Name: 透過電子顕微鏡用小型サンプル準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ透過電子顕微鏡用ナノリットルサンプル準備法。紙ブロッティング不要でサンプル損失を最小化し、単細胞溶解液のビジュアルプロテオミクス解析を可能にする革新的な構造生物学手法です。

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著者は彼らのサポートは、s. a. ミュラー原稿、A. Fecteau-ルフェーブルの EM、リカルド ・ Adaixo、フランク ・ テクニカル サポートを慎重に読み、重要な議論のためのバーゼル大学の Biozentrum のワーク ショップを感謝したいです。膜タンパク質のレーマンは、彼の刺激的な会話のための名誉の大学バーゼル、A. エンゲル (C チナ、Biozentrum、バーゼル大学からのすべて) のサンプルをテストします。テスト サンプルは、p. Ringler、m. a. によって提供された親切マヒマヒ、t. Schwede (Biozentrum、バーゼルの大学)、P. Leiman (スイス連邦工科大学生物物理学、構造生物学研究室)、r. ディアス アバロス (構造生物学センター、米国ニューヨーク)。プロジェクトは、スイスのナノサイエンスの研究所 (SNI プロジェクト P1401 ARGOVIA プロジェクト MiPIS) とスイスの全米科学財団 (SNF、プロジェクト 200021_162521) によって支持されました。

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著者トマス ・ ブラウン、ヘニング スタールバーグ ステファン A. アーノルド宣言次の競合する金利: PCT の特許出願の一部である cryoWriter コンセプト/EP2015/065398 と EP16194230。

'CryoWriter' 楽器との NS- と Cryoem nL サイズ総サンプル ボリュームからサンプル グリッドを準備し、完全に古典的な紙しみが付くことのステップを避けるために必要なプロトコルが表示されます。マイクロ流体原理とマイクロ システムはこれを可能にする cryoWriter に結合されます。
我々 の経験では、本稿で提示された小型のメソッドを使用する場合、EM グリッドの準備のためのパラメーター空間が古典的な方法と厳密なユーザー制御の下でより大きいことを示しています。重要なは、増加の再現性の場合、サンプル バッファー システムは、実際の実験を実行する前にパラメーターの最適値を決定するためのすぐに利用できるテスト蛋白質で補完済み画面することが可能になります。これは最低限絶対に目的の標本の消費を保持し、強くお勧め。両方の NS-70S グリッドの準備のための重要なステップは、: (i) プライミング ポンプ システムのサブ ナノリットル ボリューム調剤、システム液体 (水) 脱、バブルの無料。(グロー放電のプラズマ クリーニングのステップ; ii) 正確な制御EM グリッドの表面特性は、再現可能な結果を得るのために重要です。(iii) サンプルをご利用いただけます。、例えば、ns での調節に必要な時間は、バッファーの種類や塩分濃度 (図 3)、およびマイクロキャピ ラリー24のノズル形状によって異なります。(iv) の定量 EM; NS EM 準備蒸発コーヒー リングの効果は、NS EM 製剤の定量分析を禁止することができ、DP ステージによって制御される遅い蒸発によって抑制する必要があります。
提示されたグリッドの準備方法のさまざまな側面は、特定のサンプルの汎用プロトコルの開発をできるように自由に結合できます。典型的な例であるグリッドに向けて Cryoem; 前にエアコン ステップによる高解像度 EM、例えばグリセロールを阻止する物質の除去グリッドを用意する前にエアコンの配位子などのメディエーター分子の導入または単一細胞ライセートで NS- または -70S (図 6) の検討。
マイクロ流体システムと示された方法で最小限のサンプル量の使用は完全に紙しみが付くことのステップの必要性を削除します。これは、タンパク質、可能性のある不要なイオン サンプルの汚染および本質的に大規模なサンプル損失につながる過酷な治療は、あぶらとり紙ため大きな利点です。その一方で、cryoWriter が使用される場合、Cryoem 試料は古典的な方法で準備されるときに、薄いサンプルの膜の気水界面による潜在的影響は避けられない。Cryoem に適したグリッドは、サンプル アプリケーションとガラス化 (データは示されていない) 間未満 0.2 秒待機時間で用意できます。ただし、タンパク質は、拡散によって数ナノ秒でナノメートルの少数の tenths を旅行、あるまだ数回 100 nm 厚のサンプル フィルムの水面に衝突するそれらのための十分な時間。ただし、空気-水界面に付着蛋白質の量これらの短時間ギャップ大幅削減されるだろうし、タンパク質変性を防ぐ可能性がありますまたは粒子の方向を制限します。水空気インターフェイスから機密性の高いタンパク質を保護するかもしれないもう一つの有望なアプローチは、低分子量界面活性物質によるサンプル フィルムをカバーすることです。これらの化合物は、グリッドの準備する前に cryoWriter でご利用いただけますステップによって急速に導入できます。マイクロ流体システムの表面に容積率は、cryoWriter の更なる制限サンプル潜在的マイクロキャピ ラリー表面に非特異的吸着が失われることし、粒子のカウントによって定量分析を妨げます。2 つの方法で問題に対処: 最初に、サンプルは、マイクロキャピ ラリー内で長い距離を移動しません。確かに、処理全体で先端部にキャピラリー ナノリットル サンプル ボリュームのままです。第二に、容積の比率に表面をさらに削減して第三に比較的大きな内径、例えば180 μ m microcapillaries を使用して、必要な場合に、microcapillaries の表面することができます簡単にパッシベーションなど、それらを扱うことによって。市販のポリリジン エタノール グリコール (PLL PEG)。
EM に使用されている単一粒子アプローチによるタンパク質の高分解能解析には、個々 のタンパク質粒子像の数百万に 100,000 だけ必要があります。これは、マイクロ流体技術が構造の調査のための十分な蛋白質の複合体を提供できることを意味します。最小セル量 (約 40,000 セル) からタンパク質複合体 (約 1 時間) の高速分離の小型免疫沈殿法は、以前28を開発されました。このメソッドは今、cryoWriter の小型サンプル準備段階に直接リンクされます。最終的な目標は、すべて 2 時間未満を必要とするタンパク質の超高速分離と Cryoem グリッド準備のための統合されたマイクロ パイプラインを開発します。さらに、図 6分量とサンプルの準備およびほぼ可逆エアコンとグリッドの準備の手順、cryoWriter を使用して達成のために必要な材料の量によって示されるようにそれを可能にする蛋白質を研究するには個々 の細胞の複合体。一緒に、小型免疫沈澱法と、cryoWriter は、我々 が最近熱衝撃実験24よう「単細胞 visual プロテオミクス」と呼ばれる新しいプロテオミクス手法の基盤を築きます。「Visual プロテオミクス」画像の解析に連動データ解析アルゴリズムは現在テスト中です。

ハードウェアと透過電子顕微鏡 (TEM) によるタンパク質複合体の構造解析のためのソフトウェアは、近年中に進んでいる超。強化した「解像度革命」1,2へ道舗装し、構造研究を根本的に変更します。革命開始クライオ電子顕微鏡 (Cryoem)3,4、放射線感受性を短縮し、予防しながら生理条件に近いの下で生物学的試料の調製を可能の出現で透過電子顕微鏡5の高真空での蒸発をサンプル。次の年では、増分の技術進歩は達成可能な解像度を徐々 に増加。これらの技術革新の間で電界放射銃6、7のアプリケーションより最近では、最尤法8,9などのデータ解析のアルゴリズムを改善します。直接電子検出器カメラ10、11,12,13、ムービー モード イメージングおよびそれに伴うソフトウェアの開発14,15,16,17日 (レビューを参照してくださいチェン、Grigorieff、らの単粒子解析による生体試料の原子分解能を達成するために必要な最終的なブレークスルーを提供18). Cryoem の重要性は最近開拓者の 3 つの化学のノーベル賞の受賞によって認識されました。
電子顕微鏡による生体試料を画像にサンプル (その後「グリッドの準備」と呼ばれる) と EM グリッドを読み込むためのメソッドする必要があります結果サンプル層 (i) 十分に薄いことを確認 (&lt; 100 nm) 散乱弾性によって広範なノイズを避けるため、または乗算するには電子、(ii) 電子顕微鏡の高真空に耐えるし、(iii) が放射線障害から、生体分子を保護します。2 つの主な方法は、これらの条件を満たすために使用される: 否定的な汚れ(NS)19,20プロシージャ (図 1A) 炭素薄膜フィルム サンプルを吸着、非晶質重金属の生体分子を埋め込むし、空気で乾燥するアセンブリを許可します。これはシンプルで簡単なと (その後、「サンプル グリッド」と呼ばれる) 読み込まれている EM グリッド簡単にして保存し時間の長期間にわたって保つことができる (一般に年).TEM、準備 NS による高コントラストを展示し、クライオ準備よりも高い電子線量を容認するが、解像度が約 20 Å。 Cryoem プロシージャ (図 1B) 採用ホーリーファイバー炭素をサポートに限定。試料溶液の薄膜が穴にまたがってスパンされてし、EM グリッドは、寒剤、-150 ° C 以下それを急速に冷却するため、通常液化エタンに陥って結果は非晶質、ビトリファイド、サポートする穴のソリューションの 50 に 100 nm 厚のフィルムです。この薄い非晶質膜は電子顕微鏡で高真空に耐えるし、理想的なケースで、自然な状態での生物学的構造を保持します。プロシージャでは、生体試料の高解像度イメージを作成することができます。ただし、グリッドのサンプル保たれなければならない温度より低い温度で-150 ° C 失透を避けるためにすべての回で。それは低温ですが、コントラストのための比較的高い電子線量を使ってイメージ化されることし、信号対雑音比が低いにもかかわらず。したがって、コントラストを高める平均化技術を採用し、高解像度三次元 (3 D) 地図を再構築できるサンプルは、さまざまな角度からイメージを作成、提供。最もよく使用され、今の三次元再構成のための非常に成功したメソッドは単一の粒子のアプローチ。最近のレビューら18チェンを参照してください。
ネガティブ染色 TEM (NS EM) はスクリーニングと品質管理の重要なコントラストが必要な場合、またはサンプルの限られた量だけ利用可能な場合 (炭素膜への吸着は、一般的にサンプルを集中)。タンパク質立体構造の高解像度の 3 D 復元を目指した場合、単一粒子の低温電子顕微鏡がゴールド スタンダード方法です。
<img alt="マイクロマニピュレーション技術図;液滴蒸着、ナノ構造抽出、転写が含まれます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: 原則の TEM グリッド準備とクラシック (パネル A、B) とマイクロ アプローチ (パネル C、D) の比較。A)古典的な NS エマージング グリッド準備: 約 3 μ L のサンプルが (その後、「NS EM グリッド」と呼ばれる) 連続炭素膜で覆われている EM グリッド上に手で戻 (i)。約 10 のためのインキュベーション後離れて薄い水膜に吸着した分子を残して側 (ii) から余分な液体を消し去るため s、ろ紙を使用します。重金属塩溶液、例えば20, 2% の酢酸ウランのタンパク質の培養後、s (iii) と再び液体がろ紙 (iv) を使用する側からしみが付くことによって削除されます。最後に、EM グリッドは、空気の乾燥に残っています。B)クラシック Cryoem グリッド準備: サンプルの約 3 μ L、ホーリーファイバーの炭素膜に手で戻します。薄いサンプル フィルムを形成するには、余分な液体が紙あぶらとり顔の片側または両側 (ii) からによって削除されます。最後に、グリッドが急速に液体エタン ガラス化 (iii) のために急落しました。C) cryoWriter セットアップを使用して NS エマージング グリッド準備: A 5 nL ボリューム (i) マイクロキャピ ラリーを使用してサンプル素材から吸気です。サンプルはエアコン、マイクロキャピ ラリー チップはエアコン解決、例えば2% 酢酸アンモニウムに没頭しています。イオンや小分子拡散 (ii) で交換されます。マイクロキャピ ラリーの寸法は、全体のプロセスが拡散駆動型であることを確認注意してください。タンパク質は塩イオンよりも多くの低い拡散定数し、24が大幅に失われない。最後に、サンプルはグリッド上に分配される、(iii) を乾燥します。D) cryoWriter 法を用いた低温エマージング グリッド準備の原則: ホーリーファイバーの炭素膜で覆われて、EM グリッドを温度制御プラットフォームの表面に置かれ、ピンセットで開催。プラットフォームの温度は、グリッド環境の露点温度からのオフセットで制御されます。サンプルを含むマイクロキャピ ラリー基準グリッドを移動、それはグリッドの上のいくつかのマイクロメートルまでのマイクロキャピ ラリーを下げます。スパイラル パターンでステージを移動しながらその後、サンプルのいくつかの nanoliters を調剤しそれから余分な液体は再吸気 (i)。EM グリッド プライミング後、マイクロキャピ ラリーを撤回、グリッドは、蒸発するためにサンプル量を制御できるように短時間の温度制御プラットフォーム (その後露点 (DP) のステージと呼ばれる)。凍結急落、グリッドは急速にピンセット (ii) を使用して、ステージから撤退、垂直方向の位置に 90 度反転および寒剤お風呂 (iii) (' ピック プランジ ' メカニズムとその後呼ばれる) に突入します。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
残念なことに、彼らが発明されたので NS と低温電子顕微鏡用グリッドの作製法が大幅に改善しないしています。現在の欠点は、高いサンプル消費量 (1 mg/mL のタンパク質の約 3 μ L) とサンプルの大量 (&gt; 99%) を失った (図 1a, B)。さらに、低温電子顕微鏡用グリッドを準備するための古典的な方法は蛋白質のための過酷な手順: 最初に、それを含む、広範な顔に紙あぶらとりステップ (図 1B、ii) と、第二に、蛋白質は、空気-水界面にさらされています。21時間のかなりの量。ここでは、サンプルの前処理方法、試料グリッドと NS EM (図 1C) または 70S (図 1D) の後処理 (グリッドの乾燥またはガラス) が表示されます。"CryoWriter"と呼ばれる、社内構築されたセットアップ条件を吸引し、サンプル、回避紙完全にしみが付くことおよび薄いサンプルのための代替手段を提供することを分配する小型サンプル処理技術とマイクロ流体の原則を使用してください。CRYOEM。それは大幅サンプル消費を低減し、試料全体としてのユーザー コントロールを向上します。さらに、メソッドにより実験的応用;などの「単一のセルのビジュアル プロテオミクス」22,23,24,25と呼ばれる方法では個々 の細胞の生体成分の分離の準備。

<table><tbody><tr><td>リキッドハンドリング</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーチップ</td><td>新しい対物レンズ</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 & micro;mチップID、100&マイクロ;m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>シリカチップ 30 & マイクロ;mチップID、150&micro;m ID , pk. 20</td></tr><tr><td>導電スリーブ</td><td>New Objective</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>HVコンタクト用導電性エラストマー、長さ12インチ</td></tr><tr><td>溶融シリカチューブ</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP標準FSチューブ、150 & マイクロ;m ID、363 &micro;m OD、5メートル</td></tr><tr><td>PressFitコネクタ</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>は、Deact。PressFitコネクタ 内径0.25 → 0.25 mm (25 mm</td></tr><tr><td>シリンジ 10 & マイクロ;l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - ルアーチップ(針は含まれていません)&nbsp;</td></tr><tr><td>シリンジポンプコントローラー</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYSコントローラー</td></tr><tr><td>シリンジポンプ投与ユニット</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS投与ユニット</td></tr><tr><td><強>温度制御</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>露点センサー</td><td>メルテック</td><td>UFT75-AT</td><td>湿度・温度センサー、露点計算、USB、組み込みDLL</td></tr><tr><td>温度センサー</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>表面実装型温度センサー Pt1000</td></tr><tr><td>ペルチェコントローラー</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>定電圧出力のペルチェ駆動システムの活性化のためのPID温度コントローラ</td></tr><tr><td>ペルチェ素子</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>水冷ブロック</td><td>-</td><td></td><td>-40x40 mmペルチェ素子用水冷ブロック、銅ベース</td></tr><tr><td>ウォーターポンプ</td><td>Digitec.ch</td><td></td><td>294877 XSPC X20 750デュアル5.25ベイリザーバーポンプブラックV4</td></tr><tr><td>水熱交換器ブロック</td><td>-</td><td>循環</td><td>水を冷却するための2つのファンを備えた水熱交換器ブロック</td></tr><tr><td>小型ウォータークーラー</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ラム銅版 2 個</td></tr><tr><td>小型ペルチェ素子</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>レアード 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 >C、2個</td></tr><tr><td><ストロング>力学</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リニアステージ z軸</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>高負荷精密並進ステージ、50 mm移動範囲、DCモーター</td></tr><tr><td>ステージコントローラー ステージ</td><td>コントローラー Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>マーキュリーサーボコントローラー</td></tr><tr><td>顕微鏡 xy軸ステージ</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIL5</td><td>Zeiss Axiovert 200用電動ステージ倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>小型永久磁石</td><td>スーパーマグネテ</td><td>S-05-08-N</td><td>ロッドマグネット &Oslash; 5 mm, 高さ 8.47 mm, ネオジム, N45, ニッケルメッキ, pk. 10</td></tr><tr><td>小型電磁石</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>電磁石 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>コントローラー電磁石</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>電磁石制御基板</td></tr><tr><td>ソレノイドハブ</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke ソレニッドハブ 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>ミニピンセット</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>0302-M5S-PS</td><td>デュモン タイプ5 ミニ、超薄型チップ</td></tr><tr><td>各種オプトメカニカルパーツ</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Various mechanical parts</td><td>Workshop Biozentrum, University Basel</td><td>-</td><td>カスタム設計のアダプタープレート、ホルダーなど 添付のCADファイルを参照してください</td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザーダイオード</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm レーザーダイオードモジュール 2.5 mW</td></tr><tr><td>光検出器</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si 切り替え可能ゲイン検出器、320-1100 nm、2.4 MHz BW、100 mm2</td></tr><tr><td>EM grids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; TEM用窒化ケイ素膜、5</td></tr>ク<tr><td>ォンティフォイルCu 200メッシュのパック R 2/1</td><td>クォンティフォイルMicro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クォンティフォイルCu 200メッシュ R 1.2/1.3</td><td>クォンティフォイルMicro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>バッファー/ネガステイン</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp;シグマ</td><td>ダルベッコs リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>ネガティブ染色 バナジウムベース</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>ネガティブ染色タングステンベース</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB openBEB</td><td></td><td></td><td>openBEB 2フレームワークはリクエストに応じて利用可能で、バージョン3はダウンロード可能です</td></tr><tr><td>CryoWriter コントロールですソフトウェア(openBEBプラグイン)</td><td></td><td>ご要望に応じて、第三者のドライバーソフトウェアに追加料金がかかる場合があります。</td><td></td></tr></tbody></table>

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

最近の技術の進歩によりクライオ電子顕微鏡 (Cryoem) は急速に原子分解能するタンパク質複合体の構造解析のための標準的な方法となっています。ただし、蛋白質の分離技術と EM 試料作製法ボトルネックのまま。タンパク質の高分解能解析の単一粒子処理手法とマイクロ流体原則小型サンプルを作る EM アプローチでイメージを作成する必要があります個々 のタンパク質粒子の比較的小さい数 (数百万に 100,000)実現可能。
小型化、紙あぶらとり無料 EM グリッド法サンプル前処理、EM グリッド プライミングおよびサンプルのナノリットル ボリュームを消費するだけのポスト処理が表示されます。メソッドが調剤システムを使用して sub ナノリットル精度制御液体吸収と EM グリッド プライミング、プラットフォームと EM グリッドをピックアップ-・-プランジ-機構とサンプルの上の相対湿度を決定グリッド温度を制御します。ガラス化。Cryoem 温度制御ステージ上 EM グリッドに配置し、キャピラリーに試料を吸引します。キャピラリーの先端は、グリッド表面に近接して位置、サンプルにグリッドが読み込まれ、過剰は、マイクロキャピ ラリーに再吸引。その後、サンプル フィルムは安定し、若干結露点基準プラットフォーム温度のオフセットによって規制制御水蒸発による間伐です。特定の時点で急速に液体エタンのサンプル ガラス化のために発動を促された EM グリッドを転送する選択-プランジ機構がトリガーされます。サンプルご利用方法も、否定的な汚れ (NS) EM のナノリットル サイズ サンプル ボリュームを準備する利用できます。
方法論は大きくサンプル消費量を減らすし、従来で使用されるあぶらとり紙など蛋白質、潜在的に有害なアプローチを避けます。さらに、必要なサンプルのほんのわずかな量により高速サンプル エアコン、「visual プロテオミクス、」単一セル換散またはの定量分析のための「ロスレス」総試料との組み合わせなど、新規の実験的戦略複雑なサンプル。

楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual プロテオミクス解析を有効にするために持つことができます有害な結果を回避するため、必要な紙しみが付くことのステップはありません。

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

この方法は、限られた量のタンパク質しか利用できない高感度タンパク質の調製など、構造生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、標準的なサンプル調製方法と比較して、必要なサンプル量が微量で済み、厳しい紙のブロッティングステップが不要なことです。この手法の意味するところは、ビジュアルプロテオミクスによるシングルセル解析、またはタンパク質関連疾患の診断にまで及びます。私たちが最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、約100, 000個の個々の粒子で高解像度の構造を解く技術があったときでした。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているようにサンプルを準備します。次に、エタンカップ、クライオボックスホルダー、スパイダーを組み立てます。そして、極低温容器を液体窒素で縁まで満たします。数分後、カップは冷たくなり、液体窒素がなくなります。次に、エタンガスボトルを開け、ガスをゆっくりとエタンカップに流します。レベルが上部から2〜3ミリメートル下になるまで、カップに液体エタンを入れます。これには数分かかり、約5ミリリットルの液体エタンが必要です。スパイダーを取り外し、ポリスチロールの蓋を上に置き、クライオライターのマウントにクライオジェンコンテナを置きます。グロー放電したEMグリッドをクライオライターピンセットでつかみ、ピンセットを電磁石で結び、マイクロマニピュレーターをねじ込んでグリッドをステージ上に平らに合わせます。ソフトウェアに戻り、[grid_save]をダブルクリックします。次に、先端がグリッド表面から約10マイクロメートル上にくるように、マイクロキャピラリーの位置を調整します。マイクロキャピラリーがグリッド上をどこにも触れることなく、グリッド上を自由に移動できることを確認してください。そして必要ならば、マイクロキャピラリーを数マイクロメートル引き抜きます。次に、グリッドの中央に戻し、新しい位置をグリッドとして保存します。マイクロキャピラリーをホームポジションに戻します。次に、マイクロキャピラリーを数十ナノリットルのシステム液体で洗い流し、糸くずの出ない組織を使用してマイクロキャピラリーから滴を取り除きます。すべての準備が整ったので、マクロ・スクリプトを開始します。マクロは最初に所定の位置に移動し、5ナノリットルのシステム液体を分注して先端の気泡を取り除き、次にサンプル位置に移動します。次に、65ナノリットルのサンプルを吸引し、5ナノリットルをサンプルチューブに注入します。これにより、システムのバックラッシュが発生し、同期書き込みが可能になります。グリッド位置に移動すると、書き込みパターンが開始され、マイクロキャピラリーがグリッド上を移動し、同時に45ナノリットルのサンプルが分注されます。次に、マイクロキャピラリーをグリッドの中心に戻し、さらに10マイクロメートル下げて、余分なサンプル液を引き出します。最後に、マクロはマイクロキャピラリーを引き出し、電磁石をオフにして、プランジフリーズメカニズムを開始します。磁石から解放されたら、プランジャーから磁気アダプターを慎重に解放し、グリッドをエタンカップからクライオボックスを含むクライオジェンコンテナにすばやく移し、グリッドを空きスロットに配置します。まず、添付のテキストプロトコールに記載されているように細胞を調製し、インジウムスズ酸化物スライドを顕微鏡インサートにマウントします。2本のネジを使用してスライドをアルミニウムインサートに固定し、スライドの酸化インジウムスズコーティングと電気的に接地されたアルミニウムフレームとの間の電気的接触を確保します。次に、細胞培養培地をウェルから取り出し、300マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞を2回洗浄します。最後の洗浄後、細胞をエレクトロポレーションバッファーに保持します。次に、酸化インジウムスズスライドを保持しているアルミニウムインサートを生細胞インキュベーターステージのセットアップに置きます。顕微鏡を使用して、細胞培養物の位置を特定し、細胞がない領域を選択します。スライド面のマイクロキャピラリー先端に近づき、そっと触れます。次に、先端を100マイクロメートルで引き出し、位置を細胞として保存します。次に、すぐに細胞培養を離れ、マイクロキャピラリーチップを数十ナノリットルのシステム液体で洗い流し、再び細胞培養に入れます。PDMSウェルに浸漬している間に数ナノリットルを分注して、先端に気泡が閉じ込められないようにします。セルの位置をダブルクリックし、酸化インジウムスズスライドの表面にゆっくりと近づき、接触したら先端を10マイクロメートル後退させます。この時点で、溶解する近くの細胞を選択し、マイクロキャピラリーの先端を標的細胞の上に置きます。次に、シングルセル溶解のマクロスクリプトを開始します。開始すると、スクリプトは、細胞が正常に溶解された後にマイクロキャピラリーを移動する位置を求めます。EMグリッドの目的の位置(グリッドなど)を入力します。その後、マクロはユーザーの介入なしに進行し、細胞培養の顕微鏡ステージを左に100マイクロメートル移動させることから始まり、そこで標的細胞のスナップショットを撮影します。次に、15ナノリットルの二重蒸留水がマイクロキャピラリーチューブから分注され、高塩緩衝液を置換して希釈し、細胞に浸透圧を加えます。次に、ステージは戻り、先端を再び標的細胞の上に配置します。そこで、あらかじめ定義された電圧バーストが印加され、500ミリ秒後、ポンプシステムは毎分2マイクロリットルの流量で3ナノリットルのサンプルを吸引し始めます。最後に、ステージが再び左に移動し、セルを検査できるようになります。ユーザー入力を求めるウィンドウが表示されます。セルが成功した場合は、yesと入力して、溶解したセルのスナップショットを撮ります。その後、マイクロキャピラリーは内縁位置に移動し、リザーバー液に浸されます。マイクロキャピラリーをノズルの形状にもよりますが、8〜12分間浸しておきます。次に、5ナノリットルのコンディショニングされた細胞溶解物をグリッドに分注します。マイクロキャピラリーを引き出し、調整したサンプルを露点ステージでゆっくりと乾燥させます。最後に、グリッドをステージから取り外し、室温でグリッドボックスに保管します。ここに示されているのは、説明されているCryoWriterセットアップを使用した凍結サンプルの一般的なクライオ画像です。グリッドオーバービューでは、ガラス質の氷の周囲がはっきりと見えます。ガラス質の氷を含む穴の開いた炭素膜のあるグリッドスロットを詳しく調べると、ホワイトホールが見つかり、すべての穴がサンプルバッファーで満たされているわけではないことがわかります。炭素穴を含むサンプルの1つでは、バクテリオファージの尾部が詳細にはっきりと見ることができます。シングルセルビジュアルプロテオミクスを実行するためにセットアップされたCryoWriterを使用すると、個々のタンパク質、たとえば糸状アクチンやタンパク質が付着した膜パッチなどを見ることができます。パネル6bで見ることができる画像は、有機タングステン化合物に基づいて、2%ネガティブ染色で陰性染色されています。パネルcは、クライオ電子顕微鏡用に調製したシングルセルライセートを示しています。このビデオを見れば、ナノリットルの総量のタンパク質サンプルまたはシングルセル抽出物から、ネガティブステインまたはクライオEMグリッドを調製する方法を十分に理解できるはずです。液体エタンと窒素の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行して、安全メガネや白衣の着用などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

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透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

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