Name: 単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクス可視化法。並進・回転動態の同時解析により、ナノ材料と細胞の相互作用を詳細に解明できます。

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この研究は、中国国立自然科学財団の助成番号21425519、91853105、21621003によって支援されました。

<ol><li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341(2019).</li>
<li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+nanoparticles%3A+journey+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Particle+Tracking%3A+From+Theory+to+Biophysical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+connecting+the+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction%3A+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson%27s+fluid-mosaic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li>
<li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li>
<li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+membrane+organization%3A+composition%2C+regulation+and+roles+of+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li>
<li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li>
<li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914(2020).</li>
<li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li>
<li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387(2019).</li>
<li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177(2014).</li>
<li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+events%2C+one+quantum+dot+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li>
<li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li>
<li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li>
<li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie.+International+Ed.+in+English%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li>
<li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887(2017).</li>
<li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid%2Fsolid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie.+International+Ed.+in+English%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li>
<li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li>
<li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion%3A+small+sample+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103(2015).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li>
<li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001(2018).</li>
<li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li>
<li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978(2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

提示されたプロトコルは細胞膜のAuNRsの動態を研究するために使用される。このプロトコルは、顕微鏡イメージング、データ抽出、動的パラメータ計算、データ分析方法など4つの部分で構成され、各部分は柔軟で普遍的です。したがって、膜上のNP結合膜分子の動き、NP標識受容体のエンドサイトーシスダイナミクス、微小管に沿った細胞内NPおよび小胞被覆NPの動的分析など、将来の応用が可能です。
基本的な手順は、DFM を使用して、細胞膜上の AuNR の動きをイメージすることです。現在、細胞膜動態の解析のための多くのイメージング技術が開発されており、そのうち蛍光顕微鏡は24に広く用いられている。しかし、蛍光プローブの光漂白特性は、長期間にわたり粒子ダイナミクスを追跡できないことにつながります。ここでは、光安定性のプラズモニックAuNRsが使用された。プラズモニックNPs15の散乱特性に基づいて、いくつかのイメージング技術が開発されている。特に、斜め照明モードのDFMは、サンプルから散乱光を集めるだけで、信...

膜上のナノ粒子(NPs)のダイナミクスは、細胞の取り込みプロセスと密接に関連しており、細胞機能、ウイルスまたは細菌感染、および人工ナノ医療デリバリーシステム1,2の開発の理解に不可欠である。単一粒子追跡(SPT)技術は、NP3,4の異種挙動を特徴付けるための堅牢なツールです。一般に、細胞膜は流体であり、タンパク質や脂質などの成分が、形質膜面5、6、7内で横に移動できることを意味する。膜組織と構造の時空間的な複雑さは、NPと膜の相互作用の時空間的不均一性をもたらす可能性がある。したがって、膜上のNPの動きを直接可視化するには、高い空間解像度と時間的解像度の両方が必要です。
数十ナノメートルの空間分解能とミリ秒の時間分解能を有する生細胞における個々の粒子の局在を監視する単一粒子追跡顕微鏡は、NPまたは膜分子ダイナミクス8,9を研究するために十分に開発されている。蛍光ベースの顕微鏡イメージング技術は、生細胞環境9、10、11、12の中でNPs/分子を観察するための貴重なツールとなっています。例えば、全内部反射蛍光顕微鏡検査は、高い時空間分解能を有する基板/溶液界面で試料の薄層(〜100nm)を画像化する、膜分子ダイナミクス13,14の研究において広く用いられている。しかし、低強度や急速な不可逆的な光の漂白のような単一の蛍光ホルの固有の欠点は、トラッキング13の精度と持続時間を低下させる。したがって、蛍光プローブに代わる非蛍光プラズモニックNPは、そのユニークな光学特性15による長期イメージング研究においてますます注目を集めている。プラズモニックNPプローブの散乱信号に基づいて、暗視野顕微鏡(DFM)16、インターフェログメトリック散乱(iSCAT)顕微鏡法17、差動干渉差影顕微鏡(DICM)18などの生物学的プロセスのメカニズムを研究するために、数種類の光学顕微鏡イメージング技術が使用されている。さらに、DFM および DICM 18、19、 20、21、22を使用して、AuNRs のモーションと回転の動きが得られます。典型的には、SPT実験において、対象物の運動は光学顕微鏡によって記録され、次いでSPT分析方法3によって分析される。個々のNPによって生成される時間分解軌道と向きの角度は、通常、確率的で異種的であるため、さまざまな解析方法で豊富な動的情報を提示する必要があります。
ここでは、DFMを用いて細胞膜上のAuNRsのダイナミクスを監視し、ImageJおよびMATLABでAuNRsの位置と向きを抽出し、SPT分析法によるAuNRsの拡散を特徴付ける統合プロトコルを提供します。このデモンストレーションとして、U87 MG細胞膜上の非修飾AuNRs(CTAB-AuNRs、セチルトリメチルアンモニウムアンモニウム臭化アンモニウム分子によって合成された)のダイナミクスを可視化する方法を示す。CTAB-AuNRsは、生物学的環境でタンパク質を吸引し、細胞膜上を移動し、細胞2、20、22に入ることができることが実証されている。U87 MG細胞は中枢神経系の最も一般的で最も悪性の腫瘍であり、その膜受容体は異常に発現する。膜受容体は、AuNRsのタンパク質と相互作用し、AuNRsのダイナミクスに影響を与えます。我々のプロトコルは、一般に生物学の分野で他のSPT実験に適用されます。

<table><tbody><tr><td>CTAB コーティング金ナノロッド(CTAB-AuNRs)</td><td>Nanoseedz</td><td>NR-40-650</td><td>85 nm * 40 nm</td></tr><tr><td>カラー CMOS カメラ</td><td>オリンパス</td><td>DP74</td><td>日本</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Citoglas</td><td>z10212222C</td><td>22*22 mm</td></tr><tr><td>暗視野顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td>正立顕微鏡</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>フィジー</td><td>国立衛生研究所</td><td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td><td>ImageJ</td></tr><tr><td>溝付きガラススライド</td><td>セイル ブランド</td><td>7103</td><td>シングル コンケーブ</td></tr><tr><td>イメージ J</td><td>国立衛生研究所</td><td>1.52 j</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Code</td><td></td><td></td><td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td></tr><tr><td>最小必須培地 (MEM)</td><td>Gibco</td><td>10-010-CVR</td><td>フェノールレッド</td></tr><tr><td>最小必須培地 (MEM)</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td>フェノールレッドなし</td></tr><tr><td>OriginLab</td><td></td><td>Origin Pro 2018C</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック細胞培養皿</td><td>ファルコン</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック細胞培養皿</td><td>ファルコン</td><td>353001</td><td>35 * 10</td></tr><tr><td>mm U87 MG細胞</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>ATCC HTB-14</td><td>ヒト原発性膠芽腫細胞株</td></tr></tbody></table>

単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

細胞膜上のナノ粒子の拡散ダイナミクスを分析することは、細胞取り込みプロセスをよりよく理解する上で重要な役割を果たし、ナノメディシンデリバリーの合理的設計の理論的根拠となる。単一粒子追跡(SPT)解析は、細胞膜上の個々のナノ粒子の位置と向きを調査し、その並進状態と回転状態を明らかにすることができる。ここでは、従来の暗視野顕微鏡を用いて、生細胞膜上の金ナノロッド(AuNRs)のダイナミクスを監視する方法を示す。また、ImageJ と MATLAB を使用して AuNRs の位置と方向を抽出する方法と、AuNRs の拡散状態を特徴付ける方法についても説明します。数百個の粒子の統計解析は、単一のAuNRsがU87 MG細胞膜の表面でブラウン運動を行っていることを示しています。しかし、個々の長い軌道分析は、AuNRsが膜上の動き状態の2つの明確に異なるタイプ、すなわち長距離輸送および限られた領域の閉じ込めを有することを示す。当社のSPT法は、異なる生物学的細胞における表面または細胞内粒子拡散を研究するために使用される可能性があり、複雑な細胞機構の調査のための強力なツールとなり得ます。

プロトコルでは、変更されていない 40 x 85 nm CTAB-AuNRs が使用されました。図2Bに示すように、その縦断プラズモニック最大値は〜650nm(赤色領域)であり、横共鳴は520nm(緑色領域)である。以前の文献では、プラズモニックオーナーの光学特性(LSPR強度など)は、直径20,22で大きく変化することが明らかとなった。図2Cでは、U87細胞膜上のCTAB-AuNRsからの散乱強度は、幅が狭い典型的なガウス分布を示し、ガラス上のCTAB-AuNRsのものと一致していたため、この実験で追跡されたCTAB-AuNRsが十分に単分散していたことを示している。
膜上のCTAB-AuNRsの動態をDFM(12 fps)でモニタリングした。 図7に示すように、500本を超える軌道(軌...

ここでは、従来の暗視野顕微鏡を用いて、細胞膜上の金ナノロッド(AuNRs)のダイナミクスを監視する方法を示す。単一の AuNR の位置と向きは ImageJ および MATLAB を使用して検出され、AuNRs の拡散状態は単一の粒子追跡解析によって特徴付けられる。

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

我々のプロトコルは、単一粒子チェック分析を使用して、ダイナミクスの位置と向きを監視し、細胞膜上の金色ナノロッドの拡散を特徴付けます。この方法を用いて、金色ナノロッドの並進と回転のダイナミクスを両方得ることができ、その動的を総合的に分析して提示することができます。このプロトコルは、他のタイプの複雑な生物学的システムの研究に使用される可能性を有する。まず、エタノールを浸したガラスカバースリップを炎に燃やし、フェノールレッドのない2ミリリットルの細胞培養培地を含む35 x 10ミリメートルの細胞培養皿にカバースリップを入れることから始めます。関心のある細胞懸濁液の50マイクロリットルをカバースリップに加え、皿を前後左右に軽く振って細胞を均等に分配します。CTABコーティングされた金ナノロッドの20マイクロリットルを皿に加える前に、細胞が20〜40%の合流に達するまで約12時間、細胞培養インキュベーターに皿を入れます。皿の向こう側にナノロッドを均等に分散させるために穏やかに揺れた後、5分間加湿した雰囲気の中に皿を置きます。インキュベーションの終わりに、皿から100マイクロリットルの上澄み物をガラススライドの溝にゆっくりと移し、カバースリップセル側をスライド溝の上に慎重に置き、カバースリップの端をマニキュアで密封し、マニキュアを乾燥させてから、暗視野顕微鏡ステージにスライドさせます。暗視野顕微鏡による単一粒子追跡の場合、油の上に油滴を浸しダークフィールドコンデンサーに置き、コンデンサーがガラススライドに接触するまでノブを回します。カバーガラスの上部に油を一滴置き、60倍油浸出目的が油に触れるまで焦点を合わせます。光源をオンにし、焦点を合わせるノブを少し回して、イメージング平面に焦点を合わせます。次に、顕微鏡ソフトウェアのカメラアイコンをクリックして、カラーCMOSカメラを使用してサンプル散乱光画像時系列を記録し、TIFF形式で画像を保存します。1 つの長期軌跡を抽出するには、ImageJ でイメージを開き、画像、タイプ、および 8 ビットをクリックして、RGB モードから 8 ビット モードにイメージを変換します。コントラストを調整するには、画像をクリックし、調整し、明るさのコントラストを調整し、パラメータを設定します。ターゲット パーティクルを選択し、コントロール X を使用して時系列の背景を切り取ります。クリックプラグイン、パーティクルトラッカークラシック、およびパーティクルトラッカーをクリックして、パーティクル検出ウィンドウとパーティクルリンクウィンドウを開き、半径を 6、カットオフを 0.01%に設定し、パーセンタイルを 0.01%に設定し、リンク範囲を 10 に設定し、変位を 10 に設定して[OK]をクリックして、パーティクル トラッカーの結果ウィンドウを開いて結果を確認します。生成された軌道を検査するには、すべての軌道をクリックして視覚化します。ソフトウェアが生成した軌道と金ナノロッドの移動軌道が一致する場合は、[完全なレポートを保存] をクリックして結果を保存します。ソフトウェアによって生成された軌道が金ナノロッドの移動軌道と一致しない場合は、再リンクパーティクルをクリックして、検出されたパーティクルを異なるリンク範囲とパーセンタイルパラメータで再リンクします。XY 座標に従って各フレームの金ナノロッドの中心ピクセル座標を求めるには、xy コーディネーションを使用します。m関数。3 x 3 ピクセルの行列を区切る場合は、赤または緑のチャンネルの 9 つの散乱強度値を抽出し、平均値を計算する場合は、rgextract を使用します。m関数。その後、偏光を使用します。m関数は、デュアルチャネル差動法を用いて極角を計算する。表の数式を使用して動的パラメータを計算するには、2 つの解析スクリプトを実行します。軌道の視覚的な分析では、X 座標を X、Y 座標を Y、時間を Y に設定し、プロット、散布図、およびカラー マップをクリックし、グラフ パラメータを設定し、カラー バーを追加します。平均平方変位時間間隔の数値を生成するには、時間間隔をX、平均二乗変位をY.Clickプロット、散布、解析、継手、非線形曲線の継手、開いたダイアログとグラフパラメータを設定します。複数粒子統計解析の場合、対象の動的パラメータを Y に設定し、プロットとヒストグラムをクリックします。ヒストグラムをダブルクリックして、分割サイズまたは分割数を設定し、[適用] をクリックします。次に、列を追加し、グラフのパラメータを設定します。時系列分析の場合は、時間を X、時系列パラメーターを Y に設定します。ポップアップ ウィンドウで、[行] を選択して [OK] をクリックします。次に、グラフのパラメータを設定します。縦断プラズモニック最大40×85ナノメートルのCTAB被覆金ナノロッドは約650ナノメートル、横共鳴は520ナノメートルです。U87細胞膜上のCTABコーティングされた金ナノロッドの散乱強度は、この実験で追跡されたCTABコーティングされた金ナノロッドが十分に単分散していることを示すガラス上のCTABコーティング金ナノロッドのそれと一致する狭い幅を有する典型的なガウス分布を示す。図示したように、500以上のCTABコーティングされた金ナノロッド軌道は、暗視野顕微鏡で追跡することができ、長距離拡散軌道と閉じ込められた拡散軌道に分けることができる。この代表的な分析では、500本の軌道の旋回半径は、旋回半径0.5マイクロメートルの平均値分布を示し、最大変位は小さな値でより分布していた。このアンサンブル時間平均平均平方変位解析で示されているように、CTABコーティングされた金ナノロッドは通常、およそ1のアルファで拡散する。しかし、すべての軌道から得られる拡散係数とアルファの密度分布は、金ナノロッドのダイナミックさが、スーパーディフュージョン、ブラウン、および沈水運動を伴う異種分布を示すことが明らかである。さらに、単一粒子統計解析と時系列パラメータ解析を使用して、2つの代表的な長期限定軌道と移動軌道を特徴付けることができます。一般的にいくつかの困難なトレードオフがあるので、単一の粒子追跡分析の読み出しからデータの単一の新しい解釈を要約して抽出する必要があります。

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