Name: 能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学ぶ C. elegans の機能的に活性な核抽出物の分離法とインビトロ転写系による可視化手法。このロバストなプロトコルは、遺伝子発現と調節の生化学的研究における新たな応用を可能にする。

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<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
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</ol>

著者らは開示する競合する利益を持っていません。

C.エレガンス は、その低コストのメンテナンスと遺伝子操作の容易さのために真核生物転写システムを研究する魅力的なモデル生物です。ここでは、L4 C. エレガンス からの機能的に活性な核抽出物を一貫して分離するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは転写活性の可視化に焦点を当てたが、転写後に産生されたcDNAをRT-qPCRを用いて定量化し、転写活性の測定をより正確に得ることができる8。核タンパク質を C.エレガンス から分離するこの方法は、真核転写機構の研究を拡大するのに役立ちます。 C.エレガンス は皿や酵母のコロニーの細胞の培養ではなく、むしろ自由ローミング動物であるため、核抽出物を分離して研究することは、転写機械が時間の経過とともに、または様々な環境でどのように変化する可能性があるかについてのより明確な洞察を与える可能性があります。これにより、研究者は C.エレガンス の低コストと回復力を利用することができます。 C.エレガンスは、他の モデル生物や細胞培養物とは異な...

小さくて自由に生きている線虫カ エノハブディティスエレガンス は、幅広い生物学的問題に取り組むシンプルでありながら強力なモデル生物です。1963年の導入以来、線虫は神経生物学、代謝、老化、発達、免疫、遺伝学1の質問に答えるのに非常に貴重なされています。理想的なモデル生物となる動物の多くの特徴のいくつかは、短い生成時間、RNA干渉の有効性、透明な身体、およびその細胞系統と神経系の両方の完成した地図を含む。
線虫の科学への貢献は膨大ですが、真核転写システムを解明するために十分に利用されておらず、酵母、フルーツフライ、哺乳類細胞培養からの核抽出物を用いた研究から得られたメカニズムに関する理解のほとんどが得ています。研究者が機能性核抽出物を抽出するのを妨げる最大のハードルは、線虫のタフな外キューティクルです。この外骨格は、架橋されたコラーゲン、キューティクリン、糖タンパク質、および脂質を含み、幼虫期から化学的または機械的な力を介したタンパク質抽出に耐性を持つC.エレガンスを作る3。C.エレガンス核抽出物を用いたインビトロ転写システムは、かつて開発されたが、システムの限られた範囲のために広く採用されておらず、抽出物を調製するためのDounceホモジナイザーの使用は、タンパク質不安定性につながる可能性がある4,5。
C.エレガンスを破るためにDounceホモジナイザーを利用した核抽出分離のための以前のプロトコルとは異なり、このプロトコルはバルチホモジナイザーを使用しています。Balchホモジナイザーは2つの主要なコンポーネントから成っている:タングステンカーバイドボールと一方の端から別の端に退屈チャネルを持つステンレス鋼のブロック。バルチホモジナイザーはタングステンカーバイドボールを積み込み、粉砕室を密封するために両側にキャップされます。シリンジは、粉砕室につながる2つの垂直ポートに積み込むことができます。材料が一方の注射器からもう一方のシリンジに粉砕室を通って渡されると、注射器からの圧力は、ボールとチャンバーの壁との間の狭い隙間を通って材料を強制します。この遅く、一定の圧力は、それが容易に狭いギャップを通過することができる一貫したサイズに達するまで材料を壊す。一定でありながら穏やかな圧力を介して狭い隙間を通ってC.エレガンスを強制すると、動物が開き、周囲の緩衝液に内容物が放出されます。ボールサイズの切り替えにより、ギャップがさらに引き締まり、新たに放出された細胞が破壊され、核がバッファに解放されます。遠心分離の複数のインスタンスは、細胞の破片の残りの部分から核を分離し、きれいな核抽出物の収集を可能にする。バルチホモジナイザーは、いくつかの理由からDounceホモジナイザーよりも好ましい:システムは、一度の試みで活性タンパク質の大量を抽出することが可能になり、動物の多数を処理することができます。ボールとスチールブロックの精密な加工は、複数のサンプル間で一貫した研削を可能にします。重い鋼ブロックはヒートシンクとして機能し、均一に研削室から熱を引き出し、変性を防ぎます。
単離後、核抽出物の転写活性は、生化学的実験で使用される前に検証する必要があります。従来、転写活性は、新たに合成されたRNAを追跡および可視化するために、放射性標識ヌクレオチドを用いて測定した。しかし、放射性標識は使用時および処分時に注意を要するため、負担が大きくなる可能性があります。技術の進歩により、研究者は定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)7などの技術を用いて、より有害でない、または面倒な方法を使用して、少量のRNA量を測定することができます。ここで、プロトコルは、幼虫期4(L4) C.エレガンス から活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系における転写活性を可視化する方法を説明する。

<table><tbody><tr><td>消耗品および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 8ストリップチューブ &フラットストリップキャップ、クリア</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>&nbsp;24-706</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 個別PCRチューブ</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp;24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL滅菌マイクロチューブ</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% 絶対分子グレード・エタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100%エタノール、Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp;V1001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL血清ピペット</td><td>VWRインターナショナル</td><td>&nbsp;89130-898</td><td></td></tr><tr><td>150 mmペトリプレート</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp;T3325</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカル遠心チューブ</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp;28-103</td><td></td></tr><tr><td>20 mLプラスチックシリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Norm-Ject シリンジ</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 真空フィルターカップ 0.22 & マイクロ;m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 血清学的ピペット</td><td>VWR international</td><td>&nbsp;89130-902</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清学的ピペット</td><td>VWR インターナショナル</td><td>&nbsp;89130-896</td><td></td></tr><tr><td>寒天、クライテリオン</td><td>VWRインターナショナル</td><td>&nbsp;C7432</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>・デンビル・サイエンティフィック</td><td>&nbsp;CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>耐アルコールマーカー</td><td>VWRインターナショナル</td><td>&nbsp;52877-310</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>VWRインターナショナル</td><td>&nbsp;90000-264<</td><td></td></tr><tr><td>em>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>二塩化カルシウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;C4901</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;C8667</td><td></td></tr><tr><td>制御 DNA テンプルクローニングプライマー、フォワード 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コントロールDNAテンプルクローニングプライマー、フォワード5'-aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;15508-013</td><td></td></tr><tr><td>DNAゲル染色剤、SYBR安全</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNAラダーミックス、O'遺伝子定規</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;SM1173</td><td></td></tr><tr><td>DNA ローディング色素、6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp;</td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNase、ベースライン-ZERO</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp;</td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌OP50株</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;A38</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;G6279</td><td></td></tr><tr><td>HeLa核抽出物in vitro転写系HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp;E3110</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Solution、1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 37%</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;P0662</td><td></td></tr>次<tr><td>亜塩素酸漂白剤</td><td>クロロックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;L3022</td><td></td></tr><tr><td>二塩化マグネシウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;M7506</td><td></td></tr><tr><td>ミディアムウェイトディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、ビスタビジョン</td><td>VWRインターナショナル</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>分子グレード水、ハイピュア</td><td>ハイクロンラボラトリーズ</td><td>&nbsp;</td><td></td>SH30538</tr><tr><td>ナイスタチン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;N1638</td><td></td></tr><tr><td>PCRシステム、プレミックスA Lucigenによるフェイルセーフ</td><td></td><td>&nbsp;</td><td></td>FS99100</tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;P39111リン酸</td><td></td></tr><tr><td>カリウム二塩基性</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;P3786</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>カリウム一塩基性</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;P0662</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤、Halt シングルユースカクテル 100x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質アッセイキット、Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp;Q33211</td><td></td></tr><tr><td>逆転写キット、Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>RNA 抽出キット RNeasy マイクロキット</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp;</td><td></td>N8080119</tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWRインターナショナル</td><td>&nbsp;BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;1-09137</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター、0.2 &micro;mポリエーテルスルホン膜</td><td>VWRインターナショナル</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>VWRインターナショナル</td><td>&nbsp;200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>転写プライマー、フォワード5'-gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>転写プライマー、リバース5'-cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>&nbsp;BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>ミリポアシグマ</td><td>&nbsp;P2287</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg;Cインキュベーター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &deg;Cインキュベーター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;Cインキュベーター</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C冷蔵庫</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg;C冷凍庫</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>三洋</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バルチ ホモジナイザー、アイソビオテック 細胞ホモジナイザー</td><td>アイソビオテック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ ボルテックス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機、エッペンドルフ 5418 R</td><td>エッペンドルフ</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機、VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡、Leica M80</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer、Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging system、iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp;A44241</td><td></td></tr><tr><td>ゲルシステム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機、Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-1000 XLS+、Pipet-Lite LTS</td><td>レイニン</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>ピペットL-10 XLS+、Pipet-Lite LTS</td><td>レイニン</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>ピペット L-200 XLS+、Pipet-Lite LTS</td><td>レイニン</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>ピペット L-20 XLS+、Pipet-Lite LTS</td><td>レイニン</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングプラットフォーム</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler、Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

カエノハブディティス・エレガンスは、1963年に導入されて以来、生物研究にとって重要なモデルシステムとなっています。しかし、C.エレガンスは、インビトロ転写やDNA複製などの核抽出物を用いた生物学的反応の生化学的研究に十分に利用されていない。生化学的研究でC.エレガンスを使用するための重要なハードルは、核抽出物の活性を犠牲にすることなく、線虫の厚い外側のキューティクルを破壊することです。ドオンス均質化や超音波処理など、キューティクルを壊すためにいくつかの方法が使用されますが、タンパク質の不安定性につながることがよくあります。インビトロ反応のために、活性核タンパク質を幼虫または成人C.エレガンスから単離するための確立されたプロトコルはありません。ここで、プロトコルは、バルチホモジナイザーを用いた幼虫ステージ4 C.エレガンスの均質化について詳細に説明する。バルチホモジナイザーは、圧力を使用して、その過程でキューティクルを壊す狭い隙間からゆっくりと動物を強制します。バルチホモジナイザーの均一な設計および精密な機械化は実験間の動物の一貫した粉砕を可能にする。バルチホモジナイザーから得られたホモジネートを分画すると、C.エレガンスの転写活性をアッセリングするインビトロ法で使用できる機能的に活性な核抽出物を得る。

概説されたステップに従って機能的核抽出物 (図1)を得る必要があり、粉砕または洗浄ステップの偏差は、不十分な活動または低い収率につながる可能性があります。機能的 C.エレガンス 核抽出物が得られた場合、先に説明した インビトロ アッセイに添加した場合に、DNAテンプレート上のCMVプロモーターの下流の領域を転写する。得られたRNA転写物は、従来の方法を用いて核タンパク質およびDNA鋳型から精製することができる。テンプレートDNAがなければ、逆転写およびその後のPCR産物は、核抽出物によって転写されたRNAの結果に過ぎない。PCR産物はアガロースゲル上で可視化することができ、DNAバンドの強度は核タンパク質およびRNA単離の品質を示し得る。弱いバンド強度は、熱または緩衝液調製不良のいずれかによって核抽出物の不活性化によって引き起こされる可能性がある。過度に強いバンド強度は、RNAの精製不良または不適切なDNase消化によるDNA汚染の結果である可能性があります。一貫した成功した...

ここでは、幼虫期 4C.エレガン スから活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系で転写活性を可視化するための詳細なプロトコルについて説明する。

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

このプロトコルは、C.elegansの生化学的研究のための技術的なギャップを埋め、モデル生物としての有用性を拡大します。この技術は、機能的に活性C.elegans核抽出物の一貫した分離を可能にする、シンプルで堅牢な両方です。まず、同期したL1動物を、大腸菌OP50を播種した10個の150ミリメートルの線虫増殖培地含有プレートに配置し、L4段階に達するまで摂氏20度で48時間成長させることから始めます。低張および高張バッファーを調製したら、70%エタノールで粉砕チャンバーをフラッディングすることにより、バルチホモジナイザーを洗浄します。その後、余分なエタノールを除去するために脱イオン水でチャンバーをすすぎ。タングステンカーバイドボールを粉砕室に挿入します。バルチホモジナイザーのバレルの端部をキャップし、付属のつまみねじでキャップを固定します。次に、テキスト原稿に記載されているように、サンプルごとに完全な低張りおよび高張性バッファーの5ミリリットルを調製する。次に、滅菌した2ミリリットルのシリンジに1ミリリットルの完全な低張性バッファーを充填し、バルチホモジナイザーの粉砕チャンバーを静かに洗い流し、チャンバーに約500マイクロリットルの完全な低張バッファーを残します。洗い流したホモジナイザーを氷の上に保管し、30分間冷まします。M9バッファーを持つ十分に供給されたL4動物を15ミリリットルの円錐管に集め、動物を1,000倍gで3分間遠心分離します。上清を取り除き、上清がはっきりするまで動物ペレットを洗浄し続ける。次に、3ミリリットルの冷たい低張バッファーで動物を洗浄し、再び遠心分離機を示した。上清低張バッファーを除去した後、動物のペレットに完全な低張バッファーの 1 ミリリットルを追加し、新しい滅菌、2 ミリリットルのシリンジに動物の懸濁液を転送します。氷の上に保管されている動物を均質化するために、タングステンボールを積んだバルチホモジナイザーの粉砕室を通して動物を静かに押し込みます。次に、動物を注射器に回収し、この手順を30回繰り返します。ホモジナイゼーションの30サイクル後、バルチホモジナイザーから最大の動物懸濁液を収集し、1.7ミリリットルマイクロチューブ内の下方に配置された先端を持つ注射器を保管します。タングステンボールを取り出し、脱イオン水で粉砕室を洗浄します。乾いて、それぞれのラベル付きチューブにボールを戻します。その後、直径7.9880ミリメートルのタングステンボールと12マイクロメートルのギャップクリアランスを粉砕室に挿入し、ホモジナイザーを再シールします。氷冷完全低張性緩衝液の1ミリリットルで再び粉砕室を洗い流します。実証したように、懸濁液を25回粉砕します。動物の懸濁液を清潔な1.7ミリリットルマイクロチューブに移し、懸濁液を氷の上に保管します。遠心分離によって動物の体と破片をペレットダウン。ピペット40マイクロリットルの上清を入力画分としてラベル付けされたチューブにし、その分画を氷の上に保存する。残りの上清をペレットを邪魔することなく新しい1.7ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を核にペレット化します。次に、ペレット核を乱さずに上清を、細胞質画分として標識された新しい1.7ミリリットルチューブに移します。核ペレットを洗浄するには、ペレットに500マイクロリットルの完全な低張度バッファーを加え、ペレットを懸濁し、遠心分離機を4,000倍の4°Cで5分間加えます。遠心分離の終わりに、500マイクロリットルの新鮮な完全な低張性緩衝液中の核ペレットを再懸濁し、サンプルを再び遠心分離する。その後、ペレットを完全な高トニックバッファーの 40 マイクロリットルに溶解します。核懸濁液を核分率とラベル付けされた新しい1.7ミリリットルのチューブに移し、氷の上に保管する。蛍光定量キットを使用して、3つの画分のタンパク質濃度を決定します。核分率を核タンパク質6マイクログラムを含む単回使用チューブにアリコートし、ドライアイスとエタノール浴で凍結する。さらに使用するまで、サンプルをマイナス80°Cで保管してください。代表的なゲル画像は、CMVプロモーターDNAテンプレートを用いたカエノハブディティス・エレガンスL4幼虫核抽出物の転写産物を示す。活性核タンパク質の分離に成功すると、インビトロ転写後に132塩基対バンドが発生し、分離が失敗すると、弱いバンドまたはバンドの不在が生じる。バッファー全体に明確なラベルを付けることを忘れないでください。不適切なバッファーは、核タンパク質の機能性を損なう可能性があります。また、タンパク質の変性を防ぐために、ホモジナイザー氷を冷たく保ちます。この技術を開発することで、研究者はストレスの多い条件下でのC.elegansのRNA転写速度を測定することができ、動物の転写速度は環境条件に応じて変化する可能性があることを示しました。

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

男性から精子を分離し、活性化するためのプロトコル...

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

このプロトコルは、のための合成のtRNA基質の調製を記載し...

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

マイクロアレイ解析はで遺伝子発現プロファイルを決定するために実施された...

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

ここでは、RNA /タンパク質相互作用を分析するためのプロトコルを提示する。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、ネイティブゲル電気泳動中のRNA /タンパク質複合体および遊離RNAの差動移動に基づいている。放射性標識RNAプローブを用いて、RNA /タンパク質複合体は、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。...

IRE / IRP例：RNA  - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

このプロトコルでは、線虫の体内の細胞運命変換中に細胞プロセスを研究する方法について説明します。観察することができます熱ショック プロモーターに駆動されるニューロン運命誘導転写因子チェ 1 過剰発現と神経細胞のリプログラミング クロマチン制御因子林 53 生殖細胞の RNAi による枯渇のトランスジェニック動物を使用して生体内で。<br...

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

変動が減少し、再現性を向上させるための解釈を容易にするための努力で同じサンプルからの蛋白質、DNA、RNA...

結合されたヌクレオチドおよび線虫のタンパク質抽出

ここで、トランスジェニック・カエオルハブ炎エレガンス線から緑色蛍光タンパク質を発現する生きている神経細胞の特定の群を単純に単離するためのプロトコルを提示する。この方法は、特定のニューロンに焦点を当てた様々なex...

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

この方法は、 カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスからのタンパク質抽出物調製と共免疫沈降

ここで提示されるのは、市販の組織キットを用いた1匹または数匹の動物からの Caenorhabditisエレガンス...

カエノラブディティス・エレガンスゲノムDNAの小規模抽出

カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給

学ぶ C. elegans の機能的に活性な核抽出物の分離法とインビトロ転写系による可視化手法。このロバストなプロトコルは、遺伝子発現と調節の生化学的研究における新たな応用を可能にする。

能動カエノハブディティス・エレガンス核抽出物の分離とインビトロ転写のための再構成

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能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

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