単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化
March 5th, 2021
ここでは、従来の暗視野顕微鏡を用いて、細胞膜上の金ナノロッド(AuNRs)のダイナミクスを監視する方法を示す。単一の AuNR の位置と向きは ImageJ および MATLAB を使用して検出され、AuNRs の拡散状態は単一の粒子追跡解析によって特徴付けられる。
我々のプロトコルは、単一粒子チェック分析を使用して、ダイナミクスの位置と向きを監視し、細胞膜上の金色ナノロッドの拡散を特徴付けます。この方法を用いて、金色ナノロッドの並進と回転のダイナミクスを両方得ることができ、その動的を総合的に分析して提示することができます。このプロトコルは、他のタイプの複雑な生物学的システムの研究に使用される可能性を有する。
まず、エタノールを浸したガラスカバースリップを炎に燃やし、フェノールレッドのない2ミリリットルの細胞培養培地を含む35 x 10ミリメートルの細胞培養皿にカバースリップを入れることから始めます。関心のある細胞懸濁液の50マイクロリットルをカバースリップに加え、皿を前後左右に軽く振って細胞を均等に分配します。CTABコーティングされた金ナノロッドの20マイクロリットルを皿に加える前に、細胞が20〜40%の合流に達するまで約12時間、細胞培養インキュベーターに皿を入れます。
皿の向こう側にナノロッドを均等に分散させるために穏やかに揺れた後、5分間加湿した雰囲気の中に皿を置きます。インキュベーションの終わりに、皿から100マイクロリットルの上澄み物をガラススライドの溝にゆっくりと移し、カバースリップセル側をスライド溝の上に慎重に置き、カバースリップの端をマニキュアで密封し、マニキュアを乾燥させてから、暗視野顕微鏡ステージにスライドさせます。暗視野顕微鏡による単一粒子追跡の場合、油の上に油滴を浸しダークフィールドコンデンサーに置き、コンデンサーがガラススライドに接触するまでノブを回します。
カバーガラスの上部に油を一滴置き、60倍油浸出目的が油に触れるまで焦点を合わせます。光源をオンにし、焦点を合わせるノブを少し回して、イメージング平面に焦点を合わせます。次に、顕微鏡ソフトウェアのカメラアイコンをクリックして、カラーCMOSカメラを使用してサンプル散乱光画像時系列を記録し、TIFF形式で画像を保存します。
1 つの長期軌跡を抽出するには、ImageJ でイメージを開き、画像、タイプ、および 8 ビットをクリックして、RGB モードから 8 ビット モードにイメージを変換します。コントラストを調整するには、画像をクリックし、調整し、明るさのコントラストを調整し、パラメータを設定します。ターゲット パーティクルを選択し、コントロール X を使用して時系列の背景を切り取ります。
クリックプラグイン、パーティクルトラッカークラシック、およびパーティクルトラッカーをクリックして、パーティクル検出ウィンドウとパーティクルリンクウィンドウを開き、半径を 6、カットオフを 0.01%に設定し、パーセンタイルを 0.01%に設定し、リンク範囲を 10 に設定し、変位を 10 に設定して[OK]をクリックして、パーティクル トラッカーの結果ウィンドウを開いて結果を確認します。生成された軌道を検査するには、すべての軌道をクリックして視覚化します。ソフトウェアが生成した軌道と金ナノロッドの移動軌道が一致する場合は、[完全なレポートを保存] をクリックして結果を保存します。
ソフトウェアによって生成された軌道が金ナノロッドの移動軌道と一致しない場合は、再リンクパーティクルをクリックして、検出されたパーティクルを異なるリンク範囲とパーセンタイルパラメータで再リンクします。XY 座標に従って各フレームの金ナノロッドの中心ピクセル座標を求めるには、xy コーディネーションを使用します。m関数。
3 x 3 ピクセルの行列を区切る場合は、赤または緑のチャンネルの 9 つの散乱強度値を抽出し、平均値を計算する場合は、rgextract を使用します。m関数。その後、偏光を使用します。
m関数は、デュアルチャネル差動法を用いて極角を計算する。表の数式を使用して動的パラメータを計算するには、2 つの解析スクリプトを実行します。軌道の視覚的な分析では、X 座標を X、Y 座標を Y、時間を Y に設定し、プロット、散布図、およびカラー マップをクリックし、グラフ パラメータを設定し、カラー バーを追加します。
平均平方変位時間間隔の数値を生成するには、時間間隔をX、平均二乗変位をY.Clickプロット、散布、解析、継手、非線形曲線の継手、開いたダイアログとグラフパラメータを設定します。複数粒子統計解析の場合、対象の動的パラメータを Y に設定し、プロットとヒストグラムをクリックします。ヒストグラムをダブルクリックして、分割サイズまたは分割数を設定し、[適用] をクリックします。
次に、列を追加し、グラフのパラメータを設定します。時系列分析の場合は、時間を X、時系列パラメーターを Y に設定します。ポップアップ ウィンドウで、[行] を選択して [OK] をクリックします。次に、グラフのパラメータを設定します。
縦断プラズモニック最大40×85ナノメートルのCTAB被覆金ナノロッドは約650ナノメートル、横共鳴は520ナノメートルです。U87細胞膜上のCTABコーティングされた金ナノロッドの散乱強度は、この実験で追跡されたCTABコーティングされた金ナノロッドが十分に単分散していることを示すガラス上のCTABコーティング金ナノロッドのそれと一致する狭い幅を有する典型的なガウス分布を示す。図示したように、500以上のCTABコーティングされた金ナノロッド軌道は、暗視野顕微鏡で追跡することができ、長距離拡散軌道と閉じ込められた拡散軌道に分けることができる。
この代表的な分析では、500本の軌道の旋回半径は、旋回半径0.5マイクロメートルの平均値分布を示し、最大変位は小さな値でより分布していた。このアンサンブル時間平均平均平方変位解析で示されているように、CTABコーティングされた金ナノロッドは通常、およそ1のアルファで拡散する。しかし、すべての軌道から得られる拡散係数とアルファの密度分布は、金ナノロッドのダイナミックさが、スーパーディフュージョン、ブラウン、および沈水運動を伴う異種分布を示すことが明らかである。
さらに、単一粒子統計解析と時系列パラメータ解析を使用して、2つの代表的な長期限定軌道と移動軌道を特徴付けることができます。一般的にいくつかの困難なトレードオフがあるので、単一の粒子追跡分析の読み出しからデータの単一の新しい解釈を要約して抽出する必要があります。
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概要
この研究は、細胞膜上の金ナノロッド（AuNR）のダイナミクスを観察するために従来の暗視野顕微鏡法の使用を示しています。このプロトコルは、単粒子追跡分析を用いてAuNRの平行移動および回転ダイナミクスの両方を特徴づけます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生物物理学
- 細胞生物学
- ナノテクノロジー
背景
- 金ナノロッド（AuNR）は細胞プロセスを研究するための有望なツールです。
- 細胞膜上のそれらのダイナミクスを理解することで、細胞間相互作用についての洞察が得られます。
- 従来の顕微鏡技術はこれらのダイナミクスを効果的にモニタリングするために利用できます。
- 単粒子追跡分析により、粒子挙動の詳細な特徴づけが可能になります。
研究の目的
- 細胞膜上のAuNRのダイナミクスをモニタリングすること。
- AuNRの拡散と配向を特徴づけること。
- 他の生物学的システムに適応できるプロトコルを提供すること。
使用した方法
- 細胞培養のためのガラスカバースリップの準備。
- カバースリップへの細胞懸濁液の適用。
- 希望する融合度を達成するための細胞のインキュベーション。
- 観察のためのCTAB被覆金ナノロッドの添加。
主要な結果
- 暗視野顕微鏡法を用いたAuNRダイナミクスの成功したモニタリング。
- 平行移動および回転ダイナミクスの両方の特徴づけ。
- 複雑な生物学的システムを研究する可能性の実証。
- データ分析のためのImageJとMATLABの利用。
結論
- このプロトコルはAuNRダイナミクスを研究するための信頼できる方法を提供します。
- 結果は他のナノ材料と生物学的システムに適用できます。
- 細胞とのナノ材料相互作用の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding nanoparticle diffusional dynamics on cell membranes informs rational design of nanomedicine delivery systems by revealing translational and rotational behaviors that impact cellular uptake. Single particle tracking of gold nanorods enables de-risking of nanocarrier hypotheses through quantitative assessment of surface diffusion states, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This approach provides a reusable biophysical assay platform for mechanistic interrogation of nanoparticle-membrane interactions across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by characterizing gold nanorod translational and rotational dynamics on live cell membranes.
- Operational Value: Enable biological de-risking through quantitative extraction of location and orientation data using ImageJ and MATLAB.
- Predictive Value: Support portfolio triage by identifying distinct motion states such as long-range transport and limited-area confinement that correlate with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare validated biological systems for downstream workflows by tracking over 500 single nanorod trajectories with monodisperse scattering intensity.
- Reproducibility: Standardize measurements via mean square displacement analysis showing Brownian motion (alpha ≈ 1) across ensemble averages.
- Screening Scalability: Highlight platform reuse for studying surface or intracellular particle diffusion in different biological cells using darkfield microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Address risk-adjusted advancement decisions by linking single particle statistical analysis to time series parameters that characterize confined and moving trajectories.
- Mechanistic De-risking: Focus on predictive value by revealing heterogeneous diffusion dynamics including superdiffusion, Brownian, and subdiffusion modes from density distributions of diffusion coefficients and alpha values.
- Disease-Relevant System: Apply method to U87 MG cell membrane as a model for glioma-related nanomedicine delivery investigations.
Pipeline & Workflow Integration
Position the method within early discovery to support hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking before lead identification stages.
- Discovery Biology: Explain how the method supports hypothesis testing by probing position and orientation of individual nanoparticles to reveal translational and rotational states.
- Screening: Describe assay readiness through quantitative outputs like radius of gyration (mean 0.5 μm) and displacement distributions from hundreds of tracked particles.
- Analytics: Highlight measurements such as mean square displacement, diffusion coefficient, and alpha exponent that enable comparison of diffusive states across conditions.
- Translational Research: Connect the method to preclinical continuity by characterizing two distinct motion states that inform nanocarrier design for intracellular delivery.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability for studying complex biological systems beyond gold nanorods, including other nanomaterials and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of nanoparticle-membrane interaction hypotheses.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via ImageJ and MATLAB-based extraction of location, orientation, and dynamic parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying long-range transport versus confined diffusion states that affect cellular uptake efficiency.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative diffusive state distributions that reduce late-stage biological risk in nanomedicine development.
Implementation Considerations
- Required expertise in single particle tracking, darkfield microscopy, and MATLAB/ImageJ for trajectory analysis.
- Instrumentation needs include oil immersion darkfield condenser, 60X oil immersion objective, and color CMOS camera for time-lapse imaging.
- Cross-team standardization requires consistent parameter settings for particle detection (radius 6, cutoff 0, percentile 0.01%, link range 10, displacement 10).
- Adaptation considerations across model systems involve adjusting incubation times and nanorod concentrations based on cell type and membrane properties.
- Practical limitations include tradeoffs in single particle trajectory interpretation due to heterogeneous diffusion states requiring novel data interpretation approaches.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:48
Microscope Slide Preparation
2:06
Single Particle Darkfield Microscopy (DFM) Tracking
2:53
Data Acquisition
4:21
Red/Green Values
4:59
Data Analysis
5:30
Mean Square Displacement (MSD), Multi-Particle, and Time Analyses
6:33
Results: Representative Single Nanoparticle DFM of AuNR Diffusion Dynamics
8:39
Conclusion
