マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

ナノ粒子とバクテリアの内在化の細胞メカニズムをマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーで解析する。マクロファージは、アクチン重合を阻害するために、まずcyto klain Dで前処理されます。ナノ粒子またはサルモネラ菌をマクロファージ、単層に添加し、インキュベートします。

次に、マクロファージを回収し、固定し、画像ストリームを使用して分析するために標識します。ナノ粒子および/またはサルモネラ菌を内在化したマルチスペクトルイメージングフローサイトメーター細胞は、表面結合ナノ粒子および/またはサルモネラ菌を有する細胞と区別されます。得られたデータは、サルモネラ菌とナノ粒子の両方が、サイトクレインで処理されていない細胞によってのみ内在化されることを示しています。

Dは、内在化がアクチン依存性であることを示唆しています。この手法には、フローサイトメトリーや共焦点顕微鏡法などの既存の方法に比べていくつかの利点があります。主に、異なる細胞の特徴間の蛍光シグナル強度と空間分解能を高速で正確に測定します。

この方法は、バイオマテリアルワクチンとドラッグデリバリー研究の両方、および多くの病原体相互作用研究における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これには、ポリ無水物ナノ粒子やバクテリアが利用する内在化経路の描写が含まれます。一般的に、この方法に不慣れな人はしばしば苦労します。

最適な蛍光シグナルを得るためには、色素の滴定に時間を費やすことが重要です。また、ソフトウェアを理解し、分析テンプレートを作成するのにも時間がかかります。この手法のアイデアを思いついたのは、顕微鏡などの手法を用いて、ポリハイドロナノ粒子が病原体模倣特性を示すことを発見したときでした。

次に、アッセイを実行する前に、サルモネラ菌と花粉水素化物ナノ粒子が使用する内部化プロセスを比較するためのハイスループットシステムが必要でした。すべての哺乳類および細菌の細胞培養物を回収し、ナノ粒子懸濁液を調製する必要があります。まず、セルスクレーパーを使用してコンフルエントな RA W2 64.7 細胞を回収します。

ヘモサイトメーターを使用して細胞数を決定します。次いで、細胞を24ウェル培養皿に1ウェルあたり10の5倍密度で0.5ミリリットルで5番目の細胞にプレートする。完全なDMEMを摂氏37度で一晩インキュベートし、5%CO2インキュベーターでインキュベートします。

サルモネラ菌を調製するには、C-D-M-E-Mでサルモネラ菌を希釈して変換し、16 x 125ミリメートルのオートクレーブスクリューキャップガラス培養チューブでRA W2 64.7細胞あたり100の感染の多様性を得る。次に、滅菌したホエイペーパーを使用して、2009年の論文および製薬研究でreanの同僚が1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで説明したように、生成された1%FITCを充填したポリ無水物ナノ粒子の5ミリグラムを秤量します。ナノ粒子を0.5ミリリットルの冷たいリン酸緩衝生理食塩水に加え、氷の上に置きます。

チューブを氷の上に保ちます。マイクロチップ付きの超音波液体プロセッサーを使用して、懸濁液を4〜6ジュールで約25秒間超音波処理します。必要な細胞と試薬がすべて揃ったので、食作用アッセイを行うことができます。

標識24は、アッセイの準備として培養RA W2 64.7細胞を含む組織培養プレートを第1プレートにウェルします。次の各サンプルは、ナノ粒子を使用した細胞と D、サルモネラ菌を使用した細胞と D、ナノ粒子を使用した培地、ナノ粒子を使用した培地、サルモネラ菌ナノ粒子のみを含む培地、サルモネラ菌のみ、および AF 6 60 染色細胞の摂氏 4 度のコントロールでアッセイされ、この低温での培地とナノ粒子、および培地とサルモネラ菌のインキュベーションが含まれます。 誘導の1時間前に食作用などの細胞プロセスを遅くします。1ミリリットルあたり5マイクログラムの細胞とDおよびC-D-M-E-Mを適切なウェルに加え、細胞を摂氏37度でインキュベートします。

インキュベーション後、ナノ粒子懸濁液をボルテックスし、適切なウェルに10マイクロリットルを加えます。次に、サルモネラ菌をボルテックスし、MOI100で適切なウェルに追加します。プレートを数回軽くたたいて混ぜます。

次に、サンプルプレートを摂氏37度に置き、ネガティブコントロールプレートを摂氏4度に45分間置きます。インキュベーション後、プレートを氷の上に置き、古い培地を吸引して廃棄することにより、カルシウムとマグネシウムを含まない氷冷PBSで細胞を2回洗浄し、結合していない粒子、サルモネラ菌、および死んだ細胞または分離した細胞を取り除きます。花びらのマグネシウムの使用。

この段階でのプレPBSは、基質からの細胞の剥離を促進するため、不可欠です 細胞を収穫するには、250マイクロリットルの氷冷PBSを追加し、ウェルを穏やかにこすり落とし、収穫した細胞をシリコン処理されたスナップキャップマイクロ遠心チューブにピペットで移し、氷上に保ちます。1ミリリットルのコールドウォッシュバッファーを加えて細胞を洗浄し、次いでGの250倍で摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を捨てた後、倒立したマイクロ遠心チューブを紙に叩いて残留バッファーを取り除きます。

タオルで、試験管ラックを横切ってマイクロ遠心チューブを静かに掻き集めて、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を固定するには、PBSに100マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加え、細胞を15分間放置します。室温で、1ミリリットルのパーマ洗浄バッファーを加えて細胞を洗浄し、次いで250倍のGで摂氏4度で10分間遠心分離する。

上清を捨てた後、以前と同様に残留バッファーを取り除きます。次にRA W2 64.7細胞を染色する。アクチンの場合は、Alexa Fluora foidを含むパーマ洗浄バッファー100マイクロリットルを6つの60分間15分間追加します。

室温では、未染色のサンプルをパーマでインキュベートし、フィンを含まない洗浄バッファーでインキュベートする必要があります。染色後、細胞を再度洗浄して遠心分離し、1%PFAを含む50マイクロリットルのPBSに再懸濁し、取得するまで摂氏4度の暗所で保存します。電源を入れ、画像ストリームと起動します。

ファイルメニューで流体工学をインスパイアして初期化します。[デフォルトのテンプレートをロードする] を選択します。画像ギャラリーで、表示メニューを選択し、すべてを選択し、必要に応じて実行セットアップを押してビーズのイメージングを開始し、コアトラッキングを調整して画像を横方向の中央に配置します。

明視野チャネルを選択し、[強度の設定]をクリックします。流速変動係数が一貫して 0.2% 未満になるまで待ちますアシストタブで、[すべて開始]をクリックしてキャリブレーションとテストを実行し、ソフトウェアですべてが合格したことを確認します。load sampleをクリックします。

次に、指示されたら、最も明るいサンプルが入ったバイアルを置きます。サンプルローダー内のすべての蛍光色素を使用して、倍率40倍を選択します。装置の設定が確立されたら、実験全体で変更しないでください。

ソフトウェアのレーザーアイコンをクリックして実験の各レーザーをオンにし、各蛍光色素が散布図で測定された104、000カウントの間の最大ピクセル値を持つようにレーザー出力を設定します。不要なオブジェクトの収集を排除するには、ソフトウェアのセル分類器ウィンドウをクリックします。次に、セルデータのみを収集するには、明視野の領域下限チャネル1を選択し、値を50マイクロメートルに設定します。面積が50マイクロメートル未満のオブジェクトは破片と見なされ、取得されません。

ここでソフトウェアの適切なチャンネルアイコンをクリックして、収集するチャンネルを選択します。チャンネル1、2、3、4、5、および6は、セットアップタブで選択されます。ファイル番号と宛先フォルダを入力します。

シーケンス番号を 1 に設定し、取得するイベントの数を 5, 000 に設定します。run, acquire をクリックして、最初の実験データファイルを収集して保存します。「FLL」をクリックし、次の実験サンプルを実行します。

すべての実験サンプルが収集されるまで繰り返します。次に、コントロールを実行するには、[コンプ設定]をクリックします。これにより、明視野レーザーと散乱レーザーがオフになり、取得タブですべての蛍光チャネルを収集できるようになります。

入力値を 500 に変更します。次に、コントロールチューブを配置し、[実行]をクリックします。Acquireは、1つの染色済みコントロールで500個の陽性細胞を採取します。

実験中の各蛍光色素について繰り返して、コンペンセーションマトリックスを作成します。すべてのサンプル画像を取得したら、デスクトップのアイデアアイコンをダブルクリックして、別の分析コンピューターでアイデア分析ソフトウェアを起動します。インターナライゼーションウィザードをダブルクリックし、テストサンプルRIFファイルの1つをロードします。

ポップアップウィンドウに、テストファイルをロードするための手順が表示されます。指示に従って、次へボタンをクリックします。次に、新しいマトリックスをクリックします。

これにより、補正ウィザードが起動します。プロンプトが表示されたら、単色コントロールのデータファイルを選択して追加します。指示に従ってウィザードの[次へ]をクリックし、インターナライゼーションウィザードのステップ2で補正マトリックスファイルが保存され、ボックスにロードされます。

[次へ]をクリックし、DAFファイルが生成されるまで指示に従います。画像の表示プロパティを設定するには、取得中に使用する画像チャンネルを選択します。FITCのチャンネル2とAF six 60のチャンネル5をクリックします。

明視野と側方散乱はデフォルトで選択されています。細胞境界を作成するための明視野チャネルO oneと、単一細胞集団を定義するための内在化プローブのためにナノ粒子または細菌が収集されたチャネルO2を選択すると、すべての細胞の明視野面積対明視野アスペクト比の散布図が生成されます。複数のデータファイルのハイスループット解析にはテンプレートファイルが必要なため、テンプレートファイルを作成する際にはゲートを慎重に定義することが非常に重要です。

各ドットは、個々のセル イメージの値を表します。1 つをクリックします。グラフで、イメージ ギャラリー内の特定のセルのイメージを選択します。

次に、単一セル イベントに対応する面積と縦横比でセルの周囲にゲートを描画します。単一セルのアスペクト比は、丸い 1 とダブレットです。アスペクト比は約 0.5 です。

複数のセルをクリックして、単一のセルを含む領域とダブレットまたは破片を区別します。明視野勾配根のヒストグラムを生成するには、明視野画像の二乗を意味します。「次へ」ボタンをクリックします。

次に、[人口] タブで bin オプションを選択して、選択したビンを表示します。ビンをクリックして、セルと最適な焦点を合わせる場所を決定します。開始し、歩行焦点細胞に線領域を描画します。

グラジエントRMSが高いほど、焦点が合っているため、ゲートする他の汚れがない限り、次のステップをスキップします。x 軸上のチャネル 2 の強度と Y 軸上のチャネル 2 の最大ピクセルの強度の新しい散布図が生成されます。ドットをクリックして画像を表示すると、ナノ粒子やバクテリアに陽性の細胞の周囲に描画する領域を決定するのに役立ちます。

内部化特徴のヒストグラムは、ゼロから始まる領域で生成され、画像を観察することによって調整する必要があります。インターナリゼーションの特徴は、細胞全体の強度に対する細胞内の強度の比率です。これは、値が 0 のときに強度の半分が内側になるようにスケーリングされます。

ウィザードは、使用されるマスクを作成することにより、内部を指定する各セルの領域を作成し、セル画像入力はセル表面を見つけるために、これを4ピクセル侵食しました。このマスクは、必要に応じて、最初に明視野画像上にオブジェクトマスクを作成し、これを多かれ少なかれピクセル単位で侵食することにより、さまざまなセルタイプに対して手動で調整できることに注意してください。内部化機能は、ソフトウェアのアルゴリズムを使用して、この侵食されたオブジェクトマスクに基づいて計算されます。

この機能により、マスク境界内に蛍光シグナルの大部分を持つ内在化された粒子とバクテリアを、この例に示すようにマスク境界の外側に蛍光シグナルの大部分を持つ表面結合粒子とバクテリアと区別することができ、侵食されたオブジェクトマスクに基づく新しい内在化機能を持つ新しいヒストグラムを作成することができます。選択したビン モードで画像を表示して、内在化されたセルにゲートする領域を描画します。ゲートを0.3に設定します。

スコアが0.3未満の細胞は、表面結合粒子陽性細胞と見なされます。バックグラウンドラベリングで細胞を排除し、特定の内在化ナノ粒子または細菌を同定するには、解析メニューから特徴を選択します。分析メニューをクリックします。

次に、横にあるスポットカウント機能をクリックして、平均スポットカウントを統計レポートに追加します。レポートメニューで、レポートアイコンをクリックします。次に、統計レポートを定義し、列を追加して、適切なセル母集団を選択します。

[OK]をクリックします。インターナライゼーションウィザードは、このレポートに統計を自動的に追加し、データファイルをテンプレートファイルとして保存し、すべての実験ファイルのバッチ解析に使用します。ファイルメニューをクリックし、[テンプレートとして保存]を選択します。

テンプレートファイル。アイデアソフトウェアで複数のデータファイルを分析するための拡張子ドットASTがあります。[ツール]をクリックしてバッチデータファイルを選択し、すべてのRIFファイルを入力します。

対応するセクションに補正マトリックスファイルとテンプレートファイルを追加して、バッチを処理用に送信し、[送信]をクリックします。処理ステップの後、すべてのRAFファイルが分析され、個々のRAWファイルごとにDAFファイルが生成されます。サルモネラ菌とナノ粒子の食作用に対するアクチン阻害と低温の影響を比較するために、すべてのサンプルの統計を含む最終レポートが生成されます。

RA W2 64.7細胞を、cyto klain Dの有無にかかわらず、培地中で37°Cでインキュベートするか、または4°Cの培地でインキュベートしました。温度とアクチン操作の両方が、ナノ粒子とサルモネラ菌の両方の内部化を減少させました。しかし、細胞を細胞とDでインキュベートすると、表面結合ナノ粒子を持つ細胞の割合が増加し、表面結合サルモネラ菌を持つ細胞の割合が減少します。

表面結合ナノ粒子に対して陽性の細胞の割合は、細胞およびDまたは摂氏4度での処理後に、摂氏37度で約8%から35%以上に増加する。対照的に、表面結合サルモネラ菌を有する細胞の割合は、細胞およびD処理後、RA W2 64.7細胞を摂氏4度のサルモネラ菌とインキュベートし、摂氏37度の対照と比較して表面結合細菌の量を明らかに増加させることなく、内在化を減少させた。これらのデータを総合すると、サルモネラ菌とナノ粒子は、アクチンを必要とし、温度に依存する同様の細胞プロセスによって内在化されることを示しています。

さらに、データは、サルモネラ菌のマクロファージへの持続的な結合にはアクチン重合が必要であることを示しています。このビデオを見れば、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによってナノ粒子やバクテリアの細胞内在化を解明する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、阻害剤が細胞毒性があることを覚えておくことが重要です。

したがって、使用する最適な濃度を決定するには、事前の細胞毒性プロファイリング実験が必要です。サルモネラ菌の取り扱いは、この手順を実行する際に適切な個人用保護具を着用し、エアロゾルの発生を避けるなど、危険な予防措置である可能性があることを忘れないでください。