フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

これまで、血行動態と血管組織再生の因果関係を特定することは非常に困難でした。これは、個々の機械的負荷を制御するのが難しいためです。このバイオリアクターにより、さまざまな組織工学的血管移植片の再生能力に対する純粋なストレスと周期的な伸びの個々の影響と複合的な影響を機械的に調査することができます。

この手順を実演するのは、私たちのグループの博士課程の候補者であるSuzanne Kochです。そして、当研究室のポスドク研究員であるTamar Wissing博士。エレクトロスピニングスキャフォールドをシリコンチューブに取り付けるには、4-0プロレン縫合糸をシリコンチューブの一方の端に通し、もう一方の端から取り出します。

チューブの両側に小さな結び目を作り、両方の結び目に約10センチのワイヤーを残し、2つの結び目の上に3番目の結び目を作ります。縫合針を取り外した後、シリコンチューブの端を三角形にトリミングし、2本の10センチメートルのワイヤーの端に最終的な結び目を作ります。エレクトロスピン足場を30%エタノールに浸し、足場を自由縫合線の一端に置きます。

次に、シリコンチューブと10センチメートルの縫合糸の結び目の両側をそっと伸ばし、2番目の研究者は滑らかな内側の先端を備えたピンセットを使用して、エレクトロスピニングスキャフォールドをチューブ上にそっとスライドさせます。シリコンチューブのストレッチをゆっくりと解放すると同時に、ピンセットでエレクトロスピンの足場を滑らかにします。そして、足場とシリコンチューブを超純水に2回浸します。

下部コンパートメントを構築し、Oリングが適切に配置されていることを確認します。下部コンパートメントの上部にアダプターブッシングを配置し、下部コンパートメントに穴の開いた圧力コンジットを配置します。漏れを防ぐために、圧力コンジットの下端にシリコンOリングをひもで締めます。

そして、下部コンパートメントの下部を下部コンパートメントの上部にねじ込み、圧力コンジットを固定します。圧力コンジットの下部刻印溝が、下部コンパートメントのアダプターブッシングの端から約3〜5ミリメートル上にあることを確認してください。エレクトロスピンスキャフォールド付きのシリコンチューブを圧力コンジットの上に引っ張り、エレクトロスピンスキャフォールドの下端、圧力コンジットの刻まれた溝の位置にうなずき、縫合線を作ります。

反対側で2回目のうなずきをして、エレクトロスピニンググラフトでシリコンチューブをしっかりと固定します。そして、シリコンチューブの上端に定規付きのシザークランプを置き、シザークランプを一定に上に引っ張り、電動スポーン足場をそっと引っ張ってシワを取り除きます。縫合線を使用して、圧力コンジットの上部刻まれた溝にある足場の両端に2つの結び目を作ります。

両方の結び目ができたら、シザークランプを放し、ナイフを使用して余分なシリコンチューブを取り除きます。動的にロードされるサンプルの圧力コンジットのねじ山にノーズコーンをねじ込みます。圧力コンジット、チューブ、足場を30%エタノールに1回、超純水に2回浸して、セットアップを事前に濡らします。

ガラス管を圧力導管の上に置き、下部コンパートメントをそっと押してガラス管を所定の位置に固定します。次に、フローストレートナー、シリコンOリング、およびアダプターブッシングを上部のコンパートメントに配置します。そして、ガラス管の開放端にコンパートメントを固定します。

オスのルアープラグをフローアウトレットから取り外し、滅菌された層流キャビネットで作業します。白いルアーキャップを開け、エタノールを染み込ませたティッシュペーパーをフローアウトレットの前に置きます。上部コンパートメントでガラス管を取り外して、フロー培養チャンバーを分解します。

真空牧草地パイプをエレクトロスピン足場に追加して、できるだけ多くの媒体を取り除きます。そして、フィブリノーゲン溶液をトロンビン添加細胞懸濁液と1対1の比率で添加します。溶液を1回ピペットで上下させ、すぐに足場の全長にわたって溶液を滴下します。

すべての細胞が送達されたら、足場を左から右、上下にゆっくりと動かして、細胞が均等に分布するようにします。足場の両側に播種したら、ガラス管と上部コンパートメントを戻して、フロー培養チャンバーを慎重に再構築します。そして、フロー培養チャンバーをインキュベーターに入れて、繊維を固めます。

バイオリアクターをポンプシステムに結合するには、バイオリアクターベースの8つのネジ山のいずれかにフロー培養チャンバーを配置します。そして、ホストクリップをミディアムチューブに取り付けます。フロー培養チャンバーの上部コンパートメントのフローインレットを覆っている白いルアーキャップを取り外し、ミディアムチューブのメスルアーカプラーを取り外します。

ミディアムチューブを上部コンパートメントのフローインレットの片側に接続します。そして、下部コンパートメントにフローアウトレットがある反対側。セットアップ全体を層流キャビネットからインキュベーターに移します。

そして、流体ユニットとバイオリアクターベースを空気圧チューブと電気ケーブルに接続します。ソフトウェアを起動し、ポンプを初期化します。サンプルの培地フローを1つずつ開始します。

次に、ひずみポンプのパラメータを目的の設定に変更し、ひずみを開始します。足場に適用されるストレッチを隔日で監視します。長期の培養期間にわたる伸縮応力と壁せん断応力のモニタリングは、これらの値が最大20日間にわたって比較的一定のレベルに維持できることを示しています。

3日間の血行動態負荷の後、免疫蛍光染色により、単球由来のマクロファージと筋線維芽細胞が足場全体に均一に分布していることが明らかになりました。20日間の共培養後、周期的なストレッチにより、より多く、より太い1型コラーゲン繊維が沈着します。一方、血行動態負荷群では、周期的な伸張効果は純粋なストレスによって打ち消され、コラーゲン1型沈着があまり目立たなくなります。

マクロファージの単一培養を8日間行った後、すべての血行動態負荷レジームで繊維侵食と繊維切断が観察され、静止群で最も顕著な吸収が観察され、純粋なストレス群で最も顕著な吸収が観察されました。周期的伸張と純粋なストレスの両方が、共培養セットアップのサイトカイン分泌プロファイルに影響を与えます。興味深いことに、両方の荷重の組み合わせ効果は、2つの荷重のうちの1つの優位性または両方の荷重の相乗効果を示しています。

共培養実験では、機械的環境とその結果生じる負荷依存性炎症環境が筋線維芽細胞の表現型を調節することも示しています。さらに、収縮マーカーであるα平滑筋アクチンの遺伝子発現パターンは、タンパク質合成と相関しています。このプロトコルを実行する際に最も重要なことは、ストレッチのアプリケーションであり、セットアップが漏れがないことが不可欠です。