Name: マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: 学ぶ マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化解析法。RAW 264.7マクロファージを用いて、アクチン重合依存的な取り込みメカニズムを定量的に評価する手法です。

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<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
<li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+particles+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li>
<li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree L.の友人は、のImageStream Xシステムを製造してAmnis株式会社で採用されています。

研究では、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）または無水物に基づく生分解性ナノ粒子は標的細胞にカプセル化された抗原または薬を届けるために使用することができることが示されている。貪食細胞によるこれらのナノ粒子の取り込みはこのように定量的な作成、その有効性のために重要である。小説ナノ粒子デリバリーシステムを設計する上で重要な内在化の分析は、このメソッドを使用することにより、種々の細胞型によるナノ粒子の差取り込みが容易に分析することができます日付は、従来の顕微鏡とフローサイトメトリーには、粒子の取り込みを定量化するために使用されているが、それぞれを高いスループットと内在化を研究するための代替的なアプローチの解像度の呼び出しでの制限は、この記事では、我々の特徴と食作用の生物学的プロセスは、ターゲット·細菌性病原体と合成ナノ粒子の2種類のどのように異なるかを比較するMIFC分析を実行します。 MIFC phagocytosアッセイは、ナノ粒子に比べサルモネラの取り込みのメカニズムの違いを描くために使用されたされています。これは、阻害剤はそれらのインキュベーショ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> RAW 264.7細胞株</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC） </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td> Cellgro </td><td> 10から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S 11150 </td><td>プレミアムグレード</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>ギブコ</td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td>セルスクレイパー</td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24センチメートル</td></tr><tr><td> サルモネラ血清型Typhimuriumの</td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630エレクトロ細胞マニピュレータ</td><td> BTXハーバード装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td> Cellgro </td><td> 21から040-CV </td><td></td></tr><tr><td>超音波液体プロセッサ</td><td> MISONIX </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシンD </td><td> Sigma-Aldrich社、 </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>ポリサイエン</td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td>洗浄バッファーを</td><td> 2パーセント熱不活性化FBS、PBS中0.1％アジ化ナトリウム。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗浄バッファーを/パーマ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td>スナップキャップのマイクロチューブをクリア表示</td><td>シグマ</td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®ファロイジン660 </td><td>インビトロジェン</td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td>のImageStream X </td><td> Amnisコーパスる</td><td> 100200 </td><td>オプション：658nmレーザー、オートサンプラ</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

ナノシステムでは、抗原提示細胞へのタンパク質、1-5など、効率的に貨物を提供する能力を介してワクチンデリバリーの貴重なツールとして浮上している。抗原提示細胞によるナノ粒子の内在化（NP）がカプセル化された抗原に対する効果的な免疫応答を生成するための重要なステップです。ナノ粒子製剤の影響関数の中でどのように変更を決定するために、我々は内面化ナノ粒子と同様に細菌を検出すると互換性のある高スループット、定量的な実験的なプロトコルを開発しようとした。現在までに、2つの独立した技術、顕微鏡やフローサイトメトリーでは、ナノ粒子の食作用を研究するために使用されるメソッドでした。フローサイトメトリーのハイスループットな性質は堅牢な統計データを生成します。しかし、低解像度のために、それは正確にセル結合したナノ粒子の対内在化、定量化に失敗しました。顕微鏡は、高空間分解能で画像を生成します。However、それは時間がかかり、小さなサンプルサイズの6-8を伴います。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（MIFC）の層コアを介して同時にマルチカラースペクトルの蛍光と明視野イメージングを行う顕微鏡やフローサイトメトリーの両方の側面を組み込んだ新しいテクノロジです。この機能は、蛍光シグナル強度と異なる構造と高速で携帯電話の機能間の空間関係の正確な分析を提供します。 ここで、我々は、無水物ナノ粒子またはサルモネラ血清型Typhimuriumのを内面化した細胞集団を特徴づけるためにMIFCを利用する方法について説明します。我々はまた、ナノ粒子懸濁液、細胞標識、のImageStream Xシステム上で収集やアイデアのアプリケーションを使用してデータの分析の準備について説明します。また、インターナリpを区別するために使用することができる技術の応用を実証するアクチンを介した貪食の阻害剤としてサイトカラシンDを用いてナノ粒子と細菌のathways。

本稿では、RAW 264.7細胞による無水物ナノ粒子や細菌の内在化を定量化するためにマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを利用する方法について説明します。

ナノ粒子システムは、タンパク質を含む貨物を効率的に輸送できる能力により、ワクチンデリバリーにおける有用なツールとして登場しました。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、ナノ粒子および細菌の細胞内取り込みの細胞メカニズムを解析します。まず、アクチン重合を抑制するために、マクロファージをcyto chalasin Dで前処理します。その後、マクロファージ単層にナノ粒子またはsalmonellaを添加し、インキュベートします。その後、マクロファージを回収し、固定して、イメージストリームを用いた解析のためにラベル付けします。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーにより、ナノ粒子および/またはサルモネラを内部に取り込んだ細胞を、ナノ粒子および/またはサルモネラが表面に結合している細胞と区別します。得られたデータは、サルモネラとナノ粒子の両方が、cyto klainで処理されていない細胞にのみ取り込まれることを示しています。Dは、内在化がアクチン依存的であることを示唆しています。この手法は、フローサイトメトリーや共焦点顕微鏡などの既存の手法と比較して、いくつかの利点があります。主に、蛍光信号強度の正確な測定と、異なる細胞構造間の空間分解能を高速で提供できる点にあります。この手法は、バイオマテリアルを用いたワクチンやドラッグデリバリーの研究、および宿主と病原体の相互作用に関する多くの研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これには、ポリアンヒドライドナノ粒子や細菌が利用するインターナリゼーション経路の解明が含まれます。一般的に、この手法を初めて行う方は、習得に苦労することが多いです。最適な蛍光信号を得るためには、染料のタイトレーションに時間をかけることが重要です。また、ソフトウェアに習熟し、解析テンプレートを作成することにも時間を要します。私たちは、顕微鏡観察やその他の手法を用いて、ポリハイドロナノ粒子が病原体模倣特性を示すことを見出した際に、初めてこの手法を考案しました。次に、アッセイを実施する前に、サルモネラ菌と花粉ハイブリッドナノ粒子が用いる内部移行プロセスを比較するためのハイスループットシステムを構築しました。すべての哺乳類および細菌の細胞培養物を回収し、ナノ粒子懸濁液を調製しておく必要があります。まず、セルスクレイパーを用いて、コンフルエントとなった RAW 264.7 細胞を回収することから始めてください。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定します。次に、細胞を24ウェル培養皿に、1ウェルあたり0.5 mLのComplete DMEMを用い、5×10⁵ cells/wellの密度で播種します。37 °C、5% CO2インキュベーター内で一晩培養します。Salmonella taricaを調製するため、16 × 125 mmのオートクレーブ対応ねじ蓋付きガラス培養チューブ内で、RA W2 64.7細胞に対して感染多重度100となるように、C-D-M-

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Zhang, Y., et al.細胞内細菌によるエンドリソソーム系のリモデリング研究への蛍光ナノ粒子の応用J. Vis.

細菌感染細胞におけるエンドリソソームリモデリングのナノ粒子媒介可視化

我々は、コンパクトでコスト効果の高い光流体添付ファイルを使用して携帯電話上の蛍光顕微鏡やイメージングフローサイトメトリーツールの統合、我々の最近の結果を確認します。これらの携帯電話基にしたマイクロ分析装置は、以下のようなリソースが限られた設定で、例えば、水試料のハイスループットスクリーニングのためだけでなく、様々な細胞計数タスクを実行するように、フローサイトメトリー分析のために有用かもしれません。...

携帯電話上の広視野蛍光顕微鏡と蛍光イメージングフローサイトメトリー

この研究では、主な目的はカーボンナノチューブ(CNT)の細胞への取り込みと最終的なエキソサイトーシスを監視することでした。この観点から、ここでは、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを使用して、統計的に関連性のある数の細胞におけるCNTの定量と局在を可能にする独自の方法を提案しました。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる細胞内カーボンナノチューブの局在と相対定量(英語)

フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。...

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。...

細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

この方法は、細菌の食作用と酸化的バーストを同時に測定することにより、顆粒球の機能を評価する技術を示しています。画像ベースのフローサイトメトリーにより、相対的な機能容量が異なる活性化顆粒球の3つの異なるサブセットを同定することができました。...

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術インビトロ

フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3...

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

インビトロマイクロ核アッセイは、ゲノ毒性および細胞毒性を評価するための確立された方法ですが、手動顕微鏡検査を使用してアッセイを採点することは面倒であり、主観性とスコアラー間の変動に苦しんでいます。本論文では、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてアッセイの完全自動化バージョンを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

本稿では、スペクトル集束モジュールとデュアル出力パルスレーザーを統合し、金ナノ粒子と癌細胞の高速ハイパースペクトルイメージングを可能にする方法について説明します。この研究は、標準的なレーザー走査型顕微鏡でマルチモーダル非線形光学技術の詳細を実証することを目的としています。...

マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

このプロトコルは、イメージングフローサイトメトリーを使用して微生物の自己凝集を測定するための定量的アプローチを説明しています。...

微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

本研究では、哺乳類細胞におけるGodanti...

哺乳類細胞におけるGodanti Bhasmaによって引き起こされる食作用の連続的な細胞イベントの探索

学ぶ マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化解析法。RAW 264.7マクロファージを用いて、アクチン重合依存的な取り込みメカニズムを定量的に評価する手法です。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

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