能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成
2021年8月11日
ここでは、幼虫期 4C.エレガン スから活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系で転写活性を可視化するための詳細なプロトコルについて説明する。
このプロトコルは、C.elegansの生化学的研究のための技術的なギャップを埋め、モデル生物としての有用性を拡大します。この技術は、機能的に活性C.elegans核抽出物の一貫した分離を可能にする、シンプルで堅牢な両方です。まず、同期したL1動物を、大腸菌OP50を播種した10個の150ミリメートルの線虫増殖培地含有プレートに配置し、L4段階に達するまで摂氏20度で48時間成長させることから始めます。
低張および高張バッファーを調製したら、70%エタノールで粉砕チャンバーをフラッディングすることにより、バルチホモジナイザーを洗浄します。その後、余分なエタノールを除去するために脱イオン水でチャンバーをすすぎ。タングステンカーバイドボールを粉砕室に挿入します。
バルチホモジナイザーのバレルの端部をキャップし、付属のつまみねじでキャップを固定します。次に、テキスト原稿に記載されているように、サンプルごとに完全な低張りおよび高張性バッファーの5ミリリットルを調製する。次に、滅菌した2ミリリットルのシリンジに1ミリリットルの完全な低張性バッファーを充填し、バルチホモジナイザーの粉砕チャンバーを静かに洗い流し、チャンバーに約500マイクロリットルの完全な低張バッファーを残します。
洗い流したホモジナイザーを氷の上に保管し、30分間冷まします。M9バッファーを持つ十分に供給されたL4動物を15ミリリットルの円錐管に集め、動物を1,000倍gで3分間遠心分離します。上清を取り除き、上清がはっきりするまで動物ペレットを洗浄し続ける。
次に、3ミリリットルの冷たい低張バッファーで動物を洗浄し、再び遠心分離機を示した。上清低張バッファーを除去した後、動物のペレットに完全な低張バッファーの 1 ミリリットルを追加し、新しい滅菌、2 ミリリットルのシリンジに動物の懸濁液を転送します。氷の上に保管されている動物を均質化するために、タングステンボールを積んだバルチホモジナイザーの粉砕室を通して動物を静かに押し込みます。
次に、動物を注射器に回収し、この手順を30回繰り返します。ホモジナイゼーションの30サイクル後、バルチホモジナイザーから最大の動物懸濁液を収集し、1.7ミリリットルマイクロチューブ内の下方に配置された先端を持つ注射器を保管します。タングステンボールを取り出し、脱イオン水で粉砕室を洗浄します。
乾いて、それぞれのラベル付きチューブにボールを戻します。その後、直径7.9880ミリメートルのタングステンボールと12マイクロメートルのギャップクリアランスを粉砕室に挿入し、ホモジナイザーを再シールします。氷冷完全低張性緩衝液の1ミリリットルで再び粉砕室を洗い流します。
実証したように、懸濁液を25回粉砕します。動物の懸濁液を清潔な1.7ミリリットルマイクロチューブに移し、懸濁液を氷の上に保管します。遠心分離によって動物の体と破片をペレットダウン。
ピペット40マイクロリットルの上清を入力画分としてラベル付けされたチューブにし、その分画を氷の上に保存する。残りの上清をペレットを邪魔することなく新しい1.7ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を核にペレット化します。次に、ペレット核を乱さずに上清を、細胞質画分として標識された新しい1.7ミリリットルチューブに移します。
核ペレットを洗浄するには、ペレットに500マイクロリットルの完全な低張度バッファーを加え、ペレットを懸濁し、遠心分離機を4,000倍の4°Cで5分間加えます。遠心分離の終わりに、500マイクロリットルの新鮮な完全な低張性緩衝液中の核ペレットを再懸濁し、サンプルを再び遠心分離する。その後、ペレットを完全な高トニックバッファーの 40 マイクロリットルに溶解します。
核懸濁液を核分率とラベル付けされた新しい1.7ミリリットルのチューブに移し、氷の上に保管する。蛍光定量キットを使用して、3つの画分のタンパク質濃度を決定します。核分率を核タンパク質6マイクログラムを含む単回使用チューブにアリコートし、ドライアイスとエタノール浴で凍結する。
さらに使用するまで、サンプルをマイナス80°Cで保管してください。代表的なゲル画像は、CMVプロモーターDNAテンプレートを用いたカエノハブディティス・エレガンスL4幼虫核抽出物の転写産物を示す。活性核タンパク質の分離に成功すると、インビトロ転写後に132塩基対バンドが発生し、分離が失敗すると、弱いバンドまたはバンドの不在が生じる。
バッファー全体に明確なラベルを付けることを忘れないでください。不適切なバッファーは、核タンパク質の機能性を損なう可能性があります。また、タンパク質の変性を防ぐために、ホモジナイザー氷を冷たく保ちます。
この技術を開発することで、研究者はストレスの多い条件下でのC.elegansのRNA転写速度を測定することができ、動物の転写速度は環境条件に応じて変化する可能性があることを示しました。
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概要
このプロトコルは、C. elegansの生化学的研究における技術的ギャップを埋め、モデル生物としての有用性を拡大します。機能的に活性のあるC. elegans核抽出物の一貫した分離と、in vitroシステムでの転写活性の可視化を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生化学
- 神経科学
- モデル生物
背景
- C. elegansは生物学研究において広く使用されているモデル生物です。
- 転写活性の理解は遺伝子発現を研究する上で重要です。
- 核抽出物の分離は様々な生化学的アッセイに不可欠です。
- このプロトコルは活性のある核抽出物を入手するための信頼できる方法を提供します。
研究の目的
- C. elegansから活性のある核抽出物を分離するためのプロトコルを確立すること。
- in vitroで転写活性を可視化すること。
- 生化学的研究におけるC. elegansの有用性を高めること。
使用した方法
- 同期したL1 C. elegansを線虫成長培地上で培養します。
- 動物は20度セルシウスでL4段階に発達するまで放置します。
- 抽出プロセス用のバッファーを調製します。
- 核抽出物の分離にはBalchホモジナイザーを使用します。
主な結果
- 機能的に活性のある核抽出物の成功した分離。
- in vitroシステムでの転写活性の可視化。
- 技術の堅牢性の実証。
- 遺伝子制御の研究における潜在的な応用。
結論
- このプロトコルは核抽出物を分離するための信頼できる方法を提供します。
- この技術はC. elegansの生化学的研究を強化します。
- 遺伝子発現と制御の研究に新たな道を開きます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical technical gap in leveraging C. elegans for biochemical assays, enabling consistent isolation of functionally active nuclear extracts. By overcoming cuticle disruption challenges without compromising protein activity, it expands the utility of C. elegans in target validation and mechanistic studies. The method supports predictive confidence in gene regulation research through reliable in vitro transcription readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulation pathways in a genetically tractable model.
- Operational Value: Provides reproducible nuclear extract preparation for target de-risking.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing of gene function prior to mammalian model investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields quantitatively measurable transcription activity using defined DNA templates.
- Operational Value: Standardized fractionation workflow ensures batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Enables scalable assay development for compound effect screening on transcription.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking of targets via direct measurement of transcriptional output.
- Operational Value: Connects genetic perturbations to biochemical phenotypes in a whole-organism context.
- Strategic Value: Informs target selection by validating pathway relevance in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, providing biochemically validated nuclear extracts that bridge genetic findings to functional assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through direct transcription measurement.
- Screening: Enables assay readiness for evaluating modulator effects on gene expression.
- Analytics: Generates quantitative band intensity data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by linking nuclear extract activity to regulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for nuclear extract preparation across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility in nuclear extract isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions through reliable biochemical readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional transcriptional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans culture and biochemical fractionation techniques.
- Dependent on access to a Balch homogenizer and temperature-controlled centrifugation.
- Necessitates standardized buffer preparation and protein quantification protocols.
- Involves adaptation considerations for different developmental stages or mutant strains.
- Limited by the need for careful homogenizer maintenance to prevent cross-contamination.
