MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

MALDIイメージング質量分析は、メタボロミクスの分野におけるユニークな進歩であり、生物、生理学的および病理学的状態を示す相対的な代謝物の存在量と分布を測定し、視覚化することを可能にします。MALDIイメージングの主な利点は、標識を必要とせずにC2中の代謝物を検出できることです。手順を実演するのは、パトリシア・カシータ博士の研究室の大学院生であるサミ・サウマです。

Yuki Chen と Kelly Veerasammy は、私の研究室の学生研究者です。収穫後、すぐに組織を液体窒素、冷却、アルミホイルボート、ポリスチレンボックスに入れました。ポリスチレンボックスの蓋を囲んで、ティッシュのサイズに応じてティッシュを2〜10分間凍結します。

組織が十分に凍結したら、鉗子を使用してボートを取り外し、ドライアイス上のホイル内に固定された組織をクライオスタットに輸送します。組織を切片にする前に、スライドで呼吸しないように注意してください。手袋と抵抗値に設定された電圧計を使用して、分析に適した数のMALDI適合酸化インジウムスズコーティングガラススライドの導電率をテストします。

ラベルを貼った後、スライドを清潔なペーパータオルの上に置き、70%エタノールで洗浄したクライオスタットを摂氏マイナス20度に設定します。組織サンプルをクライオスタットに入れ、組織の種類に応じてクライオスタットチャンバーと試料ヘッドの温度を設定します。組織を30分間平衡化させた後、クライオ組織包埋コンパウンドを使用して組織をチャックにマウントします。

また、きれいなブレードをステージに配置してロックし、ステージの位置と試料の角度を調整して、目的の切断角度を実現します。そして、関心領域が明らかになるまで組織を切片にします。目的の領域に到達したら、予冷したブラシを使用して10〜12ミクロンの厚さのセクションを取得し、各セクションを取得したときに各スライドのラベル付き側に慎重に、しかし迅速に収集します。

スライドの下に指を置いてセクションを温め、スライドにしっかりと取り付けられるようにします。セクションは5〜10秒で透明になり、約30〜60秒後に不透明になります。すべての切片が集まったら、スライドをスライドホルダーに入れ、ドライアイスをデセクレーターに運びます。

また、スライドを真空ボックスに入れて持ち運ぶこともできます。スライドを乾燥剤入りの冒涜器に入れ、スライドを45〜60分間真空乾燥させます。乾燥後、すぐに使用しない場合は、スライドをスライドトランスポーターに入れ、トランスポーターに窒素を充填します。

ホルダーをパラフィルムで密封し、ホルダーをジッパーバッグに入れます。次に、最初のジップバッグを、マイナス80°Cの乾燥剤が入った2番目のラベル付きジップバッグに入れ、最大6か月間保管します。脱水後、太字のポイントシルバーマーカーを使用して、組織切片の外側のスライドの空白スペースにXマークを配置し、黒の細いポイントマーカーを使用して、各シルバーXの上に2番目の黒いXを配置します。

プラスチックカバー上のサンプル位置の輪郭を描き、スライドとMALDIターゲットをフラットベッドスキャナーの表面に置きます。次に、スライドをプレビューし、目的の領域を選択します。スライドを16ビットグレースケールで、2、400ドット/インチでスキャンし、後で使用するために画像を保存します。

スライドにマトリックスを適用するには、自動マトリックス噴霧器ユニットをオンにし、バルブが負荷に配置されていることを確認してから、噴霧器ソフトウェアを起動します。排気ファンが正しく動作していることを確認し、[通信]タブでシステムが正しく通信していることを確認します。溶剤ポンプを毎分100マイクロリットルで始動し、背圧は1平方インチあたり約500ポンドです。

そして、窒素タンクを30ポンド/平方インチに設定して、マトリックス噴霧器への圧縮空気の流れを開始します。噴霧器の前面にある圧力調整器を10ポンド/平方インチに調整し、必要に応じて噴霧器のノズル温度を設定します。バルブと負荷位置を使用して、シリンジを使用してループを70%メタノールの7ミリリットルで洗い流してから、ループに6ミリリットルのマトリックスを充填します。

ホルダーと噴霧器に空白のスライドガラスを置き、両端をテープで留めて動かないようにし、流量と温度が安定していることを確認します。スタートを押してノズル温度を設定し、選択した方法に合わせてポンプの流量を調整します。バルブを負荷からスプレーに切り替え、[続行]をクリックします。

システムの実行が完了した。堆積が終了したら、バルブをスプレーからロードに切り替えて、[続行]をクリックします。顕微鏡下でマトリックスコーディングのパターンを調べます。

微細なマトリックス結晶の均一な層が観察された場合は、示したように、適切なサンプルスライドにマトリックスを堆積させます。すべてのスライドを処理したら、噴霧器ノズルの目詰まりを防ぐために、製造元の指示に従ってシステムを清掃します。ここでは、100ダルトン間隔ごとに選択された質量放電スペクトルのMALDI MS Imagingデータ解析からの出力画像を示しており、低分子代謝物から高分子量脂質までのスペクトルの同定に対する有用性を明確に示しています。

各道路は、出生後1日目、21日目、および60日目に収集された3つの組織にわたる特定の代謝物種の空間情報とスペクトル情報の両方を含む、それぞれにイオンヒートマップを示しています。MALDI MSI方法論の強みは、発生マイルストーンまたは特定の解剖学的構造に対する質量電荷比によって特定された特定の種の特異性を識別する能力です。この分析では、一部の代謝産物は、出生後1日目の新生児または出生後60歳の成人で濃縮されていること、または試験された年齢全体に均一に分布していることが観察されました。

他の分子種は、灰白質、白質、または脳脊髄液と脳室に特異的に豊富であることが観察されました。ヒポキサンチン、グルタミン酸、N-アセチルアスパラギン酸、アラキドン酸、およびいくつかの脂質を含む代表的な代謝産物の空間分布も分析しました。代謝スタタの忠実度を維持するためには、適切なサンプル解剖、保存、およびサイロ切片化が人工代謝変化を防ぐために重要です。

MALDI実験を行った後、見つけた代謝物の同一性を確認したい場合があります。これは、mirco抽出と液体クロマトグラフィーのタンデムMSによって達成できます。MALDI MS Imagingは、メタボロミクスに基づく空間分解能による調査を容易にし、研究者が定量的および視覚的媒体で代謝データを確認する機会を提供します。最近、神経変性疾患における食事の影響、腸内細菌叢と脳の関係に多くの関心が寄せられています。

ですから、神経発生から神経変性まで、神経科学における代謝の研究は非常に重要です。腸と脳の相互作用の主な事実。そして、この文脈の中で、MALDIイメージング施設のアイデアは、特定の操作が脳に及ぼす可能性のある影響を視覚化するための優れた技術を実際に提供することができます。