免疫複合体を用いた樹状細胞活性化のフローサイトメトリー解析

化学的に固定された腫瘍細胞懸濁液から始めます。

腫瘍細胞表面抗原に結合し、免疫複合体(IC)を形成する腫瘍結合免疫グロブリンGを最適濃度で添加します。

ICを接着した樹状細胞を含む培養プレートに移します。インキュベート。

樹状細胞はICを認識し、それを内在化し、ペプチドフラグメントに処理します。

フラグメントは、主要な組織適合性複合体クラスIIまたはMHC-II分子にロードされ、共刺激分子CD86とともに細胞表面に提示されます。

メディアを取り外します。細胞解離バッファーを加え、激しくピペットで細胞を切り離します。

細胞をチューブに移します。

細胞を遠心分離し、ブロッキング溶液に再懸濁し、非特異的相互作用をブロックします。

MHC-IIおよびCD86を標的とする蛍光色素標識抗体カクテルと重ね合わせます。

DNA結合色素を加え、短時間インキュベートして死細胞核を染色します。

フローサイトメトリーを使用して、MHC-IIとCD86を共発現する生細胞を特定し、ICを介した樹状細胞の活性化を確認します。

まず、細胞を1.8%緩衝パラホルムアルデヒドに室温で10分間固定します。U字型の96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を播種します。次に、各ウェルにさまざまな希釈液の腫瘍結合抗体を追加します。その後、細胞を氷上で15〜20分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞を150マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、摂氏4度で5〜10分間400回gで遠心分離します。遠心分離後、上清を排出し、細胞を2回洗浄します。蛍光色素結合二次抗体を含む100マイクロリットルのFACSバッファーに細胞を溶解します。次に、プレートを氷上で15〜20分間インキュベートします。

15〜20分後、200マイクロリットルのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄します。プレートを400回gで5〜10分間遠心分離します。上清をデカントします。フローサイトメトリーを実施して腫瘍結合を分析し、細胞をコーティングするために必要な免疫グロブリンGの最小濃度を決定します。

細胞を最小限の免疫グロブリンG濃度でコーティングしたら、CFSE標識腫瘍免疫複合体を単球由来樹状細胞に1:5の比率で添加します。次に、混合物を完全な培地で一晩12〜16時間インキュベートします。単球由来の樹状細胞活性化のFACS解析を行います。