肝細胞癌における全身および局所免疫応答のマスサイトメトリー解析

このプロトコルは、肝細胞がん(HCC)における全身免疫応答と局所免疫応答の両方を評価するための包括的なマスサイトメトリー(飛行時間型[CyTOF]によるサイトメトリー)分析法の概要を示しています。このアプローチは、HCCの免疫ランドスケープに関する洞察を提供し、腫瘍微小環境と関連する免疫メカニズムをより深く理解することを目的としています。

マスサイトメトリーにより、肝細胞癌における系統的免疫応答と局所免疫応答の両方を分析できます。免疫細胞を単一細胞レベルでプロファイリングすることで、腫瘍の進行に関連する固有のサブセットと機能状態を特定し、免疫回避メカニズムと個別化された治療の潜在的な治療標的についての洞察を提供します。私たちのプロトコルは、マスサイトメトリーを使用して、14を超えるマーカーを単一細胞レベルで同時に分析し、従来のフローサイトメトリーで見られるスペクトルの重複を回避します。これには、実際の細胞集団の正確な同定が含まれ、詳細な免疫プロファイリングとバイオマーカーの発見のための高次元データを提供します。

[ナレーター]まず、凍結した末梢血単核細胞と肝癌細胞懸濁液を解凍します。細胞回収後、カルシウムとマグネシウムを含まない1ミリリットルのPBSに細胞を再懸濁します。シスプラチンを最終濃度0.5マイクロモルまで加え、よく混合し、室温で2分間インキュベートします。反応を止めるには、チューブを室温で500Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、各チューブに1ミリリットルの細胞染色バッファーを加えます。再度遠心分離した後、上清を慎重に廃棄します。FC受容体ブロッキングを実行するには、まず、各サンプルに50マイクロリットルのブロックミックスを調製し、48マイクロリットルの細胞染色バッファーと2マイクロリットルのFCブロッキング溶液を混ぜ合わせます。細胞ペレットをブロックミックスに再懸濁し、インキュベートします。次に、サンプルあたり1.1マイクロリットルの各抗体を標識チューブに加え、膜タンパク質抗体ミックスを調製します。細胞染色バッファーで容量を55マイクロリットルにします。調製した抗体混合物50マイクロリットルを各サンプルチューブに移し、総量を100マイクロリットルにします。次に、サンプルを穏やかに旋回させて混合してから、室温で15分間インキュベートします。各サンプルチューブに1ミリリットルの細胞染色バッファーを追加します。室温で500 Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。最終洗浄後、残りの液体を細胞ペレットで短時間渦巻きさせて、細胞を完全に再懸濁させます。核タンパク質染色の場合は、500マイクロリットルの混合固定溶液を再懸濁した細胞に加えます。室温で30分間インキュベートする前に、サンプルを穏やかに混合します。インキュベート後、室温で500 Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。次に、1000マイクロリットルの透過処理バッファーを各チューブにピペットで入れて細胞を洗浄します。次に、チューブを室温で5分間1000 Gで遠心分離します。上清を廃棄した後、50マイクロリットルの抗体混合物を各チューブに加えます。インキュベートする前に、細胞をそっとピペットで完全に混合します。次に、1000マイクロリットルの透過処理バッファーを各チューブにピペットで移し、再度遠心分離してから、上清を廃棄します。細胞を固定するには、PBSで調製した1.6%ホルムアルデヒド1ミリリットルを各サンプルチューブに加え、ボルテックスして内容物を完全に混合します。室温で10分間インキュベートした後、サンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。核インターカレーション染色では、まずCell-ID Intercalator Iridiumを固定バッファーと透過処理バッファーで希釈します。各サンプルに1ミリリットルのインターカレーション溶液をピペットで入れます。やさしく混ぜて渦巻きます。サンプルを摂氏4度で一晩置き、以前と同様に遠心分離します。インキュベーションが完了したら、1000マイクロリットルの細胞染色バッファーをチューブにピペットで入れます。チューブを800 Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。最後に、細胞を450〜900マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁します。細胞をトリパンブルーで染色して細胞を計数してから、さらに分析します。まず、マスサイトメーターの電源を入れ、プログラムを起動します。CyTOFシステムでサンプルを分析し、末梢血単核細胞および肝癌細胞サンプルのマスサイトメトリーデータを取得します。装置でデータ処理ソフトウェアを起動し、FCSファイル内のCD45+細胞集団を前処理します。次に、シスプラチン排除などの生存率染色を使用して死細胞を除去します。CD45+集団をゲートして免疫細胞に焦点を当て、ゲート集団をエクスポートしてさらなる分析を行います。コファクターを 5 でデータを変換します。次に、クラスタリング ソフトウェアを起動し、SPADE アルゴリズムに基づいて主要なクラスターを特定し、類似したマーカー発現プロファイルを持つ細胞をクラスターにグループ化します。階層的確率的近傍埋め込み (HSNE) を適用して、次元削減と個別のクラスターの識別を行います。 次に、ソフトウェアのCyTOFキットパッケージを使用して、主要なクラスターの再クラスタリングを実行します。PhenoGraphプログラムを使用して、デフォルトのパラメータでサブクラスターを識別します。末梢血単核細胞サンプルから合計14種類の異なる細胞型が同定されました。14種類の細胞型のそれぞれのマーカー発現パターンがヒートマップに詳細に記載されており、異なる細胞集団に対する固有の発現プロファイルが示されています。これらの細胞型の分布はサンプル全体で異なり、サンプルDはCD4 T細胞の割合が高く、サンプルAとBはB細胞の有意な濃縮を示し、CD141+は従来の樹状細胞であり、主にサンプルCに存在します。組織サンプルでは、単球、T細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、 B細胞、形質細胞様樹状細胞、好酸球、骨髄性樹状細胞。組織細胞型のマーカー発現プロファイルは、各細胞集団の異なるパターンを示します。組織サンプルは、肝細胞癌と共通の免疫学的特徴を反映して、すべての患者で一貫した割合の細胞型を示しました。