透過電子顕微鏡用小型サンプル準備
2018年7月27日
楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual プロテオミクス解析を有効にするために持つことができます有害な結果を回避するため、必要な紙しみが付くことのステップはありません。
この方法は、限られた量のタンパク質しか利用できない高感度タンパク質の調製など、構造生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、標準的なサンプル調製方法と比較して、必要なサンプル量が微量で済み、厳しい紙のブロッティングステップが不要なことです。この手法の意味するところは、ビジュアルプロテオミクスによるシングルセル解析、またはタンパク質関連疾患の診断にまで及びます。
私たちが最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、約100, 000個の個々の粒子で高解像度の構造を解く技術があったときでした。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているようにサンプルを準備します。次に、エタンカップ、クライオボックスホルダー、スパイダーを組み立てます。
そして、極低温容器を液体窒素で縁まで満たします。数分後、カップは冷たくなり、液体窒素がなくなります。次に、エタンガスボトルを開け、ガスをゆっくりとエタンカップに流します。
レベルが上部から2〜3ミリメートル下になるまで、カップに液体エタンを入れます。これには数分かかり、約5ミリリットルの液体エタンが必要です。スパイダーを取り外し、ポリスチロールの蓋を上に置き、クライオライターのマウントにクライオジェンコンテナを置きます。
グロー放電したEMグリッドをクライオライターピンセットでつかみ、ピンセットを電磁石で結び、マイクロマニピュレーターをねじ込んでグリッドをステージ上に平らに合わせます。ソフトウェアに戻り、[grid_save]をダブルクリックします。次に、先端がグリッド表面から約10マイクロメートル上にくるように、マイクロキャピラリーの位置を調整します。
マイクロキャピラリーがグリッド上をどこにも触れることなく、グリッド上を自由に移動できることを確認してください。そして必要ならば、マイクロキャピラリーを数マイクロメートル引き抜きます。次に、グリッドの中央に戻し、新しい位置をグリッドとして保存します。
マイクロキャピラリーをホームポジションに戻します。次に、マイクロキャピラリーを数十ナノリットルのシステム液体で洗い流し、糸くずの出ない組織を使用してマイクロキャピラリーから滴を取り除きます。すべての準備が整ったので、マクロ・スクリプトを開始します。
マクロは最初に所定の位置に移動し、5ナノリットルのシステム液体を分注して先端の気泡を取り除き、次にサンプル位置に移動します。次に、65ナノリットルのサンプルを吸引し、5ナノリットルをサンプルチューブに注入します。これにより、システムのバックラッシュが発生し、同期書き込みが可能になります。
グリッド位置に移動すると、書き込みパターンが開始され、マイクロキャピラリーがグリッド上を移動し、同時に45ナノリットルのサンプルが分注されます。次に、マイクロキャピラリーをグリッドの中心に戻し、さらに10マイクロメートル下げて、余分なサンプル液を引き出します。最後に、マクロはマイクロキャピラリーを引き出し、電磁石をオフにして、プランジフリーズメカニズムを開始します。
磁石から解放されたら、プランジャーから磁気アダプターを慎重に解放し、グリッドをエタンカップからクライオボックスを含むクライオジェンコンテナにすばやく移し、グリッドを空きスロットに配置します。まず、添付のテキストプロトコールに記載されているように細胞を調製し、インジウムスズ酸化物スライドを顕微鏡インサートにマウントします。2本のネジを使用してスライドをアルミニウムインサートに固定し、スライドの酸化インジウムスズコーティングと電気的に接地されたアルミニウムフレームとの間の電気的接触を確保します。
次に、細胞培養培地をウェルから取り出し、300マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞を2回洗浄します。最後の洗浄後、細胞をエレクトロポレーションバッファーに保持します。次に、酸化インジウムスズスライドを保持しているアルミニウムインサートを生細胞インキュベーターステージのセットアップに置きます。
顕微鏡を使用して、細胞培養物の位置を特定し、細胞がない領域を選択します。スライド面のマイクロキャピラリー先端に近づき、そっと触れます。次に、先端を100マイクロメートルで引き出し、位置を細胞として保存します。
次に、すぐに細胞培養を離れ、マイクロキャピラリーチップを数十ナノリットルのシステム液体で洗い流し、再び細胞培養に入れます。PDMSウェルに浸漬している間に数ナノリットルを分注して、先端に気泡が閉じ込められないようにします。セルの位置をダブルクリックし、酸化インジウムスズスライドの表面にゆっくりと近づき、接触したら先端を10マイクロメートル後退させます。
この時点で、溶解する近くの細胞を選択し、マイクロキャピラリーの先端を標的細胞の上に置きます。次に、シングルセル溶解のマクロスクリプトを開始します。
開始すると、スクリプトは、細胞が正常に溶解された後にマイクロキャピラリーを移動する位置を求めます。EMグリッドの目的の位置(グリッドなど)を入力します。その後、マクロはユーザーの介入なしに進行し、細胞培養の顕微鏡ステージを左に100マイクロメートル移動させることから始まり、そこで標的細胞のスナップショットを撮影します。
次に、15ナノリットルの二重蒸留水がマイクロキャピラリーチューブから分注され、高塩緩衝液を置換して希釈し、細胞に浸透圧を加えます。次に、ステージは戻り、先端を再び標的細胞の上に配置します。そこで、あらかじめ定義された電圧バーストが印加され、500ミリ秒後、ポンプシステムは毎分2マイクロリットルの流量で3ナノリットルのサンプルを吸引し始めます。
最後に、ステージが再び左に移動し、セルを検査できるようになります。ユーザー入力を求めるウィンドウが表示されます。セルが成功した場合は、yesと入力して、溶解したセルのスナップショットを撮ります。
その後、マイクロキャピラリーは内縁位置に移動し、リザーバー液に浸されます。マイクロキャピラリーをノズルの形状にもよりますが、8〜12分間浸しておきます。次に、5ナノリットルのコンディショニングされた細胞溶解物をグリッドに分注します。
マイクロキャピラリーを引き出し、調整したサンプルを露点ステージでゆっくりと乾燥させます。最後に、グリッドをステージから取り外し、室温でグリッドボックスに保管します。ここに示されているのは、説明されているCryoWriterセットアップを使用した凍結サンプルの一般的なクライオ画像です。
グリッドオーバービューでは、ガラス質の氷の周囲がはっきりと見えます。ガラス質の氷を含む穴の開いた炭素膜のあるグリッドスロットを詳しく調べると、ホワイトホールが見つかり、すべての穴がサンプルバッファーで満たされているわけではないことがわかります。炭素穴を含むサンプルの1つでは、バクテリオファージの尾部が詳細にはっきりと見ることができます。
シングルセルビジュアルプロテオミクスを実行するためにセットアップされたCryoWriterを使用すると、個々のタンパク質、たとえば糸状アクチンやタンパク質が付着した膜パッチなどを見ることができます。パネル6bで見ることができる画像は、有機タングステン化合物に基づいて、2%ネガティブ染色で陰性染色されています。パネルcは、クライオ電子顕微鏡用に調製したシングルセルライセートを示しています。このビデオを見れば、ナノリットルの総量のタンパク質サンプルまたはシングルセル抽出物から、ネガティブステインまたはクライオEMグリッドを調製する方法を十分に理解できるはずです。
液体エタンと窒素の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行して、安全メガネや白衣の着用などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。
概要
本記事では、ペーパーブロッティングの手順を必要とせず、透過型電子顕微鏡用にナノリットルサイズのサンプル量を調製する新しい手法を紹介します。この技術により、サンプルの損失が大幅に軽減され、ビジュアルプロテオミクスのための単一細胞溶解物の解析が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 構造生物学
- プロテオミクス
- 単一細胞解析
背景
- 従来の試料調製法では、多くの場合、大量の試料が必要となります。
- ペーパーブロッティングは、不安定なタンパク質に悪影響を及ぼす可能性があります。
- 本手法を用いることで、限られた量のタンパク質の解析が可能になります。
- 最小限の試料で高分解能構造を決定することができます。
研究目的
- 調製中のサンプル損失を最小限に抑える手法を開発すること。
- 単一細胞ライセートの分析を容易にすること。
- ビジュアルプロテオミクスを通じて、タンパク質関連疾患の診断を向上させること。
使用した手法
- クライオジェン容器内での試料調製。
- 正確な試料分注のためのマイクロキャピラリーの使用。
- 自動試料ハンドリングのためのマクロスクリプトの導入。
- 細胞溶解のための浸透圧の適用。
主な結果
- この手法により、サンプルの損失なくナノリットル量の調製に成功します。
- 単一細胞溶解物の効果的な分析が可能です。
- タンパク質の高解像度イメージングを実現できます。
- この技術は、タンパク質関連疾患の診断への応用が期待されます。
結論
- この革新的な手法により、不安定なタンパク質の研究が促進されます。
- これにより、プロテオミクスにおける単一細胞解析の新たな道が開かれます。
- ペーパーブロッティングを行わないことで、サンプルの完全性が向上します。
よくある質問
産業界における重要性
この手法は、ナノリットル単位の微量試料から高解像度のタンパク質解析を可能にすることで、構造生物学における重大なボトルネックを解消し、タンパク質の入手量が限られている状況でのターゲットバリデーションを直接的に支援します。ペーパーブロッティングを排除し、試料の損失を低減させることで、試料の完全性と再現性が向上します。これらは、信頼性の高いアッセイ開発および初期探索段階におけるメカニズムのデリスキングにおいて不可欠な要素です。また、単一細胞溶解との統合が可能であるため、ビジュアルプロテオミクスへの道が開かれ、表現型スクリーニングやバイオマーカー探索ワークフローにおけるcryo-EMの有用性が拡大します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 従来の方法では十分な量を単離することが困難な、低発現または不安定な標的タンパク質の構造解析を可能にします。
- 運用上の価値： サンプル消費量をマイクログラムスケールからナノグラムスケールまで削減し、貴重な試料を後続のアッセイに温存するとともに、重要な標的バリデーションキャンペーンにおける廃棄物を最小限に抑えます。
- 予測的価値： 最小限の投入量から高忠実度の構造データを提供することで、確信を持った標的のリスク低減をサポートし、リード化合物同定におけるgo/no-go判断を改善します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 単粒子クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）に適したガラス化試料を作製でき、アッセイ開発における結合親和性や構造ダイナミクスに寄与する定量的な構造解析を可能にします。
- 運用的価値： サブナノリットル精度の分注システムを使用することで、グリッド全体にわたる再現性の高い試料滴下を保証し、アッセイの標準化を支援します。
- 拡張性： マクロ駆動の自動化により、複数の試料を安定的に処理できるため、ロボットによる試料ハンドリングと統合することで、中スループットのスクリーニングキャンペーンを容易にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：表現型スクリーニングで同定されたバイオマーカーの構造的フォローアップを可能にし、ターゲットへの結合（target engagement）と原子レベルのメカニズムを結びつけます。
- メカニズム面でのリスク低減：大規模なタンパク質調製を必要とせず、疾患関連システムにおけるタンパク質複合体、翻訳後修飾、または変異の影響の可視化を促進します。
- 定量分析への適応性：本手法による「ロスレス（lossless）」な全サンプルの調製能は、複雑な混合物の正確な定量化をサポートし、バイオマーカーのバリデーションや薬物動態学的研究に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は創薬の初期探索段階に位置づけられ、構造的知見によるターゲットバリデーションを支援し、タンパク質ターゲットにおける生物学的不確実性を低減させることで、リード化合物の同定への進展を可能にします。
- 探索生物学：タンパク質標的の高解像度構造データを提供することで仮説検証をサポートし、限られた試料から結合部位やメカニズム的な機能を明らかにします。
- スクリーニング：標準化された試料厚さと氷質を備えたアッセイ準備済みのグリッドを提供し、後続のスクリーニングおよびヒット検証における信頼性を向上させます。
- アナリティクス：粒子分布、氷の厚さ、分子占有率などの定量的な構造出力を生成し、異なる条件間での客観的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：患者由来の試料や単一細胞ライセートから得られた疾患変異体またはバイオマーカー候補の構造解析を可能にすることで、前臨床研究へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：自動化されたマクロスクリプトと温度制御プラットフォームにより、複数のプロジェクトや治療領域にわたる構造プロテオミクスのための再利用可能なインフラストラクチャを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：標的の構造と機能に対する予測の信頼性を高め、メカニズム解釈における曖昧さを低減します。
- 運用的価値：手動ブロッティングによるばらつきを排除し、グリッド作成における再現性とスループットを向上させます。
- 戦略的価値：困難な標的の研究に対する障壁を下げ、プロテオームのより広範な探索を可能にし、過剰発現システムへの依存度を低減します。
- ポートフォリオへの影響：創薬パイプラインの早期段階で構造的なエビデンスを提供することで、リスク調整後の優先順位付けをサポートし、高価値標的への投資リスクを低減します。
実施上の考慮事項
- クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）の試料調製、マイクロ流体操作、およびマクロベースの自動化システムに関する専門知識が必要です。
- クライオジェン容器、エタンプランジシステム、温度制御ステージ、および精密マイクロキャピラリーディスペンサーを含む専用の装置に依存します。
- ランごとの試料のガラス化を一定にするため、環境制御（湿度、温度）の標準化が必要です。
- 異なる試料タイプ（例：膜タンパク質、複合体）への適応には、バッファー条件の最適化やブロッティングの代替手法が必要な場合があります。
- 実用上の制限として、危険物（液体エタン、窒素）の取り扱いと初期セットアップの複雑さが挙げられますが、トレーニング後は操作の簡便性が向上します。
