IRE / IRP例：RNA - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

次の実験の全体的な目標は、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して、細胞抽出物からのRNAタンパク質相互作用を分析することです。これは、まず細胞または組織からタンパク質抽出物を調製し、別のステップで遺伝子特異的な無線標識RNAプローブを合成および精製することによって達成されます。次に、タンパク質抽出物を標識RNAプローブと混合して、特定のRNAタンパク質複合体の形成を可能にします。

最後に、反応生成物を非変性ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動によって分析します フリーRNAプローブは、そのより速い移動性によりRNAタンパク質複合体から分離されます。電気泳動移動度シフトアッセイは、RNAタンパク質相互作用の解析に広く使用されています。私たちは、鉄制御タンパク質であるIRP 1とIRP 2の標的RNA要素への結合を解析することができました。

しかし、この方法は、この手順が私の研究室のケイン博士フィリピン研究員と博士ニコールウィルキンソン博士、皿で成長した細胞を接着することによって行われることを示す他のRNA結合タンパク質の研究にも適用することができます。氷冷PBSで細胞を2回洗浄し、次に1ミリリットルの氷冷PBSを加え、プラスチック製の細胞スクレーパーで細胞を収穫します。ルーズセル懸濁液を新しい1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

チューブを予め冷却した摂氏4度のマイクロ遠心分離機に入れます。低速で5分間スピンダウンし、サップナタントを吸引します。細胞はチューブの底に白いペレットとして表示されます。

1,000万個の細胞を採取するごとに、100マイクロリットルの氷冷細胞質溶解バッファーを追加します。ピペッティングを数回上下させて細胞ペレットを緩め、懸濁液を氷上で20分間インキュベートします。これにより、細胞膜が可溶化され、すべての細胞質内容物がバッファーに放出されます。

可溶化した細胞質画分を単離するには、チューブを摂氏4度の遠心分離機で10分間全速力で回転させ、清澄化されたスナットを氷上の新しい1.5ミリリットルチューブに移し、ペレットを廃棄します。次に、得られた細胞質抽出物の総タンパク質濃度をBradfordアッセイを用いて決定します。得られた細胞質抽出物を小さなチューブに分注し、新鮮な組織から細胞質抽出物を生成するために使用するまで摂氏マイナス80度で保存します。

安楽死させた動物を解剖板の上の清潔なパッドの上に置くことから、収穫プロセスを開始します。ハサミで腹部を開きます。はさみと鉗子を使用して肝臓と脾臓を取り除きます。

組織の劣化を防ぐために、各組織を約50ミリリットルの氷冷PBSですすいでください。すぐに組織をメスで約1〜2立方ミリメートルの小片に遅滞なく切ります。ティッシュを新しいクライオチューブに入れ、スナップします。

サンプルを液体窒素で凍結します。凍結ティッシュは、必要になるまで摂氏マイナス80度で保管します。細胞質抽出物の作成を開始するには、以前に凍結した組織サンプルを、250〜500マイクロリットルの氷冷溶解バッファーを含む平底の2ミリリットルのチューブに移します。

ティッシュホモジナイザーの先端をチューブに入れ、中出力で装置の電源を入れます。10秒間の均質化後、タンパク質の変性を防ぐために、すぐにチューブを氷上に20分間置きます。細胞質画分を単離するには、チューブを摂氏4度の遠心分離機で10分間全速力で回転させ、清澄化した上清を氷上の新しい1.5ミリリットルチューブに移し、ペレットを廃棄します。

得られた細胞質抽出物の総タンパク質濃度をBradfordアッセイを用いて決定します。得られた細胞質抽出物を小さなチューブにアクアし、必要になるまで摂氏マイナス80度で保存します。プロトコルを続行する前に、プレキシガラスシールドガイガーカウンターを備えた放射線安全ワークベンチを設置してください。

サイトメトリーは、白衣のタグを監視し、適切な放射線専用鋭利物および非鋭利な廃棄物容器に取り付けます。まず、クローニングされた鉄応答エレメントを含む非直鎖化DNAプラスミドから始めます。テンプレートとして、テンプレート反応バッファー、部分放射性ヌクレオチド、およびRNAポリメラーゼを室温でピペットで混合することにより、20マイクロリットルのin vitro RNA転写反応を設定します。

RNA合成を開始するには、サンプルを摂氏40度で1時間インキュベートします。0.5モルEDTA pH 8.0の1マイクロリットルを添加することにより、in vitro転写反応を終了します。ピペッティングで上下させてEDTAを混合します。

次に、標準的なアルコール沈殿プロトコルを使用してRNA産物を精製します。まず、10マイクロリットルのTRNAと82.5マイクロリットルのpH 5.2の3モル酢酸ナトリウムを合成後の混合物とボルテックスに加えます。TRNAを混合すると、沈殿キャリアとして機能し、RNAを沈殿させるための最終RNA収量が増加します。

273マイクロリットルの95〜100%エタノールを加え、ボルテックスして混合します。チューブを室温で10分間ベンチに放置してRNAを分離し、沈殿反応を進行させ、室温遠心分離機でチューブを全速力で10分間スピンダウンします。ピペットで、上清を慎重に捨て、ペレットを邪魔しないでください。

沈殿したRNAは、チューブの底部近くに小さな白いペレットとして存在していてもよいし、肉眼では見えないとしてもよい。100〜500マイクロリットルの70%エタノールを加えてペレットを洗浄します。サンプルを室温で10分間全速力でスピンダウンし、蓋でスナットをデカントします。

ベンチ上でチューブを開いたままにして、RNAペレットを10〜15分間開封して乾燥させます。固体の放射性標識RNAを再構成するには、100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えます。放射性ヌクレオチドの取り込みの程度を定量化するには、RNA溶液を液体イオンカウンターEloquaに入れます。

無線標識されたRNAプローブは小さなチューブに注入され、必要になるまで摂氏マイナス80度で保存します。凍結アリコートは、電気泳動移動度シフトアッセイを開始する前に最大3週間使用でき、レーンあたりのサンプル量を増やすために、サイズが少なくとも16 x 16 cmの標準的な6%非変性アクリルアミドゲルを調製します。そして、このサイズのゲルの機械的安定性を高めるために。

少なくとも1ミリメートルの厚さのガラススペーサーとコームを使用してください。電気泳動移動度シフトアッセイを開始するには、以前に凍結した細胞質溶解物と放射線標識RNAプローブを眼で解凍し、実験のタンパク質成分を探します。25マイクログラムの細胞質抽出物を細胞質溶解バッファーで希釈し、最終総容量10マイクロリットルにします。

必要に応じて、1マイクロリットルの2 meストック溶液を混合物に加え、タンパク質サンプルを氷上に保ちます。RNA成分については、無線標識RNAプローブをヌクレアーゼフリー水で希釈し、マイクロリットルの熱あたり毎分200,000カウントでRNAを95°Cで1分間自然化し、溶液を室温で少なくとも5分間冷却します。タンパク質RNA結合反応を開始するには、1マイクロリットルの放射性標識RNAプローブをタンパク質抽出物に加え、室温で20分間結合させます。

電気泳動移動度シフトアッセイの特異性を高めるには、反応液に1マイクロリットルのヘパリンストックを添加します。放射性標識RNAプローブが60ヌクレオチドより長い場合は、さらに1マイクロリットルのRNAを追加します。結合反応を室温でさらに10分間継続させることで、特異性をさらに高め、RNAタンパク質複合体の分離を改善します。

3マイクロリットルのローディングバッファーとピペットを上下に添加して混合します。次に、反応全体を6%アクリルアミドゲルにロードし、ゲルを5ボルト/センチメートルで60分間泳動します。装置を適切な放射線遮蔽で覆ってください。

ゲル装置を分解し、大きな濾紙にゲルを移します。暗室でゲル乾燥真空装置を使用してゲルを乾燥させます。ジェルと濾紙の組み合わせをピースの上に置きます。

露光後のフィルムは、フィルムを現像し、風乾します。最適な露光時間は、1時間から一晩までさまざまです。I RRP 1およびI RRP 2の、鉄含有量が変動する組織培養細胞の放射性IREプローブに対する鉄依存性結合能を評価できます。

したがって、IRE結合活性は、以前にKで処理された鉄が枯渇した細胞において誘導され、後にデフェロキサミンが作られる。逆に、IRE結合活性は、以前に鉄負荷細胞でヘマンで処理された鉄負荷細胞では抑制されます。I RRP 1のIRE結合活性は、鉄硫黄クラスターの集合後に失われ、I RRP 2は鉄依存性の分解を受けます。

IRP Oneの鉄細胞クラスターは、細胞抽出物を2%two meで処理することにより破壊することができ、これによりその休眠中のIRE結合活性をモニタリングすることができます。I RRP 2の活動は、2人の私によって回復されません。この次の実験では、細胞鉄濃度の関数としてのI RRP 1およびIRP 2のIRE結合活性を、野生型I RRP 1ノックアウトマウスおよびI RRP 2ノックアウトマウスの新鮮な肝臓組織の状況で評価します。

このデータは、肝臓の鉄負荷を増加させることが知られている高鉄食をマウスに与えると、野生型マウスの肝臓抽出物中のI RRP 1およびIRP 2のIRE結合活性の低下が促進されることを示しています。I rrp 2つのIRE複合体は、I RRPの存在によって歪められます。それらは、I RRP 1ノックアウトマウスの肝臓抽出物で容易に視覚化されます。

ここでは、高鉄食はIRP2の完全な不活性化につながります。このビデオを見れば、電気泳動移動度シフトアッセイによるRNAタンパク質相互作用の解析方法について十分に理解できるはずです。RNAプローブの品質は成功に不可欠であることを忘れないでください。