは破片やリンパ球ゲート内の細胞の割合が低いの高いレベルが含まれていました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> ふぃぎゅRE 1。手順のフローチャート。臍帯血が処理され、単核細胞をFicoll-Paqueプラスを使用して隔離されています。追加の洗浄工程が汚染血小板を除去するために含まれています。 B細胞をMACSヒトB細胞単離キット（B-CLL）を使用して単核細胞から分離されています。このステップでは、すべての非B細胞を除去するためにビオチン標識モノクローナル抗体（CD2、CD4は、CD11b、CD36、抗IgE及びCD235a）を使用しています。回収されたB細胞は、その後前駆B細胞サブセットを回復するMoFloのXDPフローサイトメーターを使用してソートされたCD34-PEおよびCD45-FITC抗体、CD19-APCで標識されています：CD19 + / CD34 +、CD19 + / CD34 - / 低 CD45 、CD19 + / CD34 - / CD45 MED、およびCD19 + / CD34 -ハイ / CD45。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> 図2。ポップアップを識別し、ソートするためのゲーティング戦略警告事項。赤い矢印は後続のプロットに適用されるゲートを示す。 R4、R5、R6及びR7ゲートはソート集団を示しています。）フォワード対濃縮リンパ球集団を示す側面散布図。 R1は、リンパ球ゲート。単一細胞対ダブレットを識別するための前方散布図のb）の高さ対幅。 R2は、単一セルゲートますc）CD19-APC抗体陽性細胞は、CD34-PE陰性と陽性の集団に分類されます。 R3は、CD19 + / CD34 -ゲート、R4、CD19 + / CD34 +ゲートを示す希望するソート人口d）は 、CD19 + / CD34 -細胞は3多少異なるCD45-FITC集団に分類されます。 R5とR6、CD19 + / CD34 - / CD45 低およびCD19 + / CD34 - / CD45 MED集団であった。 CD19 + / CD34における高いため細胞数のR7、 - / CD45 高い人口は、この種のゲートのみ包含人口の部分。この集団のすべての細胞は、下流の分析のために収集する必要はありません。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> 図3。）カラム濃縮した後に破片を汚染の低レベル。 R1は、リンパ球ゲートますb）カラム濃縮した後に破片を汚染の高レベル。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> 図4。前駆B細胞のサブセットからのメチル化DNAの濃縮は前駆B細胞サブセットから単離された）超音波処理したDNAは高品質である。ライブラリー構築のためのDNAは、200から600 bpの平均を超音波処理する。レーン1：プロメガ100bpラダー（カタログ番号G2101）、レーン2：CD19 + / CD34 +細胞から単離した全DNA、レーン3：CD19から単離した全DNA + </sアップ&gt; / CD34 - / CD45 低細胞;レーン4：CD19 + / CD34から分離された100 ngのDNA - / CD45 MED細胞 ;レーン5：CD19 + / CD34から分離された100 ngのDNA - / CD45 high細胞。 DNAは9分（; 30秒ON、OFF 30秒）の合計の高さのDiagenode社のBioruptorを使って超音波処理した。 DNAはカラム精製し、SYBRグリーン核酸ゲル染色を用いて1％アガロースゲル上で可視化したb）のミラActivMotif MethylCollectorウルトラキット、SLC25A37によるPCR（1-6）とAPC1（7-12）を使用した後は、確認するために実行されるメチル化DNAの濃縮。 1＆7：超音波処理したゲノムDNA（無MIRA）; 2＆8：MIRA-CD19 + / CD34 +細胞、DNA、3＆9：MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 低 DNA; 4＆10：MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 MED DNA; 5＆11：ミラ-CD19 + / CD34 - / CD45の高い DNA、6＆12：水の制御。 SLC25A37の高い増幅がメチル化DNAの濃縮を確認前駆B細胞のサブセットインチ

ここでは、臍帯血から前駆体のサブセットB-細胞を単離するためのプロトコルを記述します。核酸の十分な量と質を細胞から抽出したDNAまたはRNAを利用して、その後のアッセイに使用することができる。

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

この手順の全体的な目的は、臍帯血から前駆B細胞のサブセットを単離することです。まず、密度勾配遠心分離法によって臍帯血から単核細胞を単離します。次に、細胞表面抗原をビオチン標識抗体でラベルし、残りの非B細胞を磁気的に除去します。次に、単離したB細胞を、CD 19、CD 34、およびCD 45細胞表面抗原に対する抗体で蛍光標識します。最終ステップとして、フローサイトメトリーを用いて細胞を分取し、前駆B細胞サブセットを回収します。これにより、高品質なDNAおよびRNAを必要とするダウンストリームアッセイに使用するために、十分な数と品質の細胞を取得することが可能になります。代替法と比較した細胞ソーティング戦略の利点の一つは、フローサイトメーターの使用時間が短縮され、蛍光抗体が3種類のみで済むため、実験コストを大幅に削減できる点にあります。一般的に、本手法に不慣れな方は、フローサイトメトリー用の臍帯血細胞調製における手法の多様性や、フローサイトメーター調製の複雑さに苦労することがあります。本手法は、健康なB細胞前駆細胞に関する知見を提供できるだけでなく、T細胞などの臍帯血に含まれる他の細胞種や、白血病やリンパ腫など、あらゆる造血細胞が関与する疾患の研究にも適用可能です。臍帯血および細胞の処理において、細胞生存率を最大化し、混入するデブリを低減させるために必要な適切な手技を言葉で説明することは困難であるため、本手法の視覚的な提示が極めて重要となります。臍帯血から単核細胞を分離するには、まず8 mLずつ分注した臍帯血を24 mLのDPBSで希釈します。次に、各希釈血混合液を50 mLコニカルチューブに入れた15 mLのFicoll-Paqueの上に、層が分かれるように注意しながらゆっくりと重層させます。次に、密度勾配による細胞分離を行うため、血液を400 ×g、20 °Cで40分間遠心分離します。その間に、表に記載されている通り、サンプルID、日付、およびその他の適切な情報を50 mLラウンドボトムチューブに記入してください。分離後、単核細胞は血漿と不透明層の界面に留まり、顆粒球と赤血球は沈殿します。ここで、単核細胞層に触れないように注意しながら、上層の血漿層を吸引します。その後、10 mLガラスピペットを用いて、50 mLチューブ3本分から単核細胞層を慎重に回収し、新しい50 mLチューブ1本にまとめます。この新しいチューブにPBSを満たし、細胞懸濁液を穏やかに混合した後、300 ×g、20 °Cで10分間、2回細胞を洗浄します。1回目の洗浄後、ペレットを再懸濁し、1本の50 mLコニカルチューブに移します。2回目の洗浄後、細胞ペレットを200 µLのPBSで穏やかに再懸濁し、細胞懸濁液1 µLを、計数用に1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れた1 mLのPBSに移します。その後、50 milliliterチューブ内の細胞をさらにPBSで洗浄し、ペレットを乱さないように上清を完全に除去します。単核細胞からB細胞を分離するために、まず洗浄後のペレットを、4 °Cで新鮮に調製した160 microlitersのDGAs E-D-T-A-P-B-Sバッファーに再懸濁します。次に、B細胞分離キットのbio ITIN抗体カクテル40 µLを細胞懸濁液に混合します。細胞を4 °Cで10分間インキュベートした後、細胞10 million個あたり1 mLの4 °C EDTA-PBSバッファーを用いて、遊離抗体を洗浄除去します。その後、細胞ペレットを320 µLの4 °C EDTA-PBSバッファーに再懸濁します。4°Cで15分間インキュベートした後、80 µLのanti biotin microbeadsを細胞懸濁液に加えて混合します。遠心分離中に細胞を再度洗浄します。Max Separatorの磁場にLSコラムを設置し、4°Cに冷却した3 mLのEDTA-PBSバッファーをコラムに通します。次に、洗浄した細胞を最大100 million個、4 °CのEDTA-PBSバッファー500 µLで再懸濁します。その後、細胞懸濁液をカラムに分注し、カラムを通過して得られる非標識細胞を50 mLコニカルチューブで回収します。元のコニカルチューブの壁面に、4 °CのEDTA-PBSバッファーを1 mLずつ、計2 mL追加し、その都度緩やかに混合して残った細胞懸濁液をカラムに分注することで、すべての細胞を確実に回収してください。最後に、未標識細胞が入ったコニカルチューブにPBSを満たします。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。次に、200 µLのEDTA-PBSバッファーで細胞を穏やかに再懸濁します。抗体標識を開始します。まず、細胞懸濁液1 µLを、あらかじめラベルを貼った未染色のチューブに移します。チューブに500 µLのEDTA-PBSバッファーを加え、氷上に保存します。すべての照明を消し、残りの細胞懸濁液100万個あたり、CD 19、CD 34、およびCD 45抗体をそれぞれ20 µLずつ加えます。よく混ぜ合わせ、チューブを室温の暗所に30分間置きます。次に、抗体で標識した細胞懸濁液40 µLを、7 AからDまで標識されたチューブに移します。細胞を1 mLのPBSで洗浄し、その後、ペレットを100 µLの結合バッファーで再懸濁します。これらの細胞に7-AADを7 µL加え、室温・暗所で10分間インキュベートして細胞を7-AADで標識します。抗体標識した細胞のチューブの空いた部分をPBSで満たし、抗体標識細胞を洗浄した後、ペレットを500 µLのEDTA-PBSバッファーで再懸濁します。次に、抗体標識細胞懸濁液の全量を、CD19陽性、CD34陽性、CD45陽性の標識済みチューブに移します。チューブをさらに 1 mL の E-D-T-A-P-B-S バッファーで洗浄し、残りの細胞懸濁液を CD 19 positive CD 34 positive CD 45 positive ラベル付きチューブに移します。最後に、MO flow XDP フローサイトメーターを用いて細胞をソートするため、seven A a D チューブに 300 µL の結合バッファーを加えます。まず、ソート用に MO flow をセットアップし、適切なコンペンセーションコントロールを実行した後、この図に示されているようなプロットを含むプロトコルを作成します。エアロゾル排気システムが常に作動していることを確認し、未染色のサンプルを用いて前方散乱光および側方散乱光プロットの電圧とゲインを設定します。蛍光陰性集団を特定し、DNAを含むデブリが回収サンプルに混入しないよう、閾値を1%以下に設定してください。CD 19陽性、CD 34陽性、CD 45陽性サンプルのイベント数を約 50,000 回計測します。先ほど実演したようにゲーティング戦略を設定し、ゲート未設定のCD 19陽性、CD 34陽性集団をサイドスキャッター対フォワードスキャッタープロットにバックゲーティングします。これにより、リンパ球ゲートにプロB細胞が含まれていることを確認します。このサンプルを使用して、7-AAD染色の陰性蛍光集団も設定します。次に、7-AADサンプルを走らせてサンプルの生存率を判定してください。死細胞は無差別に染色され、ソート集団を汚染させる可能性があるため、最初に生存率が95%以上のサンプルからのみ細胞をソートします。ここで、CD19陽性CD34陽性、CD19陽性CD34陰性CD45 low、CD19陽性CD34陰性CD45 medium、およびCD19陽性CD34陰性CD45 highの4つの集団を回収するようにソート条件を設定します。クロッグ（目詰まり）を防ぐため、すべてのポピュレーションのソート判定にリンパ球およびダブレット排除ゲートを含めてください。ソートのヒントとして、CD 19陽性 CD 34陽性 CD 45陽性サンプルは、ソート直前に40 micronのセルストレーナーでろ過してください。その後、PBSで2%FBSをコートしたラベル付き回収チューブを氷詰めチューブホルダーに配置し、ソート完了後直ちに細胞を適切な回収チューブにソートしてください。サンプル間のばらつきは細胞の回収成功率に影響するため、適切にソートします。リンパ球ゲート内に高い割合の細胞が存在することを確認してください。成功率の高いサンプルでは、ゲート設定されたリンパ球集団の下方および左方に位置するイベント数が少ないことから、混入しているデブリのレベルが低いことが示されます。成功率の低いサンプルには、高レベルの混入デブリが含まれています。質の低いサンプルでは、これらのイベントが著しく増加しています。フローソートされた細胞および、各前駆B細胞サブセットからその後単離されたDNAは、ダウンストリーム解析を実施するために十分な量と品質を備えています。我々は、CD19陽性CD34陽性細胞、CD19陽性CD34陰性CD45低発現細胞、CD19陽性CD34陰性CD45中発現細胞、およびCD19陽性CD34陰性CD45高発現細胞から単離したDNAを用い、メチル化DNAを濃縮させるためにMyraを日常的に利用してきました。これらのDNAを強設定で計9分間ソニケーションし、カラム精製した後、SYBR Green核酸ゲル染色剤を用いた1%アガロースゲルで可視化しました。このレーンには、コントロールとして100 base pairラダーも流しました。Active Motif社のMeDIP-it ultra kitを用いてMyra処理を行った後、メチル化DNAの濃縮を確認するために、コントロールのメチル化SLC25A37および非メチル化APC1遺伝子を用いてPCRを実施しました。SLC 25. A 37の増幅レベルが高いことは、前駆B細胞サブセットにおけるメチル化DNAの濃縮を裏付けています。この手法を習得すれば、適切に実施することで10時間で完了させることが可能です。本手順を行う際は、細胞を非常に緩慢に扱い、最適化された量の抗体を使用することで、コンタミネーションとなるデブリの発生を最小限に抑えることが重要です。どの遺伝子がメチル化されているかや前駆B細胞サブセットなど、さらなる疑問を解決するために、次世代シーケンシングなどの他の手法を実施することが可能です。生存しているヒト細胞の取り扱いは極めて危険である場合があるため、本手順を行う際は、常にエアロゾル排気システムの使用などの予防策を講じることを忘れないでください。

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