Name: 新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶSpotitonロボットシステムを用いた時間分解クライオ電子顕微鏡法。90ミリ秒でタンパク質を混合・ガラス化し、ナノワイヤーグリッド上の過渡的分子状態を捉え、細菌遺伝子発現の初期中間体などサブ秒スケールの生物学的プロセスを高解像度で解析する革新的手法です。

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エンジニアリング・アーツLLC(米国アリゾナ州)のピーター・A・カーンとテリー・ローデの初期設計とその後のSpotitonシステムの開発に感謝します。ニューヨーク構造生物学センターのサイモンズ電子顕微鏡センターのスタッフに、助けと技術サポートを感謝します。ここで発表された研究は、NIH(GM103310)とサイモンズ財団(SF349247)からの助成金によって支えられ、ニューヨーク構造生物学センターにある国立分子顕微鏡研究リソースで行われました。

1. Spotiton マシンとソフトウェアをセットアップする
<ol><li>システムを分配する準備をします(図1)。<ol>
<li>窒素供給タンクのメインバルブを開きます。システム貯蔵所が脱気、超純水で満たされていることを確認してください。コンピュータの電源を入れます。マルチアウトレット電源ストリップでSpotitonシステムをオンにします。</li>
		<li>デスクトップアイコン (図 2A) をクリックして、Spotiton ソフトウェアのユーザー インターフェイス (UI) を開きます (図 2B)。[ツール]メニューで、[ステージを初期化]を選択して、3軸ロボット(グリッドステージとピペットステージ)と回転ディスペンサーヘッドアセンブリ(thetaステージ)を初期化してホームにします。初期化とホーミングの前にディスペンサーの先端が下向きになっていることを確認します。</li>
		<li>メイン ウィンドウで、[ セーフポジションへ移動 ] をクリックして、ロボットを SafePosition に送信します (図 3)。 メモ:SafePositionへの移動は、衝突の危険なしに任意の位置にあるロボットで行うことができます。</li>
		<li>[ 吸気] タブで、[ プライム ] を選択して、ディスペンサーヘッドを貯水池の水で複数回洗い流します。2つの先端から途切れない水の流れが出てくるまで続けてください。 注: 最後のシャットダウン時にチップがメタノールでフラッシュされたときに、かなりの量の空気が流体ラインに入った場合、この処理を繰り返す必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>ディスペンサー性能の検査<ol>
<li>[ 検査 ]タブで、各チップを検査カメラに送って水を試験し、2つのディスペンサー(図S1)からの液滴生産のパターンに一致させます。 メモ:泡(図S2A)または破片のためにチップが発射されない場合は、吸気タブでアクセスする超音波洗浄機能を使用して、洗浄ステーション(図S2B)の先端を清掃してください。</li>
		<li>各ディスペンサーとサンプルの焼成振幅(ユニットレス)を調整して、一貫したサイズの離散液滴の流れを達成します。</li>
		<li>2つのディスペンサーによる同等の液滴の生産を視覚的に確認する。<ol>
<li>上部のカメラモニターの「録画」ボタンを押して、チップ1発射の動画を録画します。先端2が上側カメラモニターで発射されると同時に、右側のモニターで発射するチップ1のビデオを再生します(図S1)。 注:各チップ発射のビデオが記録され、保存されます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ディスペンサーはグリッド上でテスト発射する準備が整いました。 注: このプロトコルは、それぞれのプランジ位置でのグリッドとピペットの正しい位置合わせが検証されていることを前提としています。正しい位置合わせを確認しないと衝突が発生し、先端やロボットが損傷する可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>グリッド上の水をテストします。<ol>
<li>ロボットがセーフポジションにあることを確認します。</li>
		<li>付属のアレンキーを使用して、グリッドロボットのマウントからピンセットを取り外します。</li>
		<li>近くのベンチトップで、テストグリッド、ナノワイヤー側をグリッドブロックの端に配置します。慎重にグリッドの縁をつかみ、ピンセット(図S3)に正しく配置し、ピンセットを取り付け直します。</li>
		<li>[クライオ]タブで、[ヒントからカメラへ]をクリックして、上のプランジパスカメラ(上部カメラ)の視野にヒントを移動します。上側のカメラモニタでLiveが選択され、上側のカメラライトが点灯していることを確認します(マシンキャビネットの前面にダイヤルします(図1)。</li>
		<li>グリッドロボットにピンセットを取り付ける。上側のカメラ モニタに表示されるヒント 1 を、モニタ内でマウスをクリックして配置します。 注: ヒント 1 のみが表示され、クリックの位置に移動します。</li>
		<li>[ グリッドからカメラへ] をクリックして、上のカメラの前にグリッドを配置します。必要に応じて、以前と同様にヒント1の位置を調整します。</li>
		<li>[Tip1]、[Tip2]、[Tip1と Tip2]のいずれかを選択して、どちらか一方または両方のディスペンサーを選択してテスト・ファイアを実行します。 注: ヒントを個別にテストする場合は、マウスを使用して、グリッド上の別の横方向の位置に上側カメラモニターにヒント 1 を配置します。これにより、2つのチップから液体ストライプを重複しないパターンで堆積させ、各チップが発射されたことを確認することができます。</li>
		<li>[ クライオ ] タブで 、[Vitrify Grid] が選択されていないことを確認し、[ キュー ターゲット] をクリックし、 プランジでクリックします。 注:ピペットステージがわずかに上昇し、その後にグリッドステージが続きます。グリッドロボットは、発射ディスペンサーと上下のカメラを通り過ぎてグリッドを突っ込み、デッキのすぐ上で休むようになりました。上のカメラからの画像キャプチャは、UI の左側にある下側カメラからの画像キャプチャの上に表示されます。</li>
		<li>上下の画像を評価する:各先端は選択されたときに発射されましたか?一緒に発射されたとき、2つの先端からの液体は完全に重なり、個別に発射されたときよりも著しく厚いストライプを作り出しましたか?<ol>
<li>いずれかの先端が発射に失敗した場合は、明確な発火が観察されるまで1つまたは複数の超音波洗浄サイクルを実行します。</li>
			<li>サンプルストライプが完全に重ならない場合は、アレンキーを使用してディスペンサーの1つの横方向の位置合わせを調整して、ディスペンサーの1つの側面調整ネジを1/4ターン回転させ、テストプランジを実行します。ストライプが完全に重なるまで繰り返します。 注: 両方のヒントが正常に起動し、期待どおりに起動した場合、システムはサンプル グリッドを準備する準備ができています。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 2サンプルの混合グリッドを用意する
<ol><li>マシンパラメータXMLファイルの加速度、減速、速度の値を更新して、目的のミキシング時間を達成します。 注: これらの値を混合時間に関連付けた表は、以前に15を報告されています。</li>
	<li>サンプルとグリッドを準備します。 注: プロトコルのこの時点から、最初のグリッドが準備される前に 20 ~ 30 分が経過し、サンプルはこの時間間隔の間、適切な温度で保持する必要があります。<ol>
<li>適切な緩衝液を用いて目的の濃度に2つのサンプル(すなわち、タンパク質およびリガンドまたは他の相互作用パートナー)を希釈し、理想的には、両者について同じである。 注:スポティトングリッドは、通常、自動プランジ冷凍庫に使用されるタンパク質の1.5〜2倍の濃度を必要とします。これは、急落時にタンパク質がグリッド表面の薄い水層で費やす時間が最も短いためであり、粒子が空気と水の界面に集中する機会を減らす可能性があります。</li>
		<li>液体窒素でクライオゲンボウルを満たします。</li>
		<li>プラズマクリーン3-4ナノワイヤグリッド。出発点として5W、水素、酸素を1.5分使用してください。 注:最も効果的なプラズマ洗浄時間とレシピは、周囲の温度と湿度と使用されるナノワイヤグリッドのバッチに基づいて、日々の変化をすることができます。代替ガス混合物またはグロー放電器も有効であるかもしれないが、この目的のためにテストされていない。バッファー溶液中の水とタンパク質は、ナノワイヤによって異なる速度で悪振る舞うことが多いため、実際のサンプルが分配される急落時にその日に使用されるグリッドのウィッキングを評価することがベストプラクティスです。</li>
	</ol></li>
	<li>システムの湿度レベルを設定します。 注:グリッドを作り、プラズマの両方に使用される条件に加えて、湿度はナノワイヤグリッドのウィッキング速度に影響を与えるもう一つの主要な要因です。特定のセッションの目標%湿度は、毎日とグリッドのバッチごとに経験的に決定されますが、90〜95%が良い出発点です。<ol>
<li>ネブライザーが超純水で十分に満たされていることを確認してください。ネブライザーを差し込み、ネブライザーキャップの中央ポートから蒸気出口を観察します。</li>
		<li>メインウィンドウでライブ湿度モニタを観察するか、レポート|の下の周囲湿度トラッカーを開きます アンビエント (図 S4)2つのゾーンの湿度レベルを確認してください: チャンバー と シュラウド。 注: チャンバー には、Spotitonエンクロージャ内のすべての領域が含まれています。 シュラウド は、グリッドとディスペンサーの先端の「カメラで」位置をすぐに包含する領域です。ブラック樹脂シュラウドは、エンクロージャドアが開いてグリッドをロードするときに、設定された湿度レベルを維持します。</li>
		<li>目標の湿度値に達したら、これらの値を [ 湿度 ] タブから自動的に、または手動で維持します。[ 自動制御] を選択し、設定点としきい値を選択して、選択したしきい値の範囲内で設定ポイントを維持します。または、[ 手動制御] を選択し、 チャンバーファン と シュラウドファンの2つのファンコントロールを使用して湿度レベルを調整します。 注:チャンバーファンをオンにすると、左ポートのフィルターを通して蒸気を引っ張り、より大きな水滴がチャンバーに入るのを防ぎ、周囲の湿度がさらに増加するのを防ぎます。チャンバードアが閉じたままである限り、湿度レベルは所望の割合で安定します。シュラウドファンをオンにすると、右のポートを通って蒸気がシュラウドに引き込まれる。これは両方ともチャンバーへの蒸気放出を減らし、シュラウド内の湿気レベルを増加させる。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルをディスペンサーに積み込みます。<ol>
<li>サンプルカップに各サンプルを5μL加えます。 注:気泡を導入しないように、カップの内側の側壁に非常に慎重にボリュームを分配し、カップの底にサンプルを強制するために振り下ろします。</li>
		<li>サンプルカップを保持トレイ(左側のチップ1のサンプル)に、右側のTip 2にセットします。トレイをマシンに押し込み、シートに戻します。</li>
		<li>[ 吸気 ]タブで、各チップで吸引するボリュームに3μLを選択します。サンプルトレイがしっかりと固定されていることを確認し、 吸引 をクリックして、ピペットステージがディスペンサーヘッドをサンプルカップに移動する様子を観察します。</li>
		<li>サンプルカップを取り外し、液面の低下を観察することで、両方のサンプルの吸引を確認します。</li>
		<li>[ 検査 ]タブで、各チップを検査カメラに送信して、妨げられないディスペンスを確認します。各先端からの液滴の形成を一致させるために必要に応じて振幅を調整します(セクション1.2を参照)。 注: タンパク質サンプルを分配するチップの振幅を大きくする必要があります。</li>
		<li>これで、システムはサンプルグリッドを準備する準備が整いました。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプル グリッドをフリーズする<ol>
<li>新しくプラズマ洗浄されたグリッドをピンセットにロードしますが、ピンセットはまだ取り付けないでください。湿度レベルが上昇していることを確認します, 〜90-95%.エタンカップを満たします。</li>
		<li>点検カメラの前で両方の先端の最終試験射撃を行い、障害物がないことを確認します。[クライオ] タブで、[ カメラへのヒント] をクリックします。</li>
		<li>エタンカップを満たします。エタン氷が形成される場合は、必要に応じてエタンガスを加えて溶融します。 注:ステップ2.5.4および2.5.5は比較的速く(<20 s)チャンバの高湿度のナノワイヤの飽和を最小にし、(ii)タンパク質サンプルを焼成する先端が詰まらせる可能性を達成する必要があります。</li>
		<li>グリッドステージにグリッドを持つピンセットをマウントします。[ クライオ ] タブで、[ グリッドからカメラ]をクリックします。ヒント1が上側のカメラモニタに正しく配置されていることを確認します(手順1.3.4~1.3.5を参照)。</li>
		<li>[ ビトリフィ グリッド]、[ キュー ターゲット]、[ プランジ] の順にクリックします。グリッドロボットにエタンから液体窒素にグリッドをホップし、水没した棚に放出するように指示されたら 、[OK]を クリックします。 注:ピンセットは、その後、チャンバーに戻って上昇します。液体窒素へのホップの後、グリッドがピンセットから落ちたかどうかを尋ねるプロンプトが表示されます。ドロップされなかった場合は、[ いいえ] をクリックすると、ピンセットが数回開いて閉じてグリッドを切り離します。</li>
		<li>グリッドのイメージ (図 S5) を調べて、グリッドを保持するか破棄するかを決定します。</li>
		<li>グリッドを保持する場合は、事前に冷却されたグリッド ボックスに転送します。また、後続のグリッドを見つけて、すべてのグリッドをグリッドボックスに一度に転送し、各グリッドを休憩エリア内の位置で識別できるように注意します。</li>
		<li>グリッドをグリッドボックスに転送するには、細かいチップの鉗子を事前に冷却し、グリッドを端でそっとつかみ、時計回りに行くノッチの最初のスロットから始めてグリッドボックススロットに配置します。</li>
		<li>すべてのグリッドがロードされたら、グリッドボックスの蓋を蓋ツールに取り付け、液体窒素で予冷します。ふたをグリッドボックスにねじ込み、蓋ツールまたはプリクールスクリュードライバーで締めます。</li>
		<li>大きな鉗子を使用して、閉じたグリッドボックスをイメージングまたは長期保存のための小さなデュワーに素早く転送します。</li>
	</ol></li>
	<li>下流のEMイメージングに対するグリッド適合性を評価します。<ol>
<li>グリッドが突っ込んだ直後に UI の左側に表示される上および下のプランジ パス カメラの画像を観察します。これらの画像を使用して、ウィッキング速度、両方の先端の発射に成功し、2つのサンプルストライプのオーバーラップの程度を評価します。</li>
		<li>実験ビューアを使用して、プランジ時のマシン設定と湿度測定と共に、上下のカメラのグリッド画像を確認し、比較します |。実験を行う.</li>
		<li>良いウィッキングの証拠を示す電子顕微鏡でイメージング用のグリッドを選択します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Berriman, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transient+structures+by+cryo-microscopy+combined+with+rapid+mixing+of+spray+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets.</a> Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).</li>
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<li>Mäeots, M. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11 (1), 3465(2020).</li>
<li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+cryo-electron+microscopy+using+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip.</a> Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).</li>
<li>Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spotiton%3A+a+prototype+for+an+integrated+inkjet+dispense+and+vitrification+system+for+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM.</a> Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).</li>
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<li>Dandey, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spotiton%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Spotiton: New features and applications.</a> Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).</li>
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<li>Ravelli, R. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11 (1), 2563(2020).</li>
</ol>

B.C/C.S.P.は、Spotitonプロトタイプに基づく市販の機器、カメレオンを生産するSPT Labtech社と商業的関係を持っています。

このプロトコルは、90〜500 msのために混合された2つのサンプル、一般的に関心のあるタンパク質と活性化リガンドを運ぶクライオEMイメージングのためのグリッドを準備するためのSpotitonロボットシステムの使用を概説します。ワークフローは簡単ですが、ユーザーがグリッド作成セッションを生産的に行うために留意する必要があるいくつかの考慮事項があります。まず、圧電ディスペンサーの先端の1つが詰まったり、ブロックされたりして発射を防ぐことは珍しくありません。このような障害は、上または下のカメラからの画像キャプチャに見られる液体ストライプをもたらし、両方の先端が発射された後に見られるものよりも目に見えて狭くなります。閉塞は、先端の気泡宿舎、液滴形成の混乱、または乾燥して狭い先端オリフィスを密封したタンパク質サンプルから生じる可能性があります。吸引試料は、その過程で失われるが、両方の問題は、サンプルの先端と再吸引の超音波洗浄によって解決することができる。その後の詰まりを防ぎ、廃棄物をサンプルに入れないようにするために、サンプル吸引の前に流体ラインを徹底的にプライム(フラッシュ)し、チャンバーとシュラウド内の高い一貫した湿度レベルを維持することが重要です。さらに、特に高濃度のタンパク質サンプルは、湿度が良好に維持されているにもかかわらず、チップの焼成に影響を与える可能性があります。 [検査 ]タブで焼成振幅を大きくすると、タンパク質濃度が高いため弱い焼成を部分的に補正できますが、サンプルを少なくとも1:2希釈するとチップの焼成が改善され、詰まりを避けることができます。
第2に、目標混合期間に最適な厚さの氷を生成するために必要な理想的なウィッキング速度を達成することは困難である可能性があります。一般的に、より速い混合時間はより速いウィッキングを必要とし、より遅い混合時間は遅いウィッキングを要求する。理想的な邪悪なグリッドの場合、液体ストライプは上のカメラの画像ではっきりと識別可能ですが、下のカメラでは、ストライプの位置にあるグリッドバーのわずかな厚みだけが見えるままです。低速のウィッキングは、下部のカメラ画像に暗いストライプで示され、一般的にイメージングには厚すぎる氷を残します。いずれかの画像にストライプが存在しない場合は、穴に水を残していない可能性のある高速ウィッキングを示します(図S5)。ナノワイヤ密度、プラズマクリーニングの設定と持続時間、室内湿度への暴露時間や設定された湿度などのいくつかの要因は、ウィッキング速度に影響を与える可能性があります。悪い(遅い)ウィッキングは、グリッド上のナノワイヤのまばらなコーティングの結果である可能性があります。ナノワイヤ溶液16への露出時間をわずかに希釈し、増加させることにより、グリッドバー上のナノワイヤの密度および被覆量が増加し、より速いウィッキングを促進する。ナノワイヤ密度が十分であれば、ワット数設定またはプラズマクリーニングの持続時間を増やすと、ウィッキングも改善されます。ここで推奨される設定は、比較的低電力で長い時間ですが、必要に応じて変更できます。
しかし、グリッドとプラズマクリーニング設定の特定のバッチの両方が以前のセッションでうまく機能していた場合、ナノワイヤが室内の高湿度に過度に曝露され、水分と水分の飽和と液体保持能力の低下につながる可能性があります。チャンバー湿度のグリッド飽和効果は、ツイーザーの取り付けとグリッドの突っ込みの間の経過時間を最小限に抑えるか、プランジ前にシステムの湿度レベルを下げることによって低減することができます。しかし、後者は、タンパク質サンプルをロードした先端が詰まらせるという関連リスクをもたらすことに留意すべきである。このリスクを相殺するために、高湿度レベルが維持されるシュラウドに先端を保持すると、新しいグリッドを保持するピンセットを取り付けるのに許容される時間を増やすことができます。最後に、(グリッド加速および/または最大速度を増加させることによって達成される)プランジ時間の短縮は、実際にグリッドのウィッキング特性を変更することなく、薄い氷を有するグリッドをもたらすことに留意すべきです。しかし、2つのサンプルの混合時間も短縮されるので、プランジタイムは通常、遅いウィッキングに対処するために変更される要因ではありません。速すぎるウィッキングに対処するために、グリッドホールに薄すぎるか、または欠けている氷を生じさせると、上記の対策の反対を取ることができます。
Spotitonは、第2の時間解決された研究のために開発された他の技術と比較すると、特定の利点と欠点を提示する。混合サンプルストライプは各ディスペンサーからの液体の2-4 nLしか含まなため、各サンプルの1つの3 μLアリコートは、サンプルが限られている場合に多くのグリッドを調製するのに十分です。さらに、Spotiton17に完全に固有ではないが、統合カメラを使用したサンプル堆積物の観察は、他の混合装置の特徴ではなく、急落したグリッドが粗い合格/不合格評価を受けることを可能にし、スクリーニング時間を大幅に短縮する。システムの重要な欠点の1つは、より速い生物学的反応の尋問を手の届かないところに置く、機械的成分の物理的な限界によって制限される90 msの最小混合時間である。これに対し、既存のマイクロ流体システムでは、10ミリ秒未満の時間が日常的に達成されます。Spotitonベースの市販のカメレオンシステムでは、設計と建設の改善により、最小プランジタイムが54msに短縮され、2番目のディスペンサーを追加することでSpotitonが現在提供しているよりも速い混合時間が可能になる可能性が高まります。
これまでに、70Sリボソームの組み立て、膜貫通管のカルシウム誘発構造変化、GTP加水分解15に応答したダイナミンの収縮など、Spotitonを用いた初期の短命分子状態を調査する様々な実験が行われている。これらの結果の公表以来、いくつかの変更がシステムに組み込まれ、Spotitonグリッド作成セッションのスループット、再現性、およびレポート機能が向上しました。これには、とりわけ、デュアルゾーン、自動湿度監視および制御システム、実験ビューア機能、サイドバイサイドチップ検査機能、UIへのいくつかのマイナーアップグレードが含まれます。アップグレードされたシステムは、以前に報告されたものと同様の将来の2サンプル混合実験と、低分子治療薬とそのタンパク質標的または抗体抗原複合体形成の間などの迅速な結合アッセイをより良くサポートします。2つの相互作用パートナーを含む現在および将来の時間解決実験は確かに続きますが、第3の圧電ディスペンサーと関連ハードウェアの追加は、可能な実験の範囲をさらに広げる可能性があります。例えば、最初の洗剤の堆積に続いて目的のタンパク質が続き、続いてリガンドが相互作用または活性化することによって、洗剤への長期暴露の潜在的な悪影響を除去することができ、好ましい配向性などの一般的な最適でない画像化結果を防ぐためにしばしば必要である。既に発表された作品と将来の応用の可能性の両方に照らして、Spotitonは、2番目の時間分解された研究の実施を容易にするcryo-EMコミュニティにとって重要なツールです。

クライオEMがサブ秒タイムスケール(時間分解クライオEM)上のタンパク質の一過性の立体構造状態を捕捉して明らかにする可能性は、DubochetがクライオEMグリッド2を調製するために開発した標準的なプランジ凍結法に基づいて構築されたベリマンとアンウィン1から始まるいくつかのグループによって実現されている。彼らは、圧縮窒素ガスを使用して、薄い水層に塗布され、ブロットされた最初のサンプルを含む急激なEMグリッドに2番目のサンプルの細かい霧を噴霧する凍結原カップのすぐ上にアトマイザーを追加しました。このシステムは1ミリ秒の低い混合時間を達成することができたが、それはまだユーザー-A技術的に困難なタスクによって最初のサンプルの手動ブロットニングを要求した - と2番目のサンプルの比較的大量のボリューム。また、実際には、2つのサンプルの混合がどこで起こったのかを知ることは困難であり、混合サンプル中の受託マーカーとしてフェリチンナノ粒子を使用する必要がありました。ハワード・ホワイトと同僚によるその後の努力は、ブロッティングと噴霧ステップ3、4のコンピュータ制御を組み込むことによって、この噴霧混合アプローチの制御と再現性を向上させた。サンプルの混合方法と場所に対処するために、同じグループ5と他の6、7、8、9、10は、2つのサンプルが注射器ポンプの圧力下で狭い毛細管または窒素ガスによって駆動される微小流体チップのいずれかで混合噴霧アプローチ11に移動しました。これらのプレミキシングシステムは、完全な混合を保証するだけでなく、時間分解された研究の分解能を高めるために、混合時間の微調整を可能にします。
SpotitonシステムのEMグリッドにサンプルを適用する代替方法として圧電ディスペンサーを導入すると、サンプル堆積物の正確なターゲティングと、グリッド12を作るためのはるかに小さなサンプル量の要件の両方が可能になりました。その後、ナノワイヤグリッドと経路サンプルアプリケーション(「オンザフライ」スポッティング)の使用により、ブロッティングステップの必要性がなくなり、アプリケーション間のガラス化時間が13,14に短縮されました。ここで説明する時間分解型cryo-EMへの新しいアプローチでは、最初の15の堆積後ほぼ即座に移動ナノワイヤグリッドに2番目のサンプルを送達できるように、必要な制御ハードウェアおよびソフトウェアのアップグレードと共に2番目のディスペンサーがSpotitonシステムに追加されました。2つの重なり合うサンプルは、ガラス化の前にナノワイヤーによって薄い水層に悪くなるにつれて、グリッド上で混合します。90ミリ秒の低い混合時間を達成することができます。このプロトコルは、圧電分配とナノワイヤグリッドを使用して時間分解実験を行う方法についての実用的な情報を提供することを意図しています。さらに、使いやすさ、一貫性、およびスループットを高めるためにハードウェアおよびソフトウェアが変更されているので、このプロトコルは、以前に報告された方法15の最新の説明としても機能します。

<table><tbody><tr><td>バッファ</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>極低温グリッド収納ボックス</td><td>EMS (ペンシルバニア州ハットフィールド;USA)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh 300 メッシュ EM グリッド</td><td>EMS (ペンシルベニア州ハットフィールド;米国)</td><td>EMS300-Cu-Rh</td>は<td>、前述のようにナノワイヤーでコーティングするように処理されています(Wei et al、2018)</td></tr><tr><td>エタンガス</td><td>TW Smith Corp.(ニューヨーク州ブルックリン;USA)</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>グリッドハンドリング鉗子</td><td>EMS(ペンシルバニア州ハットフィールド;米国)</td><td>78320-5B</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>エアガス社(ペンシルバニア州ラドナー;米国)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素リザーバーと真鍮製エタンカップ (FEI Vitrobot 製)</td><td>ThermoFisher Scientific (マサチューセッツ州ウォルサム;米国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picosystem</td><td>Hydro System and Supplies(ノースカロライナ州ダーラム;米国)</td><td>N/A</td><td>浄水システム</td></tr><tr><td>タンパク質/その他のサンプル</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solarus 950 プラズマクリーナー</td><td>Gatan, Inc. (カリフォルニア州プレザントン;アメリカ)</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

2つ以上の相互作用粒子の初期の遭遇によって引き起こされる短命の分子状態の捕獲は、クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の分野に大きな関心の実験的課題を続けている。これらの「時間分解」研究をサポートするいくつかの方法論的戦略が開発されており、その1つであるSpotiton-a新しいロボットシステムは、ピコリットルサイズのサンプル液滴の分配と正確な時間的および空間的制御を組み合わせたものです。時間分解されたSpotitonワークフローは、最小限のサンプル量から初期の構造の再配置を問い合わせて、独自に効率的なアプローチを提供します。独立して制御された圧電ディスペンサーから発射され、2つのサンプルが着陸し、凍結原に向かって突っ込むとナノワイヤーEMグリッド上で急速に混合する。サンプルの数マイクロリットルから数百のグリッドを迅速に連続して調製できる可能性があります。ここでは、Spotitonシステムの動作の詳細なステップバイステッププロトコルが、グリッドの準備中に発生する特定の問題のトラブルシューティングに焦点を当てて提示されています。

図4は、1回の時間分解されたスポティトンセッション中に、ガラス化15の前に150msのプロモーター配列を運ぶプロモーター配列を運ぶ105bpのDNAオリゴマーとを混合して、単一の時間分解されたスポピトンセッション中に作製された格子の画像を示す。図に示されているのは、サンプルアプリケーションに続く2つのタイムポイントで6グリッドの2つの高速カメラで撮影された画像です。これらのカメラは、プランジスタイルの冷凍庫の中でユニークで、ナノワイヤーによるウィッキングの観測範囲と、液体サンプルがEMイメージングに十分な薄い水層に引き込まれた可能性に基づいて、グリッドを保持するか廃棄するかを直ちに決定することができます。1 つのグリッドは、完全なデータセットに十分な氷を提供できますが、最適な条件が達成されると、1 つ以上が失われたり汚染された場合に備えて、複数のグリッドを手元に置く準備が整います。このセッションで準備された6つのグリッドのうち、画像キャプチャは最適でないウィッキングを持つ1つだけを示しています(図4F)。
示されたグリッドは、プロトコルに記載されているように、サンプルとマシンを準備するために1時間後に40分の連続で(ステップ2.5.1から2.5.8)連続して準備されました(ステップ1.1.1から2.4.6)。6つのグリッドのうち、2つはデータ収集に使用され、残りは必要に応じて後で分析するために保存されました。ガラス状グリッド上の氷のパターン(図5C)は、上部カメラ画像に見られる堆積液のパターンと密接に一致する(図5B)。下のカメラ画像(図5A)に目に見える液体ストライプがないことによって明らかになった混合サンプルの効果的なウィッキングは、ナノワイヤで覆われたグリッドバーに沿って発生し、サンプルが着陸したものに隣接する正方形にあふれることはめったにない。氷で満たされた正方形の中では、氷は通常、正方形の中心にある穴の中で最も厚く、グリッドバーに近い穴で薄くなります(図5E)。多くの場合、グリッドバーに隣接する穴は、ナノワイヤに近接しているため空です(図5F)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig01.jpg"> 図1: 時間を取り合ったスポティトンシステム 1. オペレータのワークステーション;2. 環境室3. 窒素供給;4. エタン供給5.上のプランジパスカメラ6のバックライト制御。圧電ディスペンサーコントローラ;7. シリンジポンプ;8. 真空ポンプ;9.洗浄水供給および廃棄物ボトル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig02.jpg"> 図2: Spotiton ソフトウェアのユーザーインターフェイス( A) デスクトップアイコンとスプラッシュ画面(B) 主な UI は、上のプランジ パス ("上部") とチップ検査カメラの 1 表示領域の 6 つの領域で構成されています。2. 下のプランジパス(「下」)カメラの表示領域。チップ検査ビデオの再生エリア。4.多機能タブ領域。5.ライブ湿度モニター。6. ライブシステムログファイル。省略形: UI = ユーザー インターフェイス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig03.jpg"> 図3:スポティトンチャンバー(SafePosition のロボット)の内部図1. グリッドロボット(赤);2. ディスペンサーロボット(黄色);3.上部のプランジパスカメラ(ピンク)。4.下のプランジパスカメラ(水色)。5.チップ検査カメラ(オレンジ色)。6.湿度シュラウド(緑)。7.サンプルトレイ。8. ネブライザーアセンブリ(ダークブルー);9.システム貯水池と水ライン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig04.jpg"> 図4: 時間解決されたSpotitonグリッド作りセッションからの代表的なシステムカメラ画像(A-F) 上(左)と下(右)のプランジパスカメラ画像は、RNAポリメラーゼとプロモーターDNA配列がSpotitonを使用して適用された6つのグリッド上に適用された。スケールバー= 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62271/62271fig05.jpg"> 図5:スポティトン製グリッド上の氷の堆積パターン図4Fに示すグリッドの(A)下部および(B)上部カメラ画像と(C)アトラスの部分。サンプルの沈着と混合から生じる氷の近似位置は、ラベンダーを着色しています。黄色の矢印でマークされた四角形内の領域は、(E-G)でイメージ化されます。(E)に示す領域は黄色でボックス化されています (D)。代表の正方形(E)、穴(F)、および(A-D)に示すグリッドから収集された露出画像(四角形と穴の画像のボックス化された領域は、それぞれ穴と露出のイメージに対応します。スケールバー= 100 μm(A-D),5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/62271fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図S1:先端発射の検査。 ユーザーインターフェイスの左側の上部カメラモニターには、チップ2発射のライブビューが見られ、以前に行われたチップ1の発射の録音は、右側のビデオ再生領域で比較のためにループで再生されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S1.jpg" target="_blank">このファイルをダウンロードするこちらをクリックしてください。</a>
図S2:ディスペンサーチップの超音波洗浄。(A)先端の気泡は液滴形成を妨害し、先端の焼成を防ぐ。(B)超音波洗浄ステーションで水に浸漬した先端は、チップオリフィスを遮断する空気泡または透明な乾燥タンパク質を除去する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S2.jpg" target="_blank">このファイルをダウンロードするこちらをクリックしてください。</a>
図 S3: ピンセットでグリッドをロードする (A) グリッドは、グリッドブロックの端にナノワイヤ側を配置した。(B) 自己閉鎖ピンセットに正しく配置されたグリッド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S3.jpg" target="_blank">このファイルをダウンロードするこちらをクリックしてください。</a>
図S4:湿度トラッカー。 典型的なグリッド作成セッション中に記録されたチャンバーの相対湿度(濃い青色)とシュラウド(水色)のパーセント。グリッドの急落の時間(緑の四角)がグラフにプロットされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S4.jpg" target="_blank">このファイルをダウンロードするこちらをクリックしてください。</a>
図S5:急落時にナノワイヤグリッドをウィッキングする。 代表上方(A、C、E)および下(B、D、F)は、遅すぎるナノワイヤグリッド上のウィッキングの突っ込み経路カメラ画像(A、B)、理想的(C、D)および速すぎる(E、F)。わずかな太さ(白い矢印)は、サンプルによって飽和されたナノワイヤを持つグリッドバーを示します。これらの領域の正方形は、典型的には、電子顕微鏡イメージングに適した厚さの氷を含む。スケールバー= 500 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62271/Figure%20S5.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてください このファイルをダウンロードしてください。</a>

ここで提示されるプロトコルは、液体クライオゲンのガラス化の前に最低90ミリ秒混合する自己ウィッキング、ナノワイヤーグリッドに関心のある2つのサンプルを提供するために、新しいロボットシステムであるSpotitonを使用することを説明しています。

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Spotitonロボットシステムを使用すると、90ミリ秒の速さで電子顕微鏡グリッド上の相互作用パートナーと関心のあるタンパク質を混合し、ビトリフィフィフィすることができます。このプロトコルは標準的な格子準備技術によって捕獲されるに過大な過渡性である中間タンパク質の確認の捕獲を可能にする。Spotitonは、膜チャネル活性化、DNAまたはRNA合成、または標的タンパク質との薬物または抗体の早期相互作用などの第2次生物学的または生化学的システムを知らせることができます。ユーザーは、グリッドの品質に直接影響を与える複数のコンポーネントを同時に管理する必要があります。使用する前にシステムを理解し、グリッドを準備するときに忍耐を持つことは重要です。まず、窒素供給タンクのメインバルブを開き、システム貯蔵所に脱ガス超純水が充填されていることを確認します。マルチコンセント電源ストリップで、コンピュータとSpotitonシステムの電源を入れます。デスクトップアイコンをクリックして、Spotitonソフトウェアのユーザーインターフェイスを開きます。[ツール]メニューで、[ステージを初期化]を選択して、3軸ロボットと回転ディスペンサーヘッドアセンブリを初期化してホームにし、ディスペンサーの先端が初期化とホーミングの前に下向きであることを確認します。メインメニューで[安全な位置に移動]をクリックしてロボットを安全な位置に送ります。[吸気] タブで、[プライム] を選択して、ディスペンサーヘッドを貯水池の水で複数回洗い流します。先端から2つの途切れない水の流れが出てくるまで続けてください。[検査]タブで、チップ1を検査カメラに送り、火災水をテストし、離散液滴が生成されるまで振幅を調整します。上部のカメラモニターの「録画」ボタンを押して、1回の発射のヒントのビデオを録画します。検査カメラにチップ2を送る。先端1の発射のビデオを右側のモニターで同時に、先端2が上のカメラモニターで発射され、2つのディスペンサーからの液滴生産のパターンに一致させる。付属のアレンキーを使用して、グリッドロボットのマウントからピンセットを取り外します。近くのベンチトップで、テストグリッドのナノワイヤ側をグリッドブロックの端に上に配置します。慎重にグリッドの縁をつかみ、ピンセットに正しく配置します。その後、ピンセットをマウントし直します。[クライオ]タブで、[カメラへのヒント]をクリックして、上のプランジパスカメラの視野にチップ1を移動し、上のカメラモニターでLiveが選択されていることを確認します。上のカメラライトをオンにして調整します。モニター内でマウスをクリックして、上のカメラモニターに表示されるチップを配置します。[グリッドからカメラ] をクリックして上のカメラの前にグリッドを配置し、必要に応じてもう一度 1 つの位置に調整します。[クライオ]タブで、[ビトリファイドグリッド]が選択されていないことを確認し、[キューターゲット]をクリックしてから、プランジをクリックします。上と下の画像を評価して、ディスペンサーが正常に機能していることを確認します。適切なバッファーで目的の濃度に 2 つのサンプルを希釈, 理想的には両方のために同じを使用して, 液体窒素で凍結ゲンボウルを充填.プラズマは、5ワットの水素と酸素を使用して3〜4ナノワイヤーグリッドを洗浄し、出発点として1.5分を洗浄します。ネブライザーを差し込み、ネブライザーキャップの中央ポートから蒸気出口を観察します。メインウィンドウでライブ湿度モニタを確認するか、またはレポートとアンビエントの下にアンビエント湿度トラッカーを開きます。チャンバーとシュラウドゾーンの湿度レベルを確認してください。サンプルカップにサンプルを5マイクロリットル加えます。サンプルカップをホールディングトレイに積み込み、左にチップ1個、右側のチップ2のサンプルを持つ。その後、トレイをマシンに押し込み、座るまで戻します。[吸気] タブで、各チップで吸引するボリュームを 3 マイクロリットル選択します。サンプルトレイがしっかりと固定されていることを確認し、[吸気]をクリックして、ピペットステージがディスペンサーヘッドをサンプルカップに移動することを確認します。サンプルカップを取り除き、液体レベルの低下を観察することによって、両方のサンプルの成功した吸引を確認します。[検査]タブで、各チップを検査カメラに送信して、妨げられないディスペンスを確認します。各先端からの液滴の形成に合わせて、必要に応じて振幅を調整します。新しくプラズマ洗浄されたグリッドをピンセットにロードしますが、ピンセットはまだ取り付けないでください。湿度レベルが約90〜95%に上昇していることを確認し、エタンカップを充填し、点検カメラの前で両方の先端の最終試験を行い、障害物がないことを確認します。[クライオ]タブで、[カメラへのヒント]をクリックします。エタンカップをチェックしてください。エタン氷が形成された場合は、必要に応じてエタンガスを加えて溶融する。グリッドステージにグリッドを持つピンセットをマウントします。[Cryo] タブで[グリッドからカメラへ]をクリックし、先端の1つが上のカメラモニタに正しく配置されていることを確認します。ビトリファイグリッド、キューターゲット、プランジをクリックします。グリッドロボットにエタンから液体窒素にグリッドをホップし、水没した棚に放出するように指示されたら、[OK]をクリックします。グリッドのイメージを調べて、グリッドを保持するか破棄するかを決定します。グリッドを維持する場合は、細かいチップの鉗子を事前に冷却し、グリッドを端でそっとつかみ、ノッチの左側にある最初のスロットから始めて時計回りに行くグリッドボックススロットに配置します。実験ビューアを使用して、レポートと実験を選択して、プランジ時の機械設定と湿度測定値と共に上下カメラのグリッド画像を確認および比較します。105塩基対DNAオリゴマーにRNAポリメラーゼを混合して1回の時間分解されたSpotitonセッション中に作製された格子の画像を、ガラス化前に150ミリ秒のプロモーター配列を運ぶ。6つのグリッドのうち、最適でないウィッキングを示すのは1つだけです。ガラス状グリッド上の氷の堆積パターンは、上部のカメラ画像に見られる堆積液のパターンと密接に一致します。混合サンプルの効果的なウィッキングは、ナノワイヤーで覆われたグリッドバーに沿って発生し、サンプルが着陸したものに隣接する正方形にほとんどオーバーフローしません。氷で満たされた正方形では、氷は通常、正方形の中心にある穴の中で最も厚く、グリッドバーに近い穴で薄くなります。グリッドバーに隣接する穴は、ナノワイヤに近接しているため、しばしば空です。ナノワイヤグリッドの適切な調製と取り扱いにより、混合サンプルグリッド上の良好な氷厚が保証されます。Spotitonシステムはまたユーザーが同じグリッドの維持セッションの間に混合されていない制御のコレクションを可能にする単一のグリッドに別に2つのサンプルを入金することを可能にする。Spotitonは、細菌遺伝子発現における第1の中間体のリアルタイムでの捕捉を可能にした。サブ秒のタイムスケールで形成されるため、構造は今まで不明でした。

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Research

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新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

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