Name: フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ、マルチキューバイオリアクターを用いた動的共培養法。人マクロファージと筋線維芽細胞を用いて、せん断応力と循環伸張を制御し、組織工学血管グラフトの再生能力を評価する手法です。

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この研究は、LSH 2Treatプログラム(436001003)とオランダ腎臓財団(14a2d507)の一環としてZonMwによって財政的に支援されています。N.A.K.は、欧州研究評議会(851960)からの支援を認めています。オランダ科学研究機構(024.003.013)が出資する重力プログラム「物質主導再生」を感謝します。

著者らは開示するものは何もない。

本明細書に記載されたバイオリアクターは、尿細管付動性足場における炎症および組織再生に対する剪断応力および環状ストレッチの個々および結合された影響の系統的評価を可能にする。このアプローチはまた、代表的な結果セクションで例示されるように、血管構造上で行われる多種多様な分析を可能にする。これらの結果は、TEVG構造の成長とリモデリングの両方に異なる血行力負荷レジーム(すなわち、せん断と伸縮の異なる組み合わせ)の顕著な影響を示す。このin vitroプラットフォームを介して収集されたこれらの洞察は、新たに開発されたsitu TEVGs用の足場設計パラメータの最適化を支援します。適切な実験ワークフローを確保するには、このプロトコルの重要なステップと制限を理解することが重要です。
プロトコルの最も重要なステップは、サンプルへのストレッチの適用に関連しています。ストレッチアプリケーションの場合、セットアップがリークフリーである必要があります。システムには2つの弱点があります:エレクトロスパン移植片を圧力導管に取り付ける結び目と、バイオリアクターベースとフロー培養チャンバーとの間の接続。手順 2....

心臓血管組織工学(TE)は、患者1、2、3、4の大コホートに最適でない現在使用されている永久的な心臓血管補修(例えば、血管移植片、心臓弁置換術)に対する代替治療選択肢として追求されている。多くの求められているアプリケーションは、組織工学的に設計された血管移植片(TEVGs)5、6および心臓弁(TEHV)7、8を含む。ほとんどの場合、心臓血管TEの方法論は、新しい組織が形成される有益な足場として機能する再ソーブルバイオマテリアル(天然または合成のいずれか)を利用する。新しい組織の形成は、細胞で足場を播種し、移植前にバイオリアクターで培養することによって完全にインビトロで設計することができる(in vitroTE)9、10、11、または合成足場が体内に新しい組織の形成を直接誘導するために前培養せずに移植されるその中で直接(situ TEにおいて)12,12, 13.in vitroとininin心臓血管TEアプローチの両方について、機能的再生の成功は、移植された構築物に対する宿主免疫応答および適切な生体力学的負荷の両方に主に依存する。
心血管TEのための生体力学的負荷の重要性は、十分に認められている15.心臓血管インプラントの場合、足場に入る細胞は、血行力学的環境の結果として生じる周期的なストレッチおよびせん断ストレスにさらされる。多くの研究は、様々な細胞タイプによる、例えばコラーゲン16、17、18、19、グリコサミノグリカン(GAGs)20、およびエラスチン21、22、などのマトリックス成分の形成に対する(環状)ストレッチの刺激効果を報告している。例えば、Huang et al. は、二軸ストレッチが血管バイオリアクター23を用いてインビトロTEVGsにおけるコラーゲンおよびエラスチンの堆積および組織を上昇させたことを実証した。主な負荷として強調される一方で、これらの研究は、多くの場合、サンプルがせん断流に曝露されるフロー駆動のバイオリアクターを利用しています。シアストレスが3Dの組織形成や炎症に及ぼす孤立した影響については比較的ほとんど知られていないが、いくつかのデータが利用可能である。例えば、ヒンダーらおよびEohら.は、剪断流が、3D足場微細構造に加えて、インビトロモデルシステム24、25におけるヒト血管平滑筋細胞による成熟エラスチンの形成にとって重要であることを実証した。全体として、これらの知見は、心血管TEの環状ストレッチとせん断ストレスの両方の関連性を示している。
TEインプラントの成功または失敗に対するもう一つの重要な決定要因は、移植された移植片26に対する宿主の免疫応答である。これは、細胞流入および内因性組織形成および再モデリング27のその後のプロセスを開始するために足場に対する急性炎症反応に実際に依存する、その中での物質駆動のTE戦略にとって特に重要である。マクロファージは、機能的組織再生の重要なイニシエータであり、複数の研究28、29、30によって示されている。創傷治癒に類似して、組織の再生は、マクロファージと線維芽細胞と筋線維芽細胞31、32、33などの組織産生細胞との間のパラクリンシグナル伝達によって支配される。新しい組織堆積の調整に加えて、マクロファージは、外来足場材料34、35の活性再吸収に関与している。このように、生体材料に対するインビトロマクロファージ応答は、インプラント36、37、38の生体内成功の予測パラメータとして同定されている。
埋め込まれた足場に対するマクロファージ応答は、材料組成および微細構造35、39、40などの足場設計特徴に依存する。足場の特性に加えて、足場に対するマクロファージ応答および筋線維芽細胞とのクロストークも血行力学的負荷の影響を受ける。例えば、環状ストレッチは、マクロファージ表現型41、42、43、44およびサイトカイン43、44、45、46の分泌の重要なモジュレーターであることが示された。マクロファージと血管平滑筋細胞の共培養システムを用いて、Battistonらは、マクロファージの存在がエラスチンおよびGAGのレベルの増加につながり、適度なレベルの環状ストレッチ(1.07-1.10)がコラーゲンIおよびエラスチン47の沈着を刺激することを実証した。これまでの研究では、剪断応力が3Dエレクトロスパン足場48,49への単球採用にとって重要な決定要因であり、剪断応力と環状ストレッチの両方がヒト単球と間葉間質細胞50との間のパラクリンシグナル伝達に影響を及ぼすことを実証した。Fahy et al. は、剪断流がヒト単球51による炎症性サイトカインの分泌を増加することを実証した。
まとめると、上記の証拠は、血行力学的負荷の十分な理解と制御が心血管TEにとって重要であり、これを達成するために炎症反応を考慮することが重要であることを示しています。多数のバイオリアクターが、心血管組織のinvitro 52、53、54、55、56、57、58またはex vivo 59、60、61培養物について以前に説明されている。しかし、これらのシステムはすべて、可能な限り生理学的な血行負荷条件を模倣するように設計されています。これは、体外で心血管組織を作成したり、エキビボ培養を維持する目的で非常に貴重であるが,そのようなシステムは、個々の手がかりの個々の効果に体系的な研究を可能にしません.これは、これらのバイオリアクターにおける環状ストレッチとせん断応力の両方の適用は、本質的にそれらをリンクする同じ加圧流によって駆動されるためです。正確なマルチキュー機械操作を可能にするマイクロシステムは、2D基板62または3Dハイドロゲルセットアップ63、64のために記述されているが、そのようなセットアップは、エラストマー3D生体材料足場の組み込みを可能にしていない。
ここでは、せん断応力と環状ストレッチの分離を独自に可能にし、個々の効果と組み合わせた効果を機械論的に調査するのに役立つ管状バイオリアクターシステムの適用を提示する。このシステムは、多種多様な組織工学的に設計された血管移植片(例えば、合成または天然起源、異なるマイクロアーキテクチャ、様々な多孔質)の試験を可能にする。せん断応力とストレッチの適用を効果的に切り離すために、バイオリアクターが使用する重要な概念は、(1)異なるポンプシステムを使用したせん断応力とストレッチの制御の分離と(2)計算駆動寸法を持つ「インサイドアウト」方式で足場の刺激です。流れは流れポンプの使用によって管状足場の外面に適用され、足場の周伸張は、足場が別のひずみポンプを使用して取り付けられるシリコーン管を拡大することによって誘発される。シリコンチューブと構成体を含むガラス管の寸法は、スキャフォールド(流れによる)と周伸縮(チューブ膨張による)のせん断応力が互いに大きな影響を与えないようにするために、計算流体力学シミュレーションを使用して慎重に選択され、検証されます。この裏返しの設計には、いくつかの実用的な根拠があります。ストレッチが(生理学的負荷に似た)発光流体圧力によって適用される場合、サンプル設計は本質的に漏れのないものでなければなりません。さらに、サンプルの伸張に必要な圧力は、サンプルの剛性によって完全に決定され、サンプル間およびサンプル内で時間の経過とずれによって変化し、ストレッチの制御が困難になります。このバイオリアクターは、シリコーンチューブの周りに組織工学的に設計された移植片を取り付け、移植片の外壁に壁せん断応力(WSS)の適用を可能にし、内部から移植片を加圧する。このようにして、サンプルとサンプル内の間の等しい負荷条件を時間をかけて確保することができ、また、多孔性血管足場19に対して一般的であるように、サンプルが漏れやすい状態が許される。この内部出力バイオリアクターは、従来の血管バイオリアクターのセットアップがより適しているインビトロのネイティブのような血管のエンジニアリングではなく、せん断および/またはストレッチの効果に関する体系的な研究のために特に意図されています。バイオリアクター設計図面の 図1A-B およびそれに対応する 表1 を参照して、バイオリアクターの主要成分の背後にある機能の説明と根拠を確認してください。
バイオリアクターの使用は、我々は、その現場の心血管組織19、43、44における再ソーブルエレクトロスパン足場における炎症および組織形成に関する剪断ストレスおよび環状ストレッチの個々および組み合わせた影響を調査した我々のグループによる一連の最近の研究に基づいて実証される。そのために、ヒトマクロファージと筋線維芽細胞をモノ培養または共培養で使用して、イン・シチュの再生カスケードの様々な相をシミュレートしました。ヒトマクロファージによるサイトカイン分泌は、周期的な伸縮とせん断応力の両方によって明らかに影響を受け、これらの足場におけるヒト筋線維芽細胞によるマトリックス沈着および組織に影響を及ぼすことを実証した。特に、これらの研究は、せん断応力とストレッチの併用の場合、組織形成および炎症への影響が2つの負荷のいずれかによって支配されるか、または両方の負荷の相乗効果があることを明らかにした。これらの知見は、両方の負荷を分離して、TE プロセスにおける機械的環境の寄与をより深く理解する関連性を示している。この理解は、関連する血行負荷のレジームでスキャフォールド設計パラメータを体系的に最適化するために適用できます。さらに、このような十分に制御された環境からの機械化データは、TEV65またはTEHV66に対して最近報告されているように、その場での組織改修の経過を予測するために開発されている数値モデルの入力として役立つ可能性があり、予測能力をさらに向上させる。

<table><tbody><tr><td>高度なダルベッコ 'S modified EagleMedium (aDMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491-015</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>Aqua Stabil</td><td>Julabo</td><td>8940012</td><td>バイオリアクター油圧リザーバー ウ</td></tr><tr><td>シフィブリノーゲン</td><td>Sigma</td><td>F8630</td> で微生物の増殖を防止し、エレクトロスピニング スキャフォールド ウシ トロンビン Sigma T4648 <td>に細胞を播種するためのフィブリノーゲン ゲルを調製</td></tr>します<tr><td></td><td></td><td></td><td>エレクトロスピニング足場上の細胞を播種するためのフィブリノーゲンゲルを調製する</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td>スピンダウン細胞とコンディショニング培地</td></tr><tr><td>クランプはさみ - "ケリー鉗子"</td><td>Almedic</td><td>P-422</td> は<td>、シリコーンチューブをクランプし、足場にプレストレッチを適用するため、足場は刻まれた溝(ステップ1、ステップ7でオートクレーブ)</td></tr><tr><td>CO2細胞培養インキュベータ</td><td>ーSanyo</td><td>細胞培養用MCO-170AIC-PE</td><td></td></tr><tr><td>圧縮空気リザー</td><td>バーFesto</td><td>CRVZS-5</td>は<td>、空気圧の変動を平滑化し、圧力上昇の時間遅延を作成します</td></tr><tr><td>最大ストレッチを計算するためのカスタムMatlabスクリプト</td><td>Matlab</td><td>R2017。Mathworks、Natick、MA</td>は<td>、エレクトロスピニング足場の最小および最大外径を計算します</td></tr><tr>データ収集<td>ボード</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td>アンプシステムとコンピュータ</td></tr><tr><td>の間にデータ処理 エタノール</td><td>VWR</td><td>VWRK4096-9005</td><td>無菌の作業条件を保つために</td></tr><tr><td>胎児ウシウシ血清(FBS)</td><td>グライナー</td><td>758087</td><td>細胞培養培地サプリメント;</td></tr><tr><td>シリコーンチューブに圧力をかけるための刻まれた溝と小さな穴を備えた圧力導管からなる血清サプリメントフロー培養チャンバーコンパートメント、ねじ山、ノーズコーン、フローインレットとボトムコンパートメントフローアウトレットを備えた上部コンパートメント、アダプターブッシング</td><td>カスタムメイド、アイントホーフェン工科大学生物医学工学部</td><td>n.a.flow</td><td>培養チャンバーコンパートメント(ステップ1のオートクレーブ、 ステップ7)</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>アシスタント</td><td>HE40567002</td><td>エレクトロスピニング足場(ステップ1のオートクレーブ)に真空を適用しますフロー</td></tr><tr><td>培養チャンバーのガラス管</td><td>Cuton製、機器&プロトタイプセンター、アイントホーフェン工科大学</td><td>n.a.</td><td>フロー培養チャンバーの一部(ステップ1および7で70%エタノールで洗浄して保存)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>細胞培養培地アミノ酸サプリメントは、アンモニアの蓄積を最小限に抑えます</td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ</td><td>MotionScope</td><td>M-5</td><td>培養中のストレッチを監視するため。足場のタイムラプス写真は、6秒間(すなわち、3ストレッチサイクル)のための30ヘルツの周波数でキャプチャされます高速</td></tr><tr><td>カメラレンズ - Micro-NIKKOR 55ミリメートルf / 2.8 - レンズ</td><td>ニコン</td><td>JAA616AB</td><td>、培養中のストレッチを監視するために;足場のタイムラプス写真は、6秒間(すなわち、3ストレッチサイクル)のための30ヘルツの周波数でキャプチャされますホース</td></tr><tr><td>クリップ</td><td>イビディGmbH</td><td>10821</td><td>ブロック中流(ステップ1でオートクレーブ、 ステップ7)</td></tr><tr><td>8つのフロー培養チャンバー用の8つのネジ山を備えた油圧リザーバーカスタム</td><td>メイド、アイントホーフェン工科大学生物医学工学科</td><td>n.a.</td><td>シリコンに取り付けられた構造に圧力をかける(70%エタノールを含むペーパーティッシュで外側を清掃し、70%エタノールでリザーバーをすすぎ、ステップ1と7でデミ水を使用します)</td></tr><tr><td>イビディポンプシステム(8x)には、イビディポンプ、PumpControlソフトウェア、流体ユニット、灌流セット(ミディアムチューブ)、空気圧チューブ、オレンジ色のシリカビーズ付き乾燥ボトルが含まれます</td><td>ibidi GmbH</td><td>10902</td>は、<td>フロー培養チャンバー内の流れを制御するために使用されます。(注1)イビディポンプは、200mbarの容量を可能にするためにメーカーによって改造されました。注2:同じ流量レジームを適用できる限り、他のメーカーのポンプシステムと交換できます。</td></tr><tr><td>ナイフ(No.10滅菌ブレード、個別ホイルパック)とメスハンドル(ステンレス鋼、個別包装)</td><td>Swann Morton</td><td>0301; 0933</td><td>シリコンチューブを足場に適したサイズに切断し、縫合材料を切断します</td></tr><tr><td>LabVIEW Software</td><td>National Instruments</td><td>version 2018</td><td>足場に適用されるストレッチを制御します</td></tr><tr><td>層流バイオセーフティキャビネット UVライト付き</td><td>Labconco</td><td>302310001</td><td>無菌の作業条件を確保するため。UVは、オートクレーブ滅菌できないもの、またはオートクレーブ後に触れることができないすべてのものを除染するために使用されます</td></tr><tr><td>大小のシャーレ</td><td>グ</td><td>ライナー664-160</td><td>無菌作業条件用</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸2-リン酸(ビタミンC)</td><td>シグマ</td><td>A8960</td><td>細胞培養培地サプリメント、コラーゲン生産に重要</td></tr><tr><td>LEDライトコールドソース KL2500</td><td>ツァイス</td><td>ショットAG</td><td>ストレッチ</td></tr><tr><td>ルアー(女性と男性)のロックとコネクタ、白いルアーキャップ</td><td>イビディGmbH</td>の様々な監視中に足場のタイムラプスの視覚化を支援するために、<td>バイオリアクターとイビディポンプ(ステップ1、ステップ7のオートクレーブ)の一部を閉じるか接続するために</td><td>(https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td></tr><tr><td>を参照してください</td><td>。</td><td>圧力</td><td>センサーからの信号を増幅し、LabView</td></tr><tr><td>ミディアムリザーバー(大型シリンジ60mL)およびリザーバー</td><td>ホルダーibidi GmbH</td><td>10974</td>ミ<td>ディアムリザーバー(ステップ1、ステップ7のオートクレーブ)</td></tr><tr><td>外径4.25mm、内径1mmのミディアムチューブ</td><td>ラバーBV</td><td>1805</td><td>より大きな流量を可能にするために、より大きな直径のIbidiミディアムチューブが使用されます。注:流体ユニットバルブを介してガイドされるミディアムチューブの部分は、デフォルトのibidiミディアムチューブ</td></tr><tr><td>モーションスタジオソフトウェア</td><td>Idtvision</td><td>2.15.00</td><td>と同じで、ストレッチモニタリング用の高速タイムラプス画像を作成します</td></tr><tr><td>ニードル(19G)</td><td>BD Microlance</td><td>301700</td>と<td>、気泡ニードルドライバーを追加せずに油圧リザーバーを超純水で満たすために使用される薄いフレキシブルチューブ</td></tr><tr><td></td><td>シリコーン</td><td>チューブ(ステップ1、ステップ7のオートクレーブ)を介してナイロン縫合糸の針を処理する</td>ためのAdson <td>2429218</td></tr> 70%エタノールパラ<tr><td>フィルム</td><td>シグマ</td><td>P7793-1EA</td>の機器の<td></td></tr><tr><td>洗浄のための</td>紙<td>ティッシュ</td><td>クリネックス</td><td>38044001</td></tr>漏れが発生した場合、<tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)</td><td>ロンザ</td><td>DE17-602E</td><td>細胞培養培地サプリメント;細菌を防止します汚染</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>(保管および洗浄ステップ用)(ステップ1でオートクレーブ)プラスチック</td></tr><tr><td>容器(60mL)、赤いスクリューキャップ付き</td><td>フィブリノーゲン溶液を調製するための</td><td>グライナー</td><td>206202</td></tr><tr>テフロンベローズを作動させる空気圧<td>シリンダーFesto</td><td>AEVC-20-10-I-P</td><td>(ステップ1および7で70%エタノールを含むペーパーティッシュで洗浄)</td><td></td></tr><tr><td>ポリカプロラクトンbisurea(PCL-BU)管状足場(内径3 mm、200 &micro;m壁の厚さ、長さ20 mm)</td><td>SyMO-Chem、アイントホーフェン、オランダ</td><td>n.a.</td>は<td>、15%(w / w)クロロホルム(シグマ;372978)ポリマー溶液からのエレクトロスピニングを使用して製造されました。詳細については、Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) を参照してください</td></tr><tr><td>穴のない圧力導管 (静的制御用)</td><td>カスタムメイド、アイントホーフェン工科大学生物医学工学科</td><td>シリコン</td><td>チューブ (ステップ 1、ステップ 7 のオートクレーブ) にエレクトロスピン チューブを取り付けます圧力</td></tr><tr><td>センサーとトランスデューサ</td><td>BD</td><td>TC-XX および P 10 EZ</td><td>空気圧作動ポンプに送られる空気圧は、設定圧力に達するまで上昇します</td></tr><tr><td>比例空気圧制御バルブと圧力</td><td>センサーFesto</td><td>MPPES-3-1/8-2-010、159596</td>空気圧<td>作動ポンプに圧縮空気を供給し</td></tr>ます <tr><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640 (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>単球/マクロファージ用細胞培養培地</td></tr><tr><td>セーフロック エッペンドルフチューブ (1.5 mL)</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120086</td><td>複数のアプリケーション(ステップ1のオートクレーブ)</td></tr>ドデシル硫酸ナトリウム溶液20%シグマ503000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 <tr><td></td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>シリコーンOリング</td><td>テクニルブ</td><td>1250S</td><td>は、漏れを防ぐため(ステップ1、ステップ7のオートクレーブ)</td></tr><tr><td>シリコーンチューブ(外径2.8mm、壁厚さ400um)</td>圧力<td>コンジット(ステップ1のオートクレーブ)にエレクトロスピンチューブを取り付ける</td><td>ためのゴムBV</td><td>1805</td>(ステップ1のオートクレーブ)</tr><tr><td>滅菌チューブ(15mL)</td><td>ファルコン</td><td>352095</td><td>複数のアプリケーション</td></tr><tr><td>縫合糸、5-0プロレン、テーパーポイント針</td><td>があらかじめ取り付けられているエチコン、ジョンソン&Johnson</td><td>EH7404H</td><td>Prolene 縫合線 5-0 (長さ 75cm、TF テーパー ポイント針、1/2 円、針長 13 mm)</td></tr><tr><td>シリンジ (24 mL)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>2057932</td> 超<td>純水または培地を油圧リザーバーまたはフロー培養チャンバーに追加する</td></tr><tr><td>シリンジ フィルター (0.2 &micro;m)</td><td>Satorius</td><td>17597-K</td><td>フィブリノーゲン溶液をろ過する</td></tr><tr><td>T150 フィルターキャップ付き細胞培養フラスコ</td><td>Nunc</td><td></td><td>178983 脱気培地</td></tr><tr><td>T75 フィルターキャップ付き細胞培養フラスコ</td><td>Nunc</td><td>156499</td><td>静電気制御サンプルを培養する</td></tr><tr><td>テフロンベロー</td><td>カスタムメイド、アイントホーフェン工科大学生物医学工学科</td><td>n.a.</td><td>油圧リザーバーをロードする(ステップ1と7で70%エタノールを含む紙ティッシュで外側を清掃)</td></tr><tr><td>トレイ(ステンレス鋼)</td><td>PolarWare</td><td>15-248</td> 流体<td>培養チャンバーとバイオリアクターをインキュベーターから層流キャビネットへ、そしてその逆に輸送する(使用前と使用後に70%エタノールを含む紙ティッシュで清掃)</td></tr>ピン<tr><td>セット</td><td>Wironit</td><td>4910</td>個々の<td>部品の滅菌処理(ステップ1と7のオートクレーブ)</td></tr><tr><td>超純水</td><td>Stakpure</td><td>Omniapure UV 18200002</td><td>、中程度の蒸発を補正し、アクアスタビビルを混合して油圧作動油として使用します。(ステップ1のオートクレーブ超純水)</td></tr><tr><td>UVライト</td><td>Philips</td><td>TUV 30W / G30 T8</td><td>移植片およびバイオリアクター部品の播種前の除染用</td></tr></tbody></table>

フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

体内で直接再生を誘導する再ソーブルバイオマテリアルの使用は、翻訳の観点から魅力的な戦略です。このような物質は、移植時に炎症反応を誘発し、これは材料のその後の再吸収および新しい組織の再生の原動力である。この戦略は、現場組織工学としても知られており、組織工学的に設計された血管移植片などの心血管置換を得るために追求される。炎症と再生プロセスの両方は、足場上の局所的な生体力学的手がかり(すなわち、ストレッチおよび剪断応力)によって決定される。ここでは、管状足場上のストレッチとせん断応力の分離を独自に可能にするカスタム開発バイオリアクターの使用について詳しく説明する。これにより、よく制御された機械的負荷の影響下での管状足場の炎症および再生能力の体系的かつ標準化された評価が可能となり、ヒトマクロファージおよびミオ線維芽細胞を用いた動的共培養実験に基づいて実証する。このアプローチの主要な実践的なステップ(バイオリアクターの構築とセットアップ、足場と細胞の播種の準備、ストレッチとせん断の流れの適用とメンテナンス、分析用のサンプル採取)について詳しく説明します。

このバイオリアクターは、3D生体材料足場における血管組織の成長とリモデリングに対するせん断応力と環状ストレッチの個々および組み合わせ効果を研究するために開発されました。バイオリアクターの設計により、様々な負荷条件下で最大8個の血管構造を培養することができます(図1A)。血管構築物は、周延伸とWSSの両方を独立して制御できるフロー培養チャンバー(図1B)内に位置付けられている。フロー培養チャンバの上部コンパートメントは、比較的短い定位長で流れを安定化させるフローストレートナーを保持している(図1C)。フローストレートナーの直接下流では、ノーズコーンは環状チャネルを通してフローを均等に分配します(図1D)。プロトコルのすべてのステップが正しい方法で行われると、フロー培養チャンバー内の血管足場は、足場とガラス壁の間の環状チャネルを通る連続的な単方向流を受けることができ、空気圧ポンプによって周方向に伸張される...

このプロトコルの目的は、剪断応力と環状ストレッチの分離を可能にするバイオリアクターを使用して、材料駆動組織再生を調査するために、管状の電気スピン足場でヒトマクロファージと筋線維芽細胞の動的共培養を実行することです。

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

これまで、血行動態と血管組織再生の因果関係を特定することは非常に困難でした。これは、個々の機械的負荷を制御するのが難しいためです。このバイオリアクターにより、さまざまな組織工学的血管移植片の再生能力に対する純粋なストレスと周期的な伸びの個々の影響と複合的な影響を機械的に調査することができます。この手順を実演するのは、私たちのグループの博士課程の候補者であるSuzanne Kochです。そして、当研究室のポスドク研究員であるTamar Wissing博士。エレクトロスピニングスキャフォールドをシリコンチューブに取り付けるには、4-0プロレン縫合糸をシリコンチューブの一方の端に通し、もう一方の端から取り出します。チューブの両側に小さな結び目を作り、両方の結び目に約10センチのワイヤーを残し、2つの結び目の上に3番目の結び目を作ります。縫合針を取り外した後、シリコンチューブの端を三角形にトリミングし、2本の10センチメートルのワイヤーの端に最終的な結び目を作ります。エレクトロスピン足場を30%エタノールに浸し、足場を自由縫合線の一端に置きます。次に、シリコンチューブと10センチメートルの縫合糸の結び目の両側をそっと伸ばし、2番目の研究者は滑らかな内側の先端を備えたピンセットを使用して、エレクトロスピニングスキャフォールドをチューブ上にそっとスライドさせます。シリコンチューブのストレッチをゆっくりと解放すると同時に、ピンセットでエレクトロスピンの足場を滑らかにします。そして、足場とシリコンチューブを超純水に2回浸します。下部コンパートメントを構築し、Oリングが適切に配置されていることを確認します。下部コンパートメントの上部にアダプターブッシングを配置し、下部コンパートメントに穴の開いた圧力コンジットを配置します。漏れを防ぐために、圧力コンジットの下端にシリコンOリングをひもで締めます。そして、下部コンパートメントの下部を下部コンパートメントの上部にねじ込み、圧力コンジットを固定します。圧力コンジットの下部刻印溝が、下部コンパートメントのアダプターブッシングの端から約3〜5ミリメートル上にあることを確認してください。エレクトロスピンスキャフォールド付きのシリコンチューブを圧力コンジットの上に引っ張り、エレクトロスピンスキャフォールドの下端、圧力コンジットの刻まれた溝の位置にうなずき、縫合線を作ります。反対側で2回目のうなずきをして、エレクトロスピニンググラフトでシリコンチューブをしっかりと固定します。そして、シリコンチューブの上端に定規付きのシザークランプを置き、シザークランプを一定に上に引っ張り、電動スポーン足場をそっと引っ張ってシワを取り除きます。縫合線を使用して、圧力コンジットの上部刻まれた溝にある足場の両端に2つの結び目を作ります。両方の結び目ができたら、シザークランプを放し、ナイフを使用して余分なシリコンチューブを取り除きます。動的にロードされるサンプルの圧力コンジットのねじ山にノーズコーンをねじ込みます。圧力コンジット、チューブ、足場を30%エタノールに1回、超純水に2回浸して、セットアップを事前に濡らします。ガラス管を圧力導管の上に置き、下部コンパートメントをそっと押してガラス管を所定の位置に固定します。次に、フローストレートナー、シリコンOリング、およびアダプターブッシングを上部のコンパートメントに配置します。そして、ガラス管の開放端にコンパートメントを固定します。オスのルアープラグをフローアウトレットから取り外し、滅菌された層流キャビネットで作業します。白いルアーキャップを開け、エタノールを染み込ませたティッシュペーパーをフローアウトレットの前に置きます。上部コンパートメントでガラス管を取り外して、フロー培養チャンバーを分解します。真空牧草地パイプをエレクトロスピン足場に追加して、できるだけ多くの媒体を取り除きます。そして、フィブリノーゲン溶液をトロンビン添加細胞懸濁液と1対1の比率で添加します。溶液を1回ピペットで上下させ、すぐに足場の全長にわたって溶液を滴下します。すべての細胞が送達されたら、足場を左から右、上下にゆっくりと動かして、細胞が均等に分布するようにします。足場の両側に播種したら、ガラス管と上部コンパートメントを戻して、フロー培養チャンバーを慎重に再構築します。そして、フロー培養チャンバーをインキュベーターに入れて、繊維を固めます。バイオリアクターをポンプシステムに結合するには、バイオリアクターベースの8つのネジ山のいずれかにフロー培養チャンバーを配置します。そして、ホストクリップをミディアムチューブに取り付けます。フロー培養チャンバーの上部コンパートメントのフローインレットを覆っている白いルアーキャップを取り外し、ミディアムチューブのメスルアーカプラーを取り外します。ミディアムチューブを上部コンパートメントのフローインレットの片側に接続します。そして、下部コンパートメントにフローアウトレットがある反対側。セットアップ全体を層流キャビネットからインキュベーターに移します。そして、流体ユニットとバイオリアクターベースを空気圧チューブと電気ケーブルに接続します。ソフトウェアを起動し、ポンプを初期化します。サンプルの培地フローを1つずつ開始します。次に、ひずみポンプのパラメータを目的の設定に変更し、ひずみを開始します。足場に適用されるストレッチを隔日で監視します。長期の培養期間にわたる伸縮応力と壁せん断応力のモニタリングは、これらの値が最大20日間にわたって比較的一定のレベルに維持できることを示しています。3日間の血行動態負荷の後、免疫蛍光染色により、単球由来のマクロファージと筋線維芽細胞が足場全体に均一に分布していることが明らかになりました。20日間の共培養後、周期的なストレッチにより、より多く、より太い1型コラーゲン繊維が沈着します。一方、血行動態負荷群では、周期的な伸張効果は純粋なストレスによって打ち消され、コラーゲン1型沈着があまり目立たなくなります。マクロファージの単一培養を8日間行った後、すべての血行動態負荷レジームで繊維侵食と繊維切断が観察され、静止群で最も顕著な吸収が観察され、純粋なストレス群で最も顕著な吸収が観察されました。周期的伸張と純粋なストレスの両方が、共培養セットアップのサイトカイン分泌プロファイルに影響を与えます。興味深いことに、両方の荷重の組み合わせ効果は、2つの荷重のうちの1つの優位性または両方の荷重の相乗効果を示しています。共培養実験では、機械的環境とその結果生じる負荷依存性炎症環境が筋線維芽細胞の表現型を調節することも示しています。さらに、収縮マーカーであるα平滑筋アクチンの遺伝子発現パターンは、タンパク質合成と相関しています。このプロトコルを実行する際に最も重要なことは、ストレッチのアプリケーションであり、セットアップが漏れがないことが不可欠です。

a-multi-cue-bioreactor-to-evaluate-inflammatory-regenerative-capacity

Research

JoVE Journal

Engineering

工学

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学ぶ、マルチキューバイオリアクターを用いた動的共培養法。人マクロファージと筋線維芽細胞を用いて、せん断応力と循環伸張を制御し、組織工学血管グラフトの再生能力を評価する手法です。

フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

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