集束走査超音波を用いた脳への抗体の送達

治療用抗体のうち、脳に取り込まれるのはごく一部です。私たちの方法では、血液脳関門を一過性に開くことで、抗体を脳に送り込みます。この技術により、非侵襲的にマウスの脳に抗体を送達することができます。

セルカウンターを使用してマイクロバブルの品質管理を行うには、アマルガメーターからマイクロバブル溶液を取り出し、19ゲージの針を使用してマイクロバブル溶液バイアルのセプタムを貫通します。19ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、100マイクロリットルのマイクロバブルを5ミリリットルのろ過されたフロー溶液に希釈し、希釈したマイクロバブル溶液の100マイクロリットルをキュベット内の10ミリリットルのろ過フロー溶液にピペットで移します。キュベットをセルカウンタープラットフォームの所定の位置にロックし、サンプル取得に30ミクロンの開口部が使用されることを確認します。

ソフトウェアで、標準操作方法をロードし、標準操作方法と濃度の編集を選択します。希釈に5, 000倍を入力し、適用してOKをクリックします。[情報の編集] をクリックして、適切なファイル名を選択します。プレビューを選択し、マイクロバブルサンプル濃度が10%未満であることを確認します。[開始]と[OK]を選択してサンプル取得を開始します。

測定後、セルカウンターの開口部をろ過したフロー溶液ですすいでください。希釈したマイクロバブル溶液のキュベットを水浴中で30秒間超音波処理します。示されているように超音波処理されたマイクロバブル溶液を測定し、データに空白のラベルを付けるために情報の編集をクリックします。

ブランクを測定した後、最初の読み取り値から最終的な読み取り値を差し引いて、マイクロバブルではない粒子を除外します。切片を蛍光抗マウスIgG抗体で標識するには、1ミリグラムのマウスIgG抗体をAlexa Flour 647でAlexa Flour 647に添加し、製造元の指示に従って室温で15分間標識します。インキュベーションの終了時に、蛍光標識した抗体溶液をスピンカラムにロードし、遠心分離により抗体を精製します。

次に、分光光度計を使用してタンパク質濃度を測定します。集束走査型超音波システムを設定するには、ウォーターボーラスに5mmのスペースを追加して、超音波フォーカスをウォーターボーラスの底部から9mm下に配置します。水ボーラスに約300ミリリットルの脱気脱イオン水を入れ、環状アレイを充填した水ボーラスに配置します。

デンタルミラーを使用して、表面に気泡がないことを確認し、アプリケーションソフトウェアを起動します。波形メニューで「波形デューティ・サイクルを設定」を選択し、パルス繰り返し周波数を10ヘルツに、デューティ・サイクルを10%に、フォーカスを80ミリメートルに、中心周波数を1メガヘルツに、振幅を0.65メガパスカルに、メカニカル・インデックスを0.65に設定します。setを押して波形を定義し、波形をメモリに保存します。

治療計画を選択した後、モーションコントローラーウィンドウのスキャンタブを開き、X次元にモーションの開始、停止、増分値を入力し、Y方向の動きの開始、停止、増分値を入力します。治療部位のアクションを定義するには、「event」をクリックし、スクリプト編集ウィンドウを開きます。各処理サイトで選択した順序で実行されるアクションのリストを選択し、移動タイプをラスターグリッドに設定します。

[イベント] タブで、[アクションの追加] を選択し、移動を同期的に開始するトリガー ARB 待機アクションとトリガー ARB アクションを停止するアクションをスクリプト パネルに移動します。次に、[待機アクション]をクリックし、6, 000ミリ秒の待機時間を選択します。分析のために動物を準備するには、麻酔をかけたマウスでつま先のつま先をつまむことに対する反応の欠如を確認した後、油性マーカーを使用して頭の中心にラベルを付け、次に小さな計量ボートの底にラップを接着します底のカットオフで計量ボートを接着し、計量ボートに超音波ゲルを充填します。

集束超音波治療のためには、マイクロバブルのバイアルを反転させ、マウスの体重1グラムあたり1マイクロリットルの溶液を29ゲージのインスリン注射器に静かに装填します。100マイクロリットルの蛍光標識抗体をシリンジに加え、親指と人差し指の間でシリンジを静かに反転させて転がし、抗体とシリンジ内のマイクロバブルを混合します。150マイクロリットルのマイクロバブルと抗体溶液をマウスに慎重かつゆっくりと軌道後退注入し、タイマーを2分間セットします。

眼科用軟膏を塗布し、マウスをヘッドホルダーに置き、鼻をホルダーに固定します。小さな超音波ジェルで満たされた計量ボートを頭の上に置き、計量ボート内の超音波ゲルの上に座るまで水ボーラスを下げます。次に、ジョイスティックを使用して、トランスデューサーの焦点をヘッドの中心に視覚的に合わせます。

タイマーがオフになったら、ソフトウェアのモーションタブで、リセット原点を選択し、完全なスキャンを選択します。治療が完了したら、動物の目に眼軟膏を塗布し、マウスを温めた回復チャンバーに入れます。.ここでは、マイクロバブルが正しく生成されたときに得られるサイズと濃度の培養カウンター測定の代表的な結果を示します。

脳による抗体の取り込みは、赤外線スキャナーまたは切片の蛍光顕微鏡を使用して、脳全体または組織切片で容易に視覚化できます。これらの画像で示されているように、ミクログリアマーカーの代表的な染色は、抗体の送達後にミクログリアがより食作用的になるかどうかを判断するために使用できます。動物の福祉と安全を確保することは、特に眼窩後注射を行い、マウスの頭上にトランスデューサーを適用するときに重要です。

この方法により、さまざまなスキャンパターンを適用して、海馬、皮質、個々の脳半球など、脳のさまざまな領域をターゲットにすることができます。この技術は、血液脳関門を貫通する新しい治療法や薬剤の開発、および血液脳関門の形成と開放のメカニズムの研究に使用できます。