デジタル高速毛様体ビデオ顕微鏡を使用した鼻ブラッシングサンプリングと処理–COVID-19パンデミックへの適応
2020年11月7日
PCD診断のための高品質毛様体機能解析を成功させるには、呼吸上皮のサンプリングと処理のための正確で慎重な方法が不可欠です。COVID-19パンデミックの間もPCD診断サービスを提供し続けるために、毛様体ビデオ顕微鏡プロトコルが更新され、適切な感染管理対策が追加されました。
正式な操作手順書や標準化が公表されていないため、デジタル高速ビデオ顕微鏡検査は、原発性毛様体ジスキネジアの確認診断検査として考えられません。さらに、このCOVID-19危機の間、診断サービスを提供し続けるために、毛様体ビデオ顕微鏡プロトコルは、適切な感染制御対策を含むように適応されていました。デジタル高速ビデオ顕微鏡を用いた毛様体機能評価は、原発性毛様体ジスキネジアの診断に対して高感度かつ特異的です。
他の一次毛様体ジスキネジア診断検査と比較して、デジタル高速ビデオ顕微鏡検査は比較的簡単に実行でき、安価で、結果はその日のうちに得られる場合があります。デジタル高速ビデオ顕微鏡は、一次毛様体ジスキネジアの診断に対してより高い感度と特異性を持っています。現在、原発性毛様体ジスキネジアの確認検査として認められているのは電子顕微鏡検査と遺伝子検査のみですが、これらの検査では、患者の15〜30%で原発性毛様体ジスキネジアの診断が見落とされます。
鼻ブラッシングの手順を実演するのは、私の研究室の耳鼻咽喉科研修医であるライオネル・ベンチモールです。鼻サンプルを採取する前に、患者に鼻をかんでもらってください。鼻腔をきれいにした後、患者に横になるか、頭を後ろに乗せて快適に座ってもらいます。
サプリメントのミディアム199でブラシを振って湿らせ、鼻の入り口に内視鏡を当てて下鼻甲介を視覚化します。細胞診ブラシを鼻に挿入し、ブラシを下鼻甲介の後部で前後に数回動かしてから抜く。ブラシをM199のチューブに入れます。
ワイヤーをチューブ内に完全に収まるように切断し、すぐにチューブを閉じます。次に、サンプルを気密性の高いダブルバッグに入れます。サンプル収集から9時間以内に、微生物学的安全キャビネット内のサンプルチューブを開き、Weil-Blakesley鼻鉗子を使用してブラシを攪拌し、収集した上皮ストリップ
を取り除きます。両面スペーサーをスライドガラスに貼り付け、スペーサーから保護を取り外します。チューブを静かに振って繊毛がチューブ全体に広がるようにし、ピペットを使用してチューブの中央から約60マイクロリットルの繊毛上皮をスペーサーに移します。.22 x 4 mm の長方形のカバースリップをスペーサーにセットしてチャンバーを閉じ、スライドを 70% エタノールで消毒してから、微生物安全キャビネットから取り出します。
手袋を交換した後、このスライドを加熱したボックスのプレートに置き、蓋を閉めます。油浸対物レンズに油を加え、ボックスを直立型または倒立型光学顕微鏡のステージに置きます。ボックスとレンズヒーターの電源を入れ、ボックスとレンズヒーターコントローラーの温度設定を調整します。
5分後、レンズの先端でカバースリップにちょうど触れるまで対物レンズを配置します。サンプルの呼吸繊毛エッジを視覚化するには、カメラソフトウェアを開き、顕微鏡対物レンズを使用してサンプル内の細胞を手動で特定し、細胞をモニターに投影します。モニターに画像が表示されていることを確認し、必要に応じてコンデンサーとレンズのピントを調整して、画像の品質を向上させます。
繊毛上皮のストリップが見つかったら、長さが少なくとも50ミクロンの無傷で中断されていない繊毛上皮エッジのみを選択します。毛様体機能解析には、正常なエッジまたはマイナーな突起のあるエッジのみを使用し、主要な突起のある繊毛エッジと単離された繊毛細胞、または他の細胞タイプとの間に接触がない単一細胞を除外してください。良好なエッジを選択したら、毎秒500フレームのカメラフレームレートを使用して、鼓動する繊毛エッジを約2秒間記録します。
側面図で少なくとも6つの良好なエッジを記録した後、加熱されたボックスからスライドを取り出し、スライド、カバースリップ、スペーサーを密閉バッグに入れます。次に、手袋とマスクをバッグに入れ、バッグを適切な有害医療廃棄物容器に入れます。毛様体心拍周波数を分析するには、適切なビデオ分析ソフトウェアプログラムで録画を開き、繊毛エッジを約5つの隣接する約10ミクロンの領域に分割します。
フレーム レートを下げ、領域ごとに最大 2 つの毛様体心拍周波数測定値で繊毛または繊毛のグループを特定して視覚化し、エッジごとに最大 10 の毛様体心拍周波数測定値を取得します。繊毛のグループが5つの拍動サイクルを完了するのに必要なフレーム数を記録し、式を使用して毛様体心拍周波数を計算します。サンプル内の各異なる毛様体心拍パターンの割合を決定するには、各繊毛または繊毛のグループについて、全拍動サイクル中に繊毛がたどる正確な経路を、デジタル高速ビデオ顕微鏡分析で観察された正常な毛様体心拍パターンと比較します。
分析された各繊毛または繊毛のグループに対して、正常、硬直、不動、非同期または運動障害、循環などの明確な毛様体拍動パターンを帰属させます。次に、各サンプル内の各異なる毛様体拍パターンの割合を計算します。サンプルに起因する毛様体心拍パターンは、観察された主要な毛様体心拍パターンです。
ここでは、14人の成人ボランティアの鼻ブラッシングサンプルから詳細な毛様体機能分析結果を観察します。これらの 14 の鼻ブラッシング サンプルから、242 の繊毛縁が記録され、212 が分析の定義された選択基準を満たしました。分析された繊毛または繊毛のグループから、合計807の毛様体心拍周波数測定と毛様体心拍パターンの評価が得られました。
平均運動性指数は、健康なボランティアで以前に報告された値と同様でした。ジスキネジアスコアと毛様体拍動の頻度は、正常なエッジのみまたはマイナーな投影を持つエッジを選択した場合に得られた以前に報告された値と同様でした。低品質のエッジを使用すると、毛様体心拍の頻度が低くなり、ジスキネジアスコアが高くなると報告されます。
強すぎるブラッシングから得られた血球や粘液は、自由な繊毛の鼓動をブロックしたり、観察者から繊毛を隠したりする可能性があります。逆に、ブラシが下鼻甲介にしっかりと押し付けられない場合、サンプルには高品質の繊毛上皮ストリップが十分に含まれていない可能性があります。また、鼻腔の前部に鼻ブラッシングを行うと、移行性の非繊毛上皮細胞のみが得られます。
このプロトコルの最も重要な2つの側面は、鼻ブラッシングの質と、完全な陽性結果や技術の失敗を避けるための高品質の上皮断片の選択です。
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概要
この記事では、一次性繊毛運動障害（PCD）の診断における高品質の繊毛機能分析のための精密な呼吸器上皮サンプリングと処理の重要性について議論しています。COVID-19パンデミック中に繊毛ビデオ顕微鏡検査プロトコルに行われた適応により、継続的な診断サービスを確保していることを強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 呼吸器内科学
- 診断技術
背景
- デジタル高速ビデオ顕微鏡検査は、PCDを診断するための感度が高く特異性の高い方法です。
- 現在のPCDの確定診断検査には、電子顕微鏡検査と遺伝子検査が含まれます。
- これらの確定診断検査では、患者の15〜30%でPCDの診断が見逃される可能性があります。
- デジタル高速ビデオ顕微鏡検査の操作手順の標準化が不足しています。
研究の目的
- 一次性繊毛運動障害の診断精度を向上させる。
- COVID-19パンデミック中に安全を確保するためのプロトコルを適応させる。
- 診断ツールとしてのデジタル高速ビデオ顕微鏡検査の使用を推進する。
使用された方法
- 繊毛機能評価のための高速ビデオ顕微鏡検査。
- プロトコルへの感染管理措置の実施。
- デジタル高速ビデオ顕微鏡検査と他の診断検査の比較。
- PCD診断における感度と特異性の評価。
主な結果
- デジタル高速ビデオ顕微鏡検査は、PCD診断の感度と特異性が高いことを示しています。
- 結果は1日以内に得られ、実用的な診断オプションとなっています。
- パンデミック中に行われた適応により、継続的な診断サービスが可能になっています。
- この方法を確定診断検査としてより広く受け入れるためには、標準化が必要です。
結論
- デジタル高速ビデオ顕微鏡検査は、一次性繊毛運動障害を診断するための貴重なツールです。
- パンデミック中の安全な診断実践には、感染管理措置が不可欠です。
- 診断の信頼性を高めるために、手順のさらなる標準化が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized digital high-speed ciliary videomicroscopy enables precise functional analysis of respiratory cilia, directly impacting target validation and diagnostic confidence in rare motile ciliopathies. The protocol's adaptation for infection control ensures continuity of critical diagnostic workflows during pandemic disruptions, supporting robust translational research and portfolio risk management. Reliable ciliary beat frequency and pattern quantification underpin mechanistic de-risking and inform go/no-go decisions in respiratory disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of ciliary function for mechanistic target validation in respiratory disorders.
- Supports biological de-risking by distinguishing normal from dyskinetic ciliary phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in disease modeling and early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible measurement of ciliary beat frequency and pattern for assay development.
- Ensures sample quality criteria are met, improving assay reliability and downstream screening readiness.
- Delivers rapid, same-day quantitative outputs to accelerate compound evaluation cycles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional ciliary analysis with disease-relevant endpoints for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent phenotypic readouts.
- Reduces risk of false negatives in rare disease cohorts, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative ciliary function data for respiratory disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification through direct measurement of ciliary motion.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative endpoints for assay standardization and compound triage.
- Analytics: Enables statistical comparison of ciliary beat frequency and pattern across experimental conditions.
- Translational Research: Connects functional ciliary metrics to disease-relevant phenotypes for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, standardized workflow for respiratory epithelial sampling and analysis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in respiratory disease research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible ciliary function analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of respiratory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory epithelial sampling and high-speed videomicroscopy operation.
- Demands access to specialized imaging equipment and video analysis software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample quality and analysis criteria.
- Must adapt infection control protocols for safe sample handling, especially during pandemics.
- Dependent on high-quality epithelial strips; suboptimal samples reduce diagnostic reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:41
Respiratory Ciliated Epithelium Sample Collection
2:35
Respiratory Ciliated Epithelium Processing and Preparation
3:55
Respiratory Ciliated Edge Selection and Recording
5:18
Ciliated Edge Analysis
6:59
Results: Representative Nasal Brush Processing Analysis
8:34
Conclusion
