Name: 解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぶ 高次元フローサイトメトリーによるインプラント組織の免疫細胞解析法。マウス大腿四頭筋から細胞を単離し、免疫応答を評価することで、医療用インプラントの設計改善に貢献します。

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この研究の一部は、国立医用画像・生物工学研究所を含むNIHの学内研究プログラムによって支援されました。 免責事項:NIH、その役員、および従業員は、いかなる会社、製品、またはサービスも推奨または推奨しません。

注: 図1 に、フローサイトメトリープロトコルの概要を示します。
1)試薬調製
<ol><li>酵素を希釈し、組織培養用の培地を調製します。<ol><li>5 mLの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を500 mLのRPMI培地に添加し、よく振とうします。さらに使用するまで、培地を4°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>酵素溶液の体積を計算します。 注:酵素溶液の容量は、6ウェルプレートでさいの目に切った組織を消化するために必要な酵素(コラゲナーゼおよびDNase I)を含む培地の容量です。サンプル数によります。<ol><li>次の式を使用して、必要な体積を計算します。 (消化するサンプル数) × 5 mL の無血清 RPMI と 10 mM HEPES バッファー 注:例えば、0.1〜0.3gの解剖された脾臓の場合、5 mLの培地を使用して酵素溶液を調製します。この原稿に記載されている酵素消化プロトコルは、主に脳、腎臓、皮膚、肝臓、肺、脾臓、筋肉、および合成材料または細胞外マトリックスタンパク質で作られた皮下インプラントの周りのカプセルを含むマウスから解剖された軟組織(0.1〜1 gの範囲)用です。硬い軟骨組織を消化するには、さまざまな条件と消化酵素の量が必要になる場合がありますが、これは最適化によってのみ確認できます。</li>
		<li>酵素溶液に必要なコラゲナーゼとDNaseの量を計算します。 注:このプロトコルでは、0.25 mg/mL のコラゲナーゼと 0.2 mg/mL の DNase I を使用しました。コラゲナーゼとDNaseに必要な使用濃度は、組織の種類によって異なる可能性があります19。</li>
	</ol></li>
	<li>999 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1 μLの生存率色素( 材料表を参照)を加え、溶液をボルテックスして、1:1000の生存率の色素溶液を調製します。さらに使用するまで、溶液を4°Cの暗所で保管してください。</li>
	<li>100 mLのPBSに1gのウシ血清アルブミン(BSA)を加えて染色バッファーを調製し、BSAが完全に溶解するまで溶液をボルテックスします。さらに使用するまで、溶液を4°Cで保存してください。</li>
</ol>2)酵素消化プレートのセットアップ
<ol><li>各ウェルに 70 μm のセルストレーナーを備えた 6 ウェルプレートをセットします。ステップ1.1.1で調製した培地3 mLを各ウェルに加え、氷上でインキュベートします。</li>
	<li>残りの培地(2 mL/ウェル)を37°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに保存し、計算された量のコラゲナーゼとDNase Iを懸濁します(ステップ1.2.2)。</li>
</ol>3)細胞の単離
<ol><li>解剖したインプラント/組織をプレートに入れ、ハサミを使用して細かくさいの目に切ります。あるいは、組織解離装置またはハンドヘルドホモジナイザーを使用した機械的破壊法を利用します。白血球の数が多いため、脾臓を解剖して、各ランで染色コントロールとして利用します。 注:一部の材料はより高いレベルの線維化を誘発するため、このプロトコルは、線維化度の高い材料と線維化の少ない材料の両方に適用できます。ただし、各処理方法は、染色前に消化後の細胞収量と生存率の両方について評価する必要があります。解剖中の末梢血汚染を避けてください。</li>
	<li>コラゲナーゼとDNase I(ステップ1.2.2で計算した容量)を、37°Cに加温した残りのRPMI(2 mL)に加えます。 各ウェルに2 mLの完全酵素溶液を加えます。</li>
	<li>プレートをインキュベートシェーカーに入れ、37°C、100rpmで45分間加熱します。 注意: プレートを積み重ねるときは、適切な熱伝達を妨げる可能性があるため、注意してください。</li>
	<li>その間、1000μLのチップの端から3〜4mmをハサミで切り刻んで、懸濁液分注チップを準備します。インキュベーション後、ウェル内の懸濁液を上下にピペットで移し、みじん切りチップを使用して完全に混合します。セルストレーナーを50 mLのコニカルチューブの上部に置き、消化した溶液をセルストレーナーに通します。 注:70 μmのセルストレーナーは、アルギン酸塩などの移植された生体材料から細胞を分離するのに十分です。より高い純度が必要な場合は、密度勾配分離などのプロセスを使用して、濃縮された白血球集団を取得します。</li>
	<li>ウェルを1x PBS溶液で洗浄し、すすぎ量をストレーナーに移し、続いてチューブ内の容量が50 mLに達するまで1x PBS溶液でストレーナーの洗浄液を追加します。 注:1x PBSは、消化物の粘度の上昇を防ぎ、遠心分離中に細胞をペレット化できるように、室温で使用する必要があります。</li>
	<li>チューブを室温で300× g で5分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱さずに血清ピペットを用いて上清を注意深く吸引します。ペレットを1000 μLの1x PBSに再懸濁し、懸濁液を微量遠心チューブに移します。</li>
	<li>細胞懸濁液10μLとトリパンブルー10μLを混合し、自動セルカウンターで細胞を計数する計数チャンバースライド、または顕微鏡下で従来の方法で計数する血球計算盤に懸濁液をセットします。あるいは、フローサイトメトリー細胞計数ビーズを使用します。</li>
</ol>4) フローサイトメトリーのための染色
<ol><li>図 2 に、45 サンプル、蛍光マイナス 1(FMO)コントロール、補正コントロール、および完全に染色された脾臓サンプルコントロールを使用した 14 色実験のプレートレイアウトの例を参照してください。細胞の総数を推定した後、各サンプルについて×1〜106細胞、および各補償およびFMOコントロールについて0.5×106細胞の染色に必要な細胞懸濁液の量を計算します。必要な容量の細胞懸濁液を V 底 96 ウェルプレートのウェルに分注し、1x PBS で容量を 100 μL にします。 注:例として、ステップ3.6で得られた1000μLの細胞懸濁液が40×10 6細胞を含む場合、1×10 6細胞の場合、1000/40 × 106 = 25μLの細胞懸濁液が必要になります。 </li>
	<li>プレートを300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引した後、細胞をサンプルウェルおよびコンペンセーションコントロールウェルに再懸濁し、100 μLの1:1000の生存率色素溶液で生存率を測定します( 材料表を参照)。</li>
	<li>他のコンペンセーションウェル、FMO、未染色ウェルの細胞については、100 μLの1x PBSで再懸濁します。</li>
	<li>細胞を暗所で4°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>その間に、サンプルとFMOコントロールを染色するための表面抗体カクテル(サンプルあたり50 μLまたはFMO)を調製します。抗体カクテルの一例については、 表1 を参照してください。</li>
	<li>インキュベーション後、1x PBS100 μLを各ウェルに加え、300 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。</li>
	<li>上清を吸引し、200 μLの染色バッファー(1x PBS + 1% BSA)に再懸濁します。300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、50 μL の 1x PBS でコンペンセーションウェル、FMO、および未染色ウェルに細胞を再懸濁します。50 μLの抗体カクテルをそれぞれのサンプルウェルとFMOウェルに加えます。それぞれの抗体を異なる補正ウェルに添加します。</li>
	<li>プレートを暗所で4°Cで45分間インキュベートします。 インキュベーション後、各ウェルに150μLの染色バッファーを加え、細胞懸濁液を300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、200 μLの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>固定せずにサンプルを分析する場合は、200 μLの染色バッファーに再懸濁し、サイトメーターのセットアップとサンプル分析のセクション6に進みます。細胞を固定する場合は、洗浄後に上清を吸引し、4%パラホルムアルデヒドなどの固定液を100μL添加します。細胞内マーカーを染色する場合は、細胞内染色に関するセクション5に進み、細胞を固定して透過処理します( 材料表参照)。細胞を暗所で4°Cで20分間インキュベートします。 注:固定は一部の蛍光色素の蛍光強度に影響を与える可能性があるため、固定の有無にかかわらず各パネルを評価してください。</li>
	<li>インキュベーション後、1x PBSを100 μL添加し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、1x PBSに再懸濁し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー解析の前に4°Cで保存します。</li>
</ol>5)細胞内染色
<ol><li>細胞内マーカーの固定および透過処理のステップ 4.11 に引き続き、適切なバッファーを 100 μL 添加します。細胞を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みを吸引し、ペレットを200μLの固定浸透剤溶液に再懸濁する。細胞を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、適切なバッファーで希釈した細胞内抗体でペレットを再懸濁します。 注:抗体の種類と希釈率は、標的細胞によって異なります。例えば、一般的な細胞内マーカーの1つは、制御性T細胞用のフォークヘッドボックスP3であり、これは希釈倍率1:100で頻繁に使用されます。</li>
	<li>細胞懸濁液を暗所で4°Cで45分間インキュベートします。 インキュベーション後、150 μLの適切な緩衝液を添加し、懸濁液を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁した後、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞を200 μLの染色バッファーに吸引し、再懸濁してフローサイトメトリー解析を行います。</li>
</ol>6) サイトメーターとコンペンセーションのセットアップ
<ol><li>サンプルを泳動する直前に、細胞ベースの補正ではなくビーズベースの補正を利用する場合は、補正ビーズ( 材料表を参照)を調製します。<ol><li>蛍光色素標識抗体ごとに別々の微量遠心チューブを標識し、1x PBS 100 μLに続いて、抗マウスネガティブコントロール補正ビーズを1滴、ポジティブコントロール補償ビーズを1滴ずつ各チューブに加えます。適切な抗体1 μLを別々のチューブにそれぞれ添加します。ボルテックスし、5分間インキュベートしてから取得します。 注:BUV737などの一部の色素はビーズに結合できないため、細胞ベースのコントロールを使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>各実験の前に、トラッキングビーズを使用してサイトメーターのセットアップを実行してフローサイトメーターをキャリブレーションし、各実験のフローサイトメーターの設定を維持します。</li>
	<li>サンプルを分析する前に、未染色のサンプルを実行してフローサイトメーターを調整し、側方散乱(SSC)対前方散乱(FSC)プロットで細胞集団を調整し、細胞集団がプロットの中央に収まり、スケールがずれないようにします。</li>
	<li>染色したサンプルを短時間分析して、FSCとSSCの電圧を調整し、各チャンネルの対数スケールから外れたイベントがないことを確認します。各補正コントロールで 5,000 イベントを記録し、その後、陽性母集団と陰性母集団のゲートが続きます。補正行列を計算してからサンプルを実行し、対象母集団の少なくとも 1,000 個のイベントを収集します。 注:自動補正は過大または過少の補正になりやすいため、大きなカラーパネルでの補正を確認する必要があります。各パラメータを他のすべてのパラメータに対してグラフ化して、過大または過小補正の兆候を監視し、各単色コントロールを評価する必要があります。カラーの大きい実験の複雑な補正は、フローサイトメトリーの経験が豊富な共同研究者またはコア施設の支援を受けて実施する必要があります。スペクトルサイトメーターなどの新しいタイプのフローサイトメーターは、スペクトルアンミキシングと呼ばれるプロセスを通じて蛍光色素のフルスペクトルを利用するため、標準的な補正のみの場合と比較して、蛍光オーバーラップをより明確に区別することができます22。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していません。

このレビューでは、生体材料インプラントから細胞を単離し、均一な細胞懸濁液を得るための詳細な方法論について述べる。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー用の細胞懸濁液を染色するための詳細なプロトコルと、最適な結果を得るためにフローサイトメーターを構成するための手順が提供されています。細胞単離法には複数のステップがあり、多くの場合、手動の組織解剖とそれに続くタンパク質分解酵素による酵素消化を利用して、組織内の細胞外マトリックスを解離し、細胞間接合部を破壊して個々の細胞を組織から遊離させます。消化後、残った破片を除去し、単一細胞懸濁液を確保するために、細胞の濾しなどのさらなる処理が必要です。高レベルの破片または他の細胞型(腫瘍など)を有するいくつかの試料は、密度分離媒体23の使用を通じて、より徹底的なクリーンアップを必要とする場合がある。適切なサンプルクリーンアップを行わないと、破片や他の細胞集団が目的の集団を覆い隠すため、データが歪む可能性があります。また、過剰な破片は、サイトメーター流路系の全体的または部分的な目詰まりにつながる可能性があります。
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医学分野の進歩により、損傷した組織の機能や再成長をサポートするために、埋め込まれた材料が頻繁に使用されるようになりました1,2。これらには、ペースメーカー、再建美容インプラント、骨折固定に使用される整形外科用プレートなどのデバイスが含まれます3,4。しかし、これらのインプラントを製造するために使用される材料とそれらが埋め込まれる場所は、これらのインプラントの成功を決定する上で重要な役割を果たします5,6,7。異物として、これらのインプラントは宿主から免疫応答を引き起こし、拒絶反応または耐性につながる可能性があります8。この要因により、生体材料研究は、移植後に望ましい免疫応答を引き付けることができる材料を生成するように推進されています9,10,11,12。
免疫応答は、損傷した組織または臓器を交換するために実験室で生体材料骨格(足場)の周りに組織または臓器を成長させる再生医療の分野で不可欠な要件です13,14,15,16。再生医療では、細胞、シグナル、足場を使用して欠損または損傷した組織を補うことが目標であり、それぞれが免疫応答によって大きく調節される可能性がある17。さらに、免疫応答の欠如が望まれる場合でも、望まれるのは、調節プロファイルの存在ではなく、免疫活性の欠如であることは非常にまれである18。フローサイトメトリーなどの技術は、インプラントデバイスのコーティングや組織工学のための足場の開発に使用されるさまざまな生体材料に対する免疫応答のパターンを特徴付ける上で重要な役割を果たすことができる19。
この情報は、最終的に、免疫系に十分に耐えられるインプラント用の生体材料の開発や、組織工学において建設的な役割を果たすことができる足場の開発に役立ちます。フローサイトメトリーによる分析用のサンプルを適切に調製することは、蛍光活性化細胞選別による免疫特性評価の不正確な結果を回避するための重要なステップです20,21。したがって、このレビューでは、足場組織からの細胞の単離、細胞懸濁液の染色、およびフローサイトメトリーによる分析に利用できる詳細な方法論を提示します。

<table><tbody><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-000-646</td><td></td></tr><tr><td>BD ブリリアントステインバッファープラス</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>566385</td><td></td></tr><tr><td>BD サイトフィックス</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>554655</td><td>細胞の固定のみ</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A7906</td><td>FACSの調製用染色バッファー</td></tr><tr><td>CD11b AF700</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>クローン:M1/70</td></tr><tr><td>CD11c PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>117325</td><td>クローン:N418</td></tr><tr><td>CD197 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120121</td><td>クローン:4B12</td></tr><tr><td>CD200R3 APC</td><td>Biolegend</td><td>142207</td><td>クローン:Ba13</td></tr><tr><td>CD206 PE</td><td>Biolegend</td><td>141705</td><td>クローン:C068C2</td></tr><tr><td>CD45BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612778</td><td>クローン: 104/A20</td></tr><tr><td>CD86 BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>564199</td><td>クローン: GL1</td></tr><tr><td>CD8a BV421</td><td>Biolegend</td><td>100737</td><td>クローン: 53-6.7</td></tr><tr><td>Comp Bead 抗マウス</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td>補償制御用</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ミリポアシグマ</td><td>11284932001</td><td>ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I)</td></tr><tr><td>F4/80 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123113</td><td>クローン:BM8</td></tr><tr><td>fc Block</td><td>Biolegend</td><td>101301</td><td>クローン:93</td></tr><tr><td>固定・透過化ソリューションキット</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>細胞の固定・透過化に。</td></tr><tr><td>HEPESバッファー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15630080</td><td>細胞培地を補うためのバッファー</td></tr><tr><td>リベラーゼ</td><td>ミリポア シグマ</td><td>5401127001</td><td>精製コラゲナーゼIとコラゲナーゼII</td></tr><tr><td>のブレンド LIVE/DEAD 固定可能なブルーデッドセルステインキット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーL23105</td><td>生存率色素</td></tr><tr><td>Ly6c AF488</td><td>バイオレジェンド</td><td>128015</td><td>クローン:HK1.4</td></tr><tr><td>Ly6g BV510</td><td>バイオレジェンド</td><td>127633</td><td>クローン:1A8</td></tr><tr><td>MHCII BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>742894</td><td>クローン:M5/114.15.2</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Thermo</td><td>Fisher D8537</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875176</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>Siglec F BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>740388</td><td>クローン:E50-2440</td></tr><tr><td>V底 96 ウェルプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

実験室で培養した組織または医療機器を個人に埋め込むことの成功は、レシピエント宿主の免疫応答の影響を受けます。インプラントを異物と見なすと、敵対的で調節不全の免疫応答はインプラントの拒絶反応につながる可能性がありますが、調節された反応とホメオスタシスの回復はインプラントの受容につながる可能性があります。 in vivo または ex vivo 環境で解剖されたインプラントの微小環境を分析することは、免疫応答のパターンを理解するのに役立ち、最終的には新世代の生体材料の開発に役立ちます。フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーに基づいて免疫細胞とそのサブセットを特徴付けるためのよく知られた手法です。このレビューでは、解剖されたインプラント組織から均一な細胞懸濁液を単離するための、手動ダイシング、酵素消化、およびセルストレーナーによるろ過に基づくプロトコルについて説明します。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー染色プロトコルと、フローサイトメトリーによってこれらの単離細胞を特徴付けおよび定量するためのサイトメーターの初期設定の手順について説明しました。

免疫解析用のフローサイトメトリーパネルの開発プロセスでは、多くの場合、既存のデータやその分野の文献との結果との比較に依存しています。フローサイトメトリーで集団がどのように現れるかに関する知識は、データを適切に解釈するために重要です。いずれにせよ、集団や細胞の種類は組織によって異なるように見えるため、ある程度のばらつきが予想されます。明確に定義されたコントロール組織の場合、このような染色の最適化は、十分に研究された細胞型を有する既知の組織に対して評価することができる。 図3 は、コントロールマウス組織に対する14色FACSの結果を示しています。この場合、脾臓は、染色されたすべてのマーカーを識別し、染色が技術的に機能的であることを示すために使用されました。この時点から、未知の条件での試験、蛍光色素の選択に自信を持つこと、さまざまな組織源に対するプロトコルの最適化が容易になりました。 図3 はまた、マウス脾臓から単離された異なる細胞型の集団を示す<sup cl...

解剖されたインプラントからの細胞の単離とフローサイトメトリーによる特性評価は、インプラントに対する免疫応答のパターンの理解に大きく貢献します。この論文では、解剖したインプラントから細胞を単離し、フローサイトメトリー解析のために染色するための正確な方法について説明します。

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

このプロトコルは、さまざまな生体材料に対する宿主の免疫応答を特徴付けるのに役立ち、その後、より良い将来の医療用インプラントの設計に役立ちます。フローサイトメトリーは、生体材料に浸潤した免疫細胞に関する情報を提供し、細胞が損傷や物質の移植にどのように反応するかのメカニズムや、治療を改善するための標的を決定するのに役立ちます。同じプロトコルを変更して、異なる設定での免疫応答を特徴付けることができます。1週間前にECMインプラントを装着し、5ミリリットルの無血清培地を含む50ミリリットルのチューブに採取したマウスの大腿四頭筋を解剖します。最後にハサミでティッシュをさいの目に切った。次に、チューブに5ミリリットルの消化酵素培地を加えます。消化培地とさいの目に切った組織を含むチューブを、摂氏37度、100RPMで45分間振とうインキュベーターに入れます。インキュベーションフィルターの最後に、消化された組織懸濁液を70ミクロンのストレーナーを通して個々の50ミリリットルのチューブに入れます。5ミリリットルのシリンジヘッドを使用して、ティッシュの固い塊を粉砕し、室温のPBSでストレーナーを洗浄します。ストレーナに残っている残留物を廃棄し、室温PBSでチューブの容量を50ミリリットルに調整します。遠心分離により細胞を回収し、PBS中の10ミリリットルの冷たい5ミリモルEDTA溶液にペレットを再懸濁します。サンプル中に血球が存在する場合は、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、10分間インキュベートしてから、9ミリリットルのEDTAを加えます。懸濁液を氷上に10分間放置します。次に、コールドPBSで容量を50ミリリットルに調整します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットと100マイクロリットルの低温PBSを再懸濁します。懸濁液10マイクロリットルを個々のマイクロ遠心チューブに移し、10マイクロリットルのトリップとブルーと混合してカウントします。残りの細胞容量をVボトム96ウェルプレートの各ウェルに分注します。ウェルから20マイクロリットルの細胞を取り出し、それらを新しいウェルに添加して、未染色コントロールとして使用します。次に、PBSを使用して、各ウェルの最終容量を200マイクロリットルにします。遠心分離によりプレートウェルの底部に細胞を回収し、ウェルあたり1〜1000濃度の生存率色素100マイクロリットルに細胞を再懸濁します。インキュベーションの最後に、各ウェルを100マイクロリットルの新鮮なPBSで洗浄し、ウェルあたり200マイクロリットルの染色バッファーにペレットを再懸濁します。2回目の遠心分離後、細胞を1〜100希釈の単球遮断薬50マイクロリットルに再懸濁します。細胞懸濁液を氷上で5分間インキュベートした後、50マイクロリットルの抗体カクテルを加えます。光から保護された氷の上で30分間インキュベートします。次に、ウェルごとに100マイクロリットルの染色バッファーでウェルを洗浄します。細胞を再度遠心分離し、200マイクロリットルの染色バッファーで洗浄します。このプロセスをさらに2回繰り返した後、細胞を400マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁します。サンプルを分析する前に、未染色のサンプルを実行して、側方散乱線プロットと前方散乱線プロットで細胞集団を調整できるようにします。次に、染色したサンプルを実行します。自家蛍光シグネチャーを抽出します。次に、FCS ファイルをインポートして、アンミキシングのコントロールとして使用します。アンミキシングアイコンをクリックすると、アンミキシングウィザードが開き、ポジティブとネガティブのポピュレーションをゲートすることで、すべての単色コントロールを使用してアンミキシングを実行します。次に、QCセクションをクリックして、複雑さのインデックスを確認します。複雑度指数は、スペクトル シグネチャが混ざり合っていない場合に、スペクトル シグネチャのコレクションをどの程度区別できるかを示す尺度です。最後に、ライブアンミックスをクリックしてサンプルをアンミックスします。ここでは、対照マウス組織に関する14色の事実の結果を観察することができます。この解析では、ly6g陽性好中球やly6c中発現および高発現単球クラスなど、いくつかのロビイスト集団が観察されました。CD11c高MHCの2つの陽性樹状細胞は、マクロファージや好中球や単球などの他の骨髄系細胞を除外するためにCD11bに対してゲーティングすると容易に明らかになりました。CD206陽性CD86陽性樹状細胞のサブセットは、CD86高M1様樹状細胞とCD206高M2様樹状細胞集団の両方を含むこのCD11c陽性集団に焦点を当てることによって同定できる。F4/80は、さまざまなマクロファージ集団で一般的に観察されるような発現の勾配を示しました。Siglec-Fは、F4-80陽性集団と陰性集団の両方に存在し、それぞれマクロファージサブセットと好酸球に対応する可能性が最も高い。細胞表面マーカーで染色することで、これらの細胞型の指定を行うことができますが、異なるマーカーを発現する細胞は、より二元的な分類とは対照的に、機能的な方法で見るべきであることに注意することが重要です。このプロトコールを試みる際は、パネルを設計する前に、染色されていないサンプルの自家蛍光シグネチャーを理解することが、より良い混合を実現するための鍵となることを念頭に置いてください。単離された細胞は、細胞の解析に加えて、細胞アッセイによるダウンストリーム評価、in vitro、トランスクリプトーム解析、または細胞形態を評価するための顕微鏡解析のために、特定の集団に分類することができます。生体材料のフローサイトメトリー解析の複雑さが増すことで、免疫学の基礎研究と新しい治療法のエンジニアリングの間のギャップを埋めることができます。

high-dimensionality-flow-cytometry-for-immune-function-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオは、免疫グロブリンG(IgG)でコーティングされた腫瘍細胞を使用して樹状細胞の活性化を評価するためのプロトコルを示しています。樹状細胞は、IgG被覆腫瘍細胞を内在化し、腫瘍抗原を処理し、共刺激分子CD86の共発現とともにMHC-II分子を介して表面に提示します。次に、これらの樹状細胞は、MHC-IIおよびCD86を標的とした免疫染色およびフローサイトメトリー分析を受けて、それらの活性化状態を特定します。...

免疫複合体を用いた樹状細胞活性化のフローサイトメトリー解析

ここでは、主なヒト T 細胞と抗原提示細胞の間の免疫シナプスの定性・定量分析の完全なワークフローをについて説明します。メソッドは、取得および時間の比較的短い期間内に数千の細胞像の評価イメージング cytometry...

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。...

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

ここで、マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓の研究をするこれらの細胞をフローサイトメトリーを排水から単一セルを準備するためのプロトコルを提案する.さらに、このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いた T...

マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓フローサイトメトリーを用いた排水における制御性 T 細胞サブセットの定量

ここでは、CD4 を識別するためにフロー フローサイトメトリーによるプロトコルを提案+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、7 つではなく 2 つだけ螢を用いたひと末梢血単球。このアプローチでは、5 つの追加のマーカーはほとんど流れの cytometers...

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

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腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

ここで説明するのは、免疫蛍光顕微鏡法により5つ以上の蛍光パラメータを画像化するために使用できる方法である。これらの画像から単一細胞を抽出し、フローサイトメトリーのようなゲーティング戦略を通じて単一細胞解析を実施するための解析パイプラインについて概説し、これにより組織切片の細胞サブセットを同定することができます。...

Histoflow Cytometryによるハイパラメーター組織像の生成と解析

このプロトコルは、肝細胞がん(HCC)における全身免疫応答と局所免疫応答の両方を評価するための包括的なマスサイトメトリー(飛行時間型[CyTOF]によるサイトメトリー)分析法の概要を示しています。このアプローチは、HCCの免疫ランドスケープに関する洞察を提供し、腫瘍微小環境と関連する免疫メカニズムをより深く理解することを目的としています。...

肝細胞癌における全身および局所免疫応答のマスサイトメトリー解析

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

学ぶ 高次元フローサイトメトリーによるインプラント組織の免疫細胞解析法。マウス大腿四頭筋から細胞を単離し、免疫応答を評価することで、医療用インプラントの設計改善に貢献します。

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

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