で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

この手順の全体的な目標は、多数の表現型または代謝経路の根底にある遺伝子発現プロファイルを調査することです。これは、まず2つの対照的な線虫株からmRNAを単離することによって達成されます。手順の2番目のステップは、S SI 3またはSFIキャプチャ配列のいずれかを含むCD NAを合成し、それらをマイクロアレイにハイブリダイズすることです。

手順の3番目のステップは、マイクロアレイを、S SI 3およびSCIFIフルオロ4を含む抗捕捉配列とハイブリダイズすることです。手順の最後のステップは、マイクロアレイをスキャンし、magic toolソフトウェアなどのバイオインフォマティクスツールを使用してデータを分析することです。最終的に、調査中の生物学的現象を媒介する候補遺伝子が特定され、リアルタイムPCRなどの代替技術によって検証および定量化できます。

一般に、この方法に不慣れな個体は、斑点のあるヌクレオチドがユーザーに見えないため、均質なハイブリダイゼーション混合物を23, 000プラスに重ね合わせることが困難であるため、苦労します。独自に印刷されたヌクレオチド まず、健康な同期線虫からRNAを収集します。まず、15ミリリットルのチューブで洗浄され、ペレット化されたワームペレットは、7ミリリットルの0.1モル塩化ナトリウムと7ミリリットルの氷冷、体積ショ糖あたり60%の重量に再懸濁されます。

氷上で15分間インキュベートした後、ワームは再びペレット化されます。今、バクテリアフリーワームは泳ぎ上がり、集められ、RNAで洗浄され、遊離水でペレット化されます。再び、きれいで緩く圧縮されたペレットは、最高速度で30秒間回転したマイクロ遠心分離管に移されます。

吸引し、10 個の RNA に吸引し、後で摂氏 4 度で保存します。全RNAサンプルを調製するには、調製したペレットを最大速度で遠心分離し、スーパーナートを廃棄して、分子粉砕樹脂をひとつまみペレットに加えます。次に、乳棒を使用して液体窒素を使用して混合物を凍結します。

凍結したワーム懸濁液を微粉末広告、必要に応じて液体窒素に粉砕し、粉砕後に粉末を冷たく保ちます。抽出物を氷の上に5分間置きます。5分後、抽出物を700マイクロリットルのR-L-T-B-M-Eおよび合計472マイクロリットルの100%エタノールと混合します。

現在、市販のキットを使用して、生物学的サンプルあたり60マイクロリットルの単離RNAの最終容量までRNAを単離することができます。先に進む前に、DNAS Oneで処理して潜在的なゲノムDNA汚染を取り除き、続いて市販のRNAクリーンアップキットを使用してください。60マイクロリットルの容量をほのめかしてキットを完成させます。

最後に、RNA濃度を決定し、グリオキサールサンプルローディング、マイクロアレイハイブリダイゼーション前の色素およびゲル分析による処理によりRNAの完全性を評価します 従来の方法を使用して、精製されたRNAは相補的なDNAに逆転写され、市販のキットで分解されたテンプレートから精製され、60マイクロリットルの容量にほのめかされます。海の優雅さをブロックすることによってマイクロアレイハイブリダイゼーションを開始します。超音波処理されたサケ精子DNAを持つマイクロアレイスライド 1時間後、ブロックされたスライドを二重蒸留水で傾けて回転させます。

スライドをキムワイプで埋めた50ミリリットルの円錐形チューブで乾かします。次に、2つのx型アミドベースのハイブリダイゼーションバッファーを調製します。まず、55°Cに10分間温めて、結晶を完全に溶かします。

その後、10, 000 gで1分間遠心分離します。次に、25マイクロリットルのCD NAと25マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを混合し、混合物を穏やかにフリックします。次に、混合物を素早く回転させ、摂氏80度で10分間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドに触れずに、CDNAサンプル全体をマイクロアレイスライド上に慎重にピペットで移します。サンプルをマイクロアレイスライド上に均一に広げます。カバースリップが完全に下がる前に、シリンジ針を使用してカバースリップをスライド上に静かに下げ、針で再び上下に引っ張って、カバースリップを所定の位置にゆっくりと落ちさせます。

この技術により、気泡の形成が最小限に抑えられます。次に、スライドをスライドの下の50ミリリットルの円錐管に水平に置き、50マイクロリットルの二重蒸留水で、翌日摂氏37度で一晩インキュベートします。第2のハイブリダイゼーションは、スライドが洗浄された後に短時間行われる。

SSCで複数回、感光性捕捉試薬とAntifa試薬を含む2番目のバッファーを同じ手法で適用した後、短時間のインキュベーション、さらに洗浄、乾燥を行います。その後、スライドをスキャンできます。画像は、オープンソースの魔法のツールを備えたフリーソフトウェアを使用して分析できます。

[プロジェクト] タブで、ビルド式プロファイル タブで新しいプロジェクトを作成して保存し、[イメージ ペアの読み込み] を選択し、赤のイメージ ファイルを赤、緑のイメージ ファイルを緑として選択します。次に、ビルド式プロファイル タブを選択します。GCATのウェブサイトから取得したC elegance gene listファイルをアップロードし、マイクロアレイイメージのアドレス指定とグリッド化を行うには、load gene listを選択します。

「式プロファイルを作成」タブを選択し、グリッド編集オプションを作成します。次に、グリッドを編集します。グリッドの数に48、各グリッドに22行と22列を使用してダイアログボックスを設定し、スポットの番号を左から右、上から下に選択

コントラストの変化率を上げ、個々のスポットが簡単に区別できるようになるまでグリッドを拡大します。グリッドを作成するには、左側のパネルで [左上のスポットを設定] を選択し、左上のスポットの中央をクリックし、続いてグリッド 1 の右上のスポットと下の行をクリックします。このグリッディング手順を、左から右、上から下に進行する48のグリッドのそれぞれに対して繰り返します。

次に、[ファイル]タブを選択して保存し、現在のグリッドを一度保存したように保存します。[完了] タブを選択して、分析から無関係なスポットを削除します。「式プロファイルの構築」タブを開き、「アドレス指定」グリッド・オプションで「スポット・フラグ」を選択します。

次に、ストリークスポットまたは背景蛍光にフラグを立て、[現在のフラグを保存]を選択して保存します。[ファイル]タブと同様に、フラグが立てられたファイルはセグメント化する必要があります。最後に、特定の因子によって誘導または抑制された遺伝子を、発現タブの探索を選択して解析します。

探索ダイアログボックスで、細かい遺伝子の一致基準を設定します。2倍の数は、発現で増加または減少します。強度は x と呼ばれ、X の値は発現変化の基準です。

Xは、誘導された遺伝子の場合はXより大きい最大値で入力され、抑制された遺伝子の場合はxより小さい最小値で入力されます。この実験では、ステージ3およびステージ4の幼虫からの2つの独立した全RNA単離を緑色変異体対赤色野生型のいずれかとしてハイブリダイズし、一方、赤色変異体対緑色野生型のいずれかとしてハイブリダイズし、遺伝子発現変化を確認するために、3つの独立した全RNA単離を行い、同じ手順を用いて市販のキットを用いてCDNAを合成し、 また、各 CD NA サンプルに対して、3 つのハウスキーピング遺伝子をコントロールとして使用して、リアルタイム PCR とトリプリケートを実行します。デモンストレーションのために、VSM oneで誘導された遺伝子発現を調べる以下の結果。

AK1468変異体は、マイクロアレイ解析を行う前に、シナプス増強を特徴とする線虫株であり、抽出されたRNAの品質がゲル電気泳動を用いてチェックされる。dase 1処理の前後に2つの無傷のリボソームサブユニットが存在することは、マイクロアレイ内の良好なRNAサンプルを示しています。野生型CDNAは赤色で、VSM One変異体CD NAは緑色で標識されています。マイクロアレイごとに分析された48のグリッドのうちの1つでは、各小さな正方形が各アレイに印刷された1つのオリゴヌクレオチドを表し、各ユニークなオリゴヌクレオチドが表されています。

ステージ4の幼虫から単離された転写産物のマイクロアレイ解析により、主要な精子タンパク質またはMSPをコードする遺伝子がVSM 1変異体で誘導されることが示されると、ステージ3の幼虫のマイクロアレイ解析でも、変異体の同じ遺伝子ファミリー内での発現変化が明らかになります。テスティング。リアルタイムPCR解析によるマイクロアレイからの予測により、MS P遺伝子ファミリーMS P 32の1つのメンバーが、VSM one 変異体に誘導されていることが明らかになりました。このデータは、同じ RNA コレクションからのリアルタイム PCR の 3 回の繰り返しの平均を表しています。

このビデオを見た後、特に科学界が利用できる多くのオープンソースのバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムがあることを考えると、ゲノムワイド解析のためのバイオインフォマティクスツールの取り扱い方法をよく理解しているはずです。