新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備
2021年2月25日
ここで提示されるプロトコルは、液体クライオゲンのガラス化の前に最低90ミリ秒混合する自己ウィッキング、ナノワイヤーグリッドに関心のある2つのサンプルを提供するために、新しいロボットシステムであるSpotitonを使用することを説明しています。
Spotitonロボットシステムを使用すると、90ミリ秒の速さで電子顕微鏡グリッド上の相互作用パートナーと関心のあるタンパク質を混合し、ビトリフィフィフィすることができます。このプロトコルは標準的な格子準備技術によって捕獲されるに過大な過渡性である中間タンパク質の確認の捕獲を可能にする。Spotitonは、膜チャネル活性化、DNAまたはRNA合成、または標的タンパク質との薬物または抗体の早期相互作用などの第2次生物学的または生化学的システムを知らせることができます。
ユーザーは、グリッドの品質に直接影響を与える複数のコンポーネントを同時に管理する必要があります。使用する前にシステムを理解し、グリッドを準備するときに忍耐を持つことは重要です。まず、窒素供給タンクのメインバルブを開き、システム貯蔵所に脱ガス超純水が充填されていることを確認します。
マルチコンセント電源ストリップで、コンピュータとSpotitonシステムの電源を入れます。デスクトップアイコンをクリックして、Spotitonソフトウェアのユーザーインターフェイスを開きます。[ツール]メニューで、[ステージを初期化]を選択して、3軸ロボットと回転ディスペンサーヘッドアセンブリを初期化してホームにし、ディスペンサーの先端が初期化とホーミングの前に下向きであることを確認します。
メインメニューで[安全な位置に移動]をクリックしてロボットを安全な位置に送ります。[吸気] タブで、[プライム] を選択して、ディスペンサーヘッドを貯水池の水で複数回洗い流します。先端から2つの途切れない水の流れが出てくるまで続けてください。
[検査]タブで、チップ1を検査カメラに送り、火災水をテストし、離散液滴が生成されるまで振幅を調整します。上部のカメラモニターの「録画」ボタンを押して、1回の発射のヒントのビデオを録画します。検査カメラにチップ2を送る。
先端1の発射のビデオを右側のモニターで同時に、先端2が上のカメラモニターで発射され、2つのディスペンサーからの液滴生産のパターンに一致させる。付属のアレンキーを使用して、グリッドロボットのマウントからピンセットを取り外します。近くのベンチトップで、テストグリッドのナノワイヤ側をグリッドブロックの端に上に配置します。
慎重にグリッドの縁をつかみ、ピンセットに正しく配置します。その後、ピンセットをマウントし直します。[クライオ]タブで、[カメラへのヒント]をクリックして、上のプランジパスカメラの視野にチップ1を移動し、上のカメラモニターでLiveが選択されていることを確認します。
上のカメラライトをオンにして調整します。モニター内でマウスをクリックして、上のカメラモニターに表示されるチップを配置します。[グリッドからカメラ] をクリックして上のカメラの前にグリッドを配置し、必要に応じてもう一度 1 つの位置に調整します。
[クライオ]タブで、[ビトリファイドグリッド]が選択されていないことを確認し、[キューターゲット]をクリックしてから、プランジをクリックします。上と下の画像を評価して、ディスペンサーが正常に機能していることを確認します。適切なバッファーで目的の濃度に 2 つのサンプルを希釈, 理想的には両方のために同じを使用して, 液体窒素で凍結ゲンボウルを充填.
プラズマは、5ワットの水素と酸素を使用して3〜4ナノワイヤーグリッドを洗浄し、出発点として1.5分を洗浄します。ネブライザーを差し込み、ネブライザーキャップの中央ポートから蒸気出口を観察します。メインウィンドウでライブ湿度モニタを確認するか、またはレポートとアンビエントの下にアンビエント湿度トラッカーを開きます。
チャンバーとシュラウドゾーンの湿度レベルを確認してください。サンプルカップにサンプルを5マイクロリットル加えます。サンプルカップをホールディングトレイに積み込み、左にチップ1個、右側のチップ2のサンプルを持つ。
その後、トレイをマシンに押し込み、座るまで戻します。[吸気] タブで、各チップで吸引するボリュームを 3 マイクロリットル選択します。サンプルトレイがしっかりと固定されていることを確認し、[吸気]をクリックして、ピペットステージがディスペンサーヘッドをサンプルカップに移動することを確認します。
サンプルカップを取り除き、液体レベルの低下を観察することによって、両方のサンプルの成功した吸引を確認します。[検査]タブで、各チップを検査カメラに送信して、妨げられないディスペンスを確認します。各先端からの液滴の形成に合わせて、必要に応じて振幅を調整します。
新しくプラズマ洗浄されたグリッドをピンセットにロードしますが、ピンセットはまだ取り付けないでください。湿度レベルが約90〜95%に上昇していることを確認し、エタンカップを充填し、点検カメラの前で両方の先端の最終試験を行い、障害物がないことを確認します。[クライオ]タブで、[カメラへのヒント]をクリックします。
エタンカップをチェックしてください。エタン氷が形成された場合は、必要に応じてエタンガスを加えて溶融する。グリッドステージにグリッドを持つピンセットをマウントします。
[Cryo] タブで[グリッドからカメラへ]をクリックし、先端の1つが上のカメラモニタに正しく配置されていることを確認します。ビトリファイグリッド、キューターゲット、プランジをクリックします。グリッドロボットにエタンから液体窒素にグリッドをホップし、水没した棚に放出するように指示されたら、[OK]をクリックします。
グリッドのイメージを調べて、グリッドを保持するか破棄するかを決定します。グリッドを維持する場合は、細かいチップの鉗子を事前に冷却し、グリッドを端でそっとつかみ、ノッチの左側にある最初のスロットから始めて時計回りに行くグリッドボックススロットに配置します。実験ビューアを使用して、レポートと実験を選択して、プランジ時の機械設定と湿度測定値と共に上下カメラのグリッド画像を確認および比較します。
105塩基対DNAオリゴマーにRNAポリメラーゼを混合して1回の時間分解されたSpotitonセッション中に作製された格子の画像を、ガラス化前に150ミリ秒のプロモーター配列を運ぶ。6つのグリッドのうち、最適でないウィッキングを示すのは1つだけです。ガラス状グリッド上の氷の堆積パターンは、上部のカメラ画像に見られる堆積液のパターンと密接に一致します。
混合サンプルの効果的なウィッキングは、ナノワイヤーで覆われたグリッドバーに沿って発生し、サンプルが着陸したものに隣接する正方形にほとんどオーバーフローしません。氷で満たされた正方形では、氷は通常、正方形の中心にある穴の中で最も厚く、グリッドバーに近い穴で薄くなります。グリッドバーに隣接する穴は、ナノワイヤに近接しているため、しばしば空です。
ナノワイヤグリッドの適切な調製と取り扱いにより、混合サンプルグリッド上の良好な氷厚が保証されます。Spotitonシステムはまたユーザーが同じグリッドの維持セッションの間に混合されていない制御のコレクションを可能にする単一のグリッドに別に2つのサンプルを入金することを可能にする。Spotitonは、細菌遺伝子発現における第1の中間体のリアルタイムでの捕捉を可能にした。
サブ秒のタイムスケールで形成されるため、構造は今まで不明でした。
概要
この研究では、電子顕微鏡グリッド上でタンパク質の迅速な混合とガラス化を行うSpotitonロボットシステムを用いたプロトコルを提示します。この技術は、標準的な方法では捉えられない一過性のタンパク質構造を捕捉し、動的な生物学的プロセスへの洞察への道を開きます。
主要な研究要素
研究分野
- タンパク質相互作用
- 一過性構造
- クライオ電子顕微鏡法
背景
- タンパク質の迅速な相互作用の研究の重要性
- 一過性の状態の捕捉における課題
- 生物学的研究におけるガラス化の有用性
使用方法
- サンプルの混合とガラス化のためのSpotitonシステムの使用
- ナノワイヤグリッド上のタンパク質と相互作用パートナーへの適用
- 中間体を捕捉するための高速混合
主な結果
- 90ミリ秒という短時間で混合タンパク質サンプルのガラス化に成功
- ナノワイヤグリッドに沿った効率的なウィッキングによりサンプルの完全性が確保
- 混合結果と相関する氷の析出パターンの明確な可視化
結論
- この研究は、迅速な生物学的プロセスの観察における時間分解能のあるSpotitonの有用性を効果的に示しています。
- この研究結果は、生物学的研究に不可欠なタンパク質のダイナミクスと相互作用の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Capturing transient molecular intermediates is a critical challenge in early-stage drug discovery and structural biology. The Spotiton robotic system enables time-resolved cryo-EM grid preparation, allowing R&D teams to interrogate rapid biomolecular interactions and conformational changes with high temporal precision. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of short-lived protein conformations relevant to target engagement.
- Supports mechanistic de-risking by capturing intermediate states in protein-ligand or protein-nucleic acid interactions.
- Facilitates functional target validation by revealing structural transitions on sub-second timescales.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological grids for downstream cryo-EM analysis with minimal sample volume.
- Standardizes grid preparation for reproducible, quantitative structural readouts.
- Enables rapid, scalable grid production to support high-throughput screening of molecular interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms, informing translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Reduces ambiguity in structure-based drug design by capturing elusive intermediate states.
Pipeline & Workflow Integration
The Spotiton system integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic interrogation with structural validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling capture of rapid molecular events and pathway transitions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cryo-EM grids for comparative analysis of compound or biomolecule effects.
- Analytics: Provides high-resolution structural data to inform condition comparisons and mechanistic hypotheses.
- Translational Research: Connects early structural findings to preclinical validation when disease-relevant systems are studied.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable grid preparation for structural studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing transient states critical to biological function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM grid handling and robotic system operation.
- Needs access to Spotiton instrumentation and compatible nanowire EM grids.
- Demands rigorous calibration and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation may be needed for different biomolecular systems or sample types.
- Grid quality is sensitive to humidity control, dispenser calibration, and sample preparation protocols.
