Name: ラットモデルにおける乳癌予防のための乳管内エタノール焼灼治療のX線可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学ぶ乳癌予防のためのラット乳管樹へのエタノール焼灼溶液の乳管内注入法。ステレオ顕微鏡下で乳頭開口部に針を挿入し、マイクロCTまたは透視で可視化しながら上皮細胞を標的に治療する。エチルセルロース添加により溶液の拡散を抑制し、周囲組織への損傷を最小限に抑える。

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この研究は、LFSに対する国立がん研究所R21 CA226579およびR01 CA258314助成金、およびEMSへの国立生物医学画像生物工学研究所R01 EB029418助成金によって部分的に支援されました。MSU定量研究所(IQ)健康科学工学イメージングコア施設が、イメージングシステムと技術的専門知識を使用してくれたことに感謝しています。ビデオの内容と動物福祉ガイドラインの遵守に関する数値を確認してくれたダニエル・ファーガソン博士に感謝します。

記載されているすべての実験は、ミシガン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施されました。
1.拡張抗炎症治療
<ol><li>カルプロフェンの経口投与としてスクラロースゲルカップを準備します。70%EtOHのID注射を受ける2日前から手順の7日まで、ラットにこの抗炎症治療を提供します。</li>
	<li>カルプロフェンの作業溶液を滅菌PBSで希釈してカップに注射する。50 mg/mLストック溶液から、1%v/v滅菌青色食用色素で着色された希釈2 mg/mL溶液を調製し、各カップに500 μLを注入します。染料の添加は、カップのスクラロース内の薬物の完全な混合の視覚化に役立ちます。</li>
	<li>製造元の推奨に従って、カルプロフェンを追加するためのカップを準備します。ベンダーから特に指示がない限り、汚染のリスクを減らすために、カップを60°Cの水浴で15分間温め、取り外したら乾かします。<ol><li>スクラロースカップの蓋を70%EtOHで拭き取り、カルプロフェン作業溶液を含むシリンジの針を導入します。適切な容量(500 μL)を分注します。</li>
		<li>パンクをステッカーで覆います。カップを15秒間精力的に振ってから、そのカップをさらに15秒間渦の中に置きます。後で使用するために保管する前に、均質で完全な混合を視覚的に評価します。濃い青色の存在を探します。 注意: カップを室温に戻します。必要に応じてカップを室温で保管しますが、製造元からの薬効ガイダンスに注意してください。または、カップを4°Cで保管し、1か月以内に使用してください。ステッカーの日付を記入することは、ペンや鋭いマーカーが蓋に穴を開けるリスクなしに注射日を追跡するための良い習慣です。</li>
	</ol></li>
	<li>使用直前に、70%EtOHでカップの外側を拭き取ってください。カップを動物ケージに入れる前に蓋を外してください。カップは一日おきまたは空のときに交換してください。適切な投与量を確保するために、毎日ゲルのレベルを確認してください。.1カップで最大2匹のラットに最大2日間カルプロフェンを供給することができます。ただし、ラットはカップ全体をより早く消費する可能性があります。</li>
</ol>2.術前の準備
注意: 動物の準備ステップがID注射手順より2〜3日先行していることを確認してください。
<ol><li>イソフルラン気化器(2%-3%イソフルラン、1.5 L /分の酸素)をオンにして、ラットに麻酔をかけます。.動物を加温パッドの上のノーズコーンに移動します。ラットに目の潤滑剤を塗布し、動物を背中に配置します。動物の呼吸を注意深く監視して、麻酔面がイソフルランの1%〜3%に維持されていることを確認します。 注意: 電気かみそりを使用して、脱毛前に余分な毛皮を取り除くことができます。かみそりで乳首を傷つけないように細心の注意を払う必要があります。このため、この手順はスキップできます。ラットはマウスよりも脱毛クリームに敏感であるため、余分なクリームの除去は非常に重要です。脱毛による擦り傷がすでに存在する領域にエタノール含有溶液を注入することは避けてください。一部のクリームには、擦り傷の可能性を最小限に抑えるのに役立つアロエやラノリンなどの化合物が追加されています。</li>
	<li>コットンチップアプリケーターを使用して、市販の脱毛クリームを乳首領域に広げます。アプリケーターを使用して、クリームをその領域に10〜30秒間こすりつけます。毛皮がすぐに緩んだかどうかを確認します。<ol><li>クリームをラットにできるだけ短い間隔で放置し、皮膚のやけどを防ぐために完全に取り除きます。ラットはマウスよりもこの手順にさらに敏感です。</li>
	</ol></li>
	<li>10〜30秒塗布した後、ガーゼを温水で濡らし、それを使用してクリームと緩んだ毛皮を動物から洗い流します。新鮮な湿らせたガーゼでその領域を少なくとも3回すすぎ、最後のすすぎの後に乾いたガーゼで乾かします。毛皮が取り除かれた場所から乳首の領域への良好な視認性とアクセスを確認します。必要に応じて脱毛手順を繰り返します。</li>
	<li>ラットを加熱パッドの上のきれいなケージに入れ、回復させます。ラットをチェックして、麻酔から完全に回復していることを確認してから、永久ケージに戻します。</li>
	<li>抗炎症治療のために、カルプロフェンを投与した(1 mg /カップ)スクラロースゲルカップをケージに入れます。.ゲルの消費量を毎日チェックし、必要に応じて新しいカップと交換してください。カップを2日以上放置しないでください。通常、カップは1日後に交換する必要があります。</li>
</ol>3.管内注射
<ol><li>滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて19に記載のように333.3mMでTaOxストック溶液を調製する。粉末が完全に溶解しない場合は、溶液を温めます。穏やかにかき混ぜる。気泡の形成を避けるために、渦を巻いたり激しく振ったりしないでください。</li>
	<li>333.3 mM TaO x 3部と 100% EtOH 7 部を混合して、最終的な 70% EtOH 100 mM/TaOx 溶液にします。任意選択で、ゲル化剤として0.5%〜1.5%エチルセルロース(EC)の適量を添加して、アブレーション溶液の局所保持を最大化する。注入中の乳管樹への送達を目視検査するために、アブレーション溶液に1%v / v青色食用染料を追加します。</li>
	<li>実験のニーズに適したボリュームを準備します。腺ペア1(子宮頸部)と6(鼠径部)には最大100 μLの溶液を充填でき、他のすべてのペアは最大300 μLで充填できます。</li>
	<li>ステップ2.1のようにラットを麻酔し、完全に麻酔されたらラットをノーズコーンに移動します。両目に目の潤滑剤を塗り、動物を背中に置きます。必要に応じて、注射される乳首の近くにテープを使用して、ステレオスコープの下にラットを固定します。ラットの体重は、一般に、テーピングなしで実質的に動かないようにするのに十分です。</li>
	<li>注射用の乳首を準備するには、可能であれば、乳首の開口部を細かい先のとがった鉗子で覆っている死んだ皮膚を取り除きます。ラットは、乳首の開口部から突き出たプラグを持っていることが多く、取り外さないと乳首のカニューレ挿入の成功を妨げる可能性があります。 注:ラットで使用されているアブレーション溶液の注射量が多いと、注射部位の近くに表在性の皮膚創傷が生じる可能性が高いことに注意することが重要です。.このため、1回のセッションで他のすべての乳首を注射することは、隣接する乳首を注射するよりも動物への損傷と刺激が少なくなります。注射後7日間、ラットの擦り傷を監視することで、動物の引っかき傷による深刻な健康への影響がなく、ケージの床の破片による汚染による感染の可能性が導入されないようにすることができます。トリプル抗生物質軟膏またはクロルヘキシジン溶液による洗浄は、発生する可能性のある傷害感染の兆候を治療するために使用できます(表1)。</li>
	<li>33 Gの針が付いた500 μLのシリンジを使用して、101〜301 μLのアブレーション溶液を吸引します。カニューレ針を取り外すときに軽微な漏れを防ぐために、追加の1μLの溶液を吸引します。 注:これらは、乳管樹を完全に満たすことを目的とした量の推奨事項です:頸部腺と鼠径部腺で最大100μL、その他の腺で最大300μL。他のアプリケーションでは、小さいボリュームまたは大きいボリュームを使用するのが適切な場合があります。</li>
	<li>ピンセットを使用して乳首をそっと保持し、針を乳首の開口部にカニューレ挿入します。ベベルが乳首の中に完全に入るまで、針をそっと挿入し続けます。針を乳首に収めるには、針を乳首に押し下げるのではなく、乳首を針に向かって持ち上げます。(表1)。乳首の開口部の経路をたどるように注意してください。 注:ラットの乳首は、サイズが大きいため、一般的にマウスの乳首よりも操作とカニューレ挿入がはるかに簡単です。ただし、乳首開口部周辺の脂肪量が増えると、針が主管から外れた場合に誤って脂肪パッドを注入する可能性も高くなります。</li>
	<li>針のかさばが完全に挿入されたら、ラットに約100 μL / minの一定速度で溶液をゆっくりと注入します。.注入速度の急激な変化は、管の木を破裂または損傷する可能性があります。注入終了後30秒間待ってから、鉗子を使用して補助してカニューレの木から針を外す。これにより、注入された量が管樹内に留まり(図2)、漏れの可能性が減少します。</li>
	<li>画像に余分なコントラスト溶液を避けるために、湿らせたガーゼまたはEtOHワイプでこぼれた溶液を取り除きます。</li>
	<li>ID注射液にエタノールが含まれている場合、アルコール中毒の影響を軽減するために、5%ショ糖(10 mL / kg)を含むPBSを腹腔内に注射します。.この用量は、手順の開始時および終了時に投与することができる。</li>
</ol>4. マイクロCTイメージング
<ol><li>すべての所望の腺が注入された後、動物をマイクロCTシステムに素早く移動させ、組み込まれたイソフルラン気化器を使用して麻酔を維持し続ける。</li>
	<li>動物の背骨をまっすぐにし、各後肢を伸ばした位置にテープで留めて、動物の脚の骨が関心のある下部腺からさらに離れ、スキャンされた画像の関心領域と重ならないようにします。</li>
	<li>腹部を横切ってテープで留めて、下部腺をスキャンする場合の呼吸のアーチファクトを最小限に抑えます。 注:ラットの放射線の適切な許容生涯線量を決定し、累積線量がこのレベルを超えないように注意が払われる場合、動物はさまざまなスキャンパラメータ(高解像度、縦断スキャンなど)で画像化できます。放射線被曝は、スキャンを行わずに透視静止画やビデオを取得することでさらに低減できます(図2)。</li>
	<li>ラット乳管樹のTaOxイメージング を良好な解像度で実行し、次のスキャンパラメータを使用して標準(2分)取得スキャンを繰り返す機会があります:90 kVp/88 μA;視野 (FOV), 72 mm;スライス数、512;スライスの厚さ、72μm;ボクセル分解能、72 μm3。より長い期間(4〜14分)の高解像度スキャンは、同じパラメータを使用して縦方向にスキャンされない動物でも取得できます。</li>
	<li>データ取得後、ラットを麻酔コーンから慎重に離し、加熱パッド上の新しい清潔なケージに入れます。ラットをチェックして、麻酔から完全に回復してから、永久ケージに戻します。カルプロフェン含有スクラロースカップを置き、ステップ2.5の説明に従って適切に交換して、動物が次の7日間抗炎症治療を受け続けるようにします。.</li>
	<li>スキャンした画像をマイクロCTソフトウェア内ですばやくレンディション処理して、コントラストの漏れ、部分的な充填のみ、または過剰充填をよりよく理解します(図2)。</li>
	<li>次のセクションに進み、必要に応じて、公開用の正式な画像処理またはスキャンの詳細な分析を実行します(図3)。</li>
</ol>5. 画像解析
<ol><li>専用のソフトウェアパッケージを使用して、塗りつぶされたダクタルツリーのレンダリングを作成します。 注:注入された乳管樹の最良の表現を得るために、乳脂肪パッドをセグメント化することが最善です。スプラインは、このセグメンテーションを達成するために、動物の厚さ全体にわたって脂肪パッドの暗い境界をトレースします。</li>
	<li>対象の乳管ツリーが含まれているファットパッド(マウスとは異なり、このコンパートメントの境界は、同様のハウンズフィールドユニットのため、腹腔、大腿筋、および皮膚と簡単に区別できません)をセグメント化するには、手動メニューから「スプライントレース」オプションを選択することが、レンダリングを作成する最初のステップです。</li>
	<li>スプラインは、3 スライスごとにファットパッドの輪郭をトレースします。半自動メニューから[ オブジェクトの伝播 ]オプションをクリックします。これにより、すべてのスライスが伝播され、関心のある単一のセグメント化されたオブジェクトに接続されます。 注:セグメント化された領域内のしきい値を変更すると、ハウンズフィールドユニット(HU)の特定範囲内でのみ信号を視覚化できます。他の造影剤または画像パラメータについては、この範囲を調整する必要があるかもしれません。ソフトウェアパッケージまたは人工知能分析を使用して、他の測定値や画像を作成し、ダクトツリーがどれだけ満たされたかを示すことができます。</li>
	<li>しきい値ボリュームタブの下の半自動メニューで、HU値を下限300および最高点3,000に設定します。これにより、ダクトツリー内のコントラスト(TaOx)のみを表示するレンディションを作成できます。</li>
	<li>「表示」ボタンを使用してレンディションをプライマリとして設定します。これにより、ダクタルツリーの3Dレンディションのみを表示するように表示が変更されます。 注意: さらに分析するために、管樹の再建を実行します。</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここに示すように、70%のEtOHのID送達は、マウスにおいて周囲の間質および血管系への限定的な付随的損傷を有する乳腺上皮細胞を優先的に切除する4。乳管樹の局所切除は、マウスモデル4における腫瘍形成の防止に有効である。ここでは、この切除手順をラットにスケールアップできることを示します。
これは、高リスクの個人の乳がんの一次予防のための予防的乳房切除術への代替介入としてのこの切除手順の翻訳への道の次のステップです。切除溶液へのX線造影剤としてのTaOxナノ粒子の添加は、手順が乳管樹を完全に満たすことに成功したかどうかを判断できるため、腫瘍形成の予防における溶液の有効性を評価することを可能にする。蛍光透視法を使用して注射された乳腺を視覚化することは、このID手順を導くためにクリニックで行われる可能性が高いことを反映しています。溶液が乳管樹をどれだけ満たし、いつ注入を停止するかについての画像ガイダンスは、各管樹の最大充填を確実にするための臨床実施の重要な側面になります。トラブルシューティングと役立つヒントを表 1 に示します。この切除手順の有効性は、注入された溶液が細胞殺傷の速度を最大化するためにすべての上皮細胞と直接接触することを必要とする。1つまたは複数の樹木内の予備の上皮細胞は、最終的にBC発生の源として役立つ可能性があります。他のグループは、マウスにおけるウイルス粒子(例えば、Cre / LoxPおよび/またはCas9 / CRISPRシステムの成分)、ホルモンおよびホルモン拮抗薬(例えば、プロラクチン、フルベストラント)、化学療法剤(例えば、シスプラチン)、siRNAおよび/または抗体または他の標的剤のID送達を報告した4、19、21、35、36、37、38、39、40、 41,42,43,44,45、ラット21,33,46,47,48および/またはウサギ18,49,50,51,52,53.化学療法の局所送達のためのヒト乳房あたり最大8本の乳管樹のカニュレーションの成功は、独立した臨床試験で報告されています47,54,55。腫瘍予防を目的とした、または局所治療を目的としたこれらの他の溶液を注入するための画像ガイダンスは、同様にその有効性を最大化します。
マウスからラットの乳管樹へのこの手順のスケーラビリティと洗練がここで示されています。マウス4、19およびラット(未発表データ)乳管樹中のTaOxナノ粒子は、FDA承認のヨウ素含有X線造影剤を超える高解像度イメージングを提供する。同様に、我々は、TaOxに匹敵する解像度を提供することができるマウス40、41または他の動物モデル18における他の乳管樹画像化アプローチを認識していない。臨床翻訳に関連するのは、この中間サイズのラットモデルにおけるECのゲル化効果が、側副組織の損傷を最小限に抑えるための製剤の改良を可能にするという事実です。BCを予防する能力についてこの切除的ID手順を評価し続けると、化学的に誘導された他のラットモデルにおけるID送達後の画像によって提供される追加情報を通じて、BCがどの腺から発生するかをより正確に決定できるようになります。これらのデータは、この手順の安全性を判断し、部分的または失敗した処理された管の木がリスクの高い女性でBCを発症する傾向があるかどうかの懸念または欠点を特定します。

米国1の女性にとって、乳がん(BC)は引き続き最も診断されたがんの種類であり、肺がんを除く他のどの種類のがんよりも多くの死亡を引き起こします。2022年の予測では、51,400人の女性が上皮内癌と診断され、287,850人の女性が浸潤性癌と診断され、43,600人の女性がBC1で死亡すると推定されています。BCに関連する有病率と死亡率にもかかわらず、一次予防は連邦機関によって優先されていないため、一次予防と新規介入に関するトランスレーショナル研究に利用できる選択肢はほとんどありません2。予防的乳房切除術は、一次予防のための最も効果的な介入です。ただし、この手順は人生を変える結果をもたらす大手術であるため、リスクの高い個人にのみ推奨されます3。この手術では、発がんが発生する乳腺上皮細胞と正常な周囲組織を完全に除去します。個人は、身体的、心理的、社会的ストレスの悪影響のために、この手順を一次介入の最初の選択肢として使用することを思いとどまらせることがよくあります。これらの理由から、一部の高リスクの個人でさえ、この手順を受けず、代わりに注意深い待機または同様の監視戦略を選択することを選択します3。以前の発表では、マウスモデルの乳管樹への70%エタノール(EtOH)の直接送達は、隣接する正常組織への損傷を制限した乳腺上皮細胞を化学的に切除し、乳房腫瘍の形成を防ぐのに効果的でした4。EtOHは、いくつかの癌の局所治療のための切除剤または動静脈腫脹および奇形の局所治療のための硬化剤として、複数の臨床用途で使用されています5、6、7、8、9、10、11、12、13、14.EtOHの低い毒性および安全性プロファイルは十分に確立されており、いくつかの手順では、セッション50あたり最大55mLの95%EtOHを投与することができる5,10。
BCが発生する乳腺上皮細胞の完全な除去は、予防的乳房切除術および切除液の局所送達の両方の最も重要な要素である。したがって、アブレーション溶液がすべての乳腺上皮細胞と直接接触したことを保証するために、完全な乳管樹充填の確認が必要です。乳管樹内にソリューションを提供し、画像誘導透視法またはダクトグラフィによるその視覚化は、すでに存在する臨床手順によって可能です15,16,17。したがって、臨床試験でこの手順を容易に実装および評価することが可能になります。一次予防のための新しい介入としての管内(ID)アブレーションの有効性と翻訳の実現可能性を確立するための重要なステップは、このX線視覚化アプローチの実現可能性を実証することです 彼らの乳管樹構造のサイズと複雑さが増す動物モデル4,18,19。このアブレーション手順をマウス20からラットモデルにスケールアップするプロトコルをここで説明します。マウスとラットの乳管樹は同様の線状構造と分岐パターンを持っていますが、ラットの管の木は比例して大きく、はるかに密集した間質に囲まれています。私たちは実験室で、造影剤を含むアブレーション溶液を使用して、毎週の一連のセッションでラットのすべての乳腺を正常に注射する方法を実装しました。動物がEtOHの副作用を最小限に抑えるためには、セッション間隔が必要です(図1および図2)。この手順では、33 Gの針でイソフルラン麻酔をかけたラットの乳頭開口部にアブレーション溶液を直接注入します。手順のいくつかの重要な改善には、拡張された抗炎症治療の使用、提案された21よりも管の木あたりの大量の注入、および液体および気体用の気密注射器が含まれます。ID注射の48時間前から1週間後までの5 mg / kgのカルプロフェン(NSAID)による治療期間は、クリニックでの静脈奇形の硬化療法に使用される抗炎症プロトコルに匹敵します。.治療は全身麻酔下で患者に行われ、その後NSAIDなどの抗炎症薬が2日間投与されます。抗炎症治療は、局所炎症および潜在的な痛みを軽減するために、さらに数日間延長され得る13。マウス20と同様に、5%スクロース溶液の腹腔内注射は、ラットにおけるアルコール中毒の短期的影響を軽減する。ラットには、このスクロース溶液を投与した場合、1回のセッションで最大1 mLの70%EtOH(最大4つのダクト、血中の0.2 g / dLのEtOH含有量)を注射できます。動物はID注射後4時間以内に完全に回復します。4つ以上の腺および/またはより高いEtOH濃度を注入するときに十分な回復時間を確保するために、連続セッションを実行します。女性のアルコール中毒は、両方の乳房のすべての乳管樹のID注射としてはるかに可能性が低く、16のメインダクト16,17および2 mLあたり2 mL、70%のEtOHを使用すると、血中のEtOH含有量が0.1 g / dL未満になり、軽度の障害を引き起こす可能性があります。
X線イメージングにより、個々の腺で管内送達がどの程度成功しているか、および乳管樹全体が満たされているかどうかを判断できます(図1、図2、図3)。マイクロCTスキャンおよび/またはDICOMファイルデータの3D再構成の準備におけるリアルタイムの透視イメージングを使用して、乳管樹への溶液送達の程度および間質への漏れを評価することができます。透視法の使用は、動物に課せられる全体的な放射線量を制限するのに役立ちます。透視技術は、このアブレーション治療の画像ガイダンスのための意図された臨床応用により近い。FDA承認のヨウ素含有イソビューと酸化タンタル(TaOx)ナノ粒子との比較は、アブレーション溶液の有用性をさらに洗練するために行われている4,19。TaOxは、マウスにおける乳管樹の初期充填の可視化のためにIsovueよりも優れたマイクロCT造影剤であることが見出された4,19。ここでは、TaOxがラット乳管樹の初期充填を視覚化するのに適した造影剤であることを実証します(図2および図3)。トランスレーショナルリサーチおよび臨床診療アプリケーションの両方において、ゲル化剤エチルセルロース(EC)がEtOH溶液に添加され、意図された標的領域13、14、24、25、26、27、28、29からの拡散が最小限に抑えられている。研究によると、EtOHを含むアブレーション溶液に最大1.5%のECを添加すると、TaOxベースのイメージングと互換性があることが示されています(図3)。アブレーションソリューションのこれらおよびさらなる改良は、この画像誘導手順をクリニックにすぐに変換するのに役立つ可能性があります。

<table><tbody><tr><td>AnalyzeDirect&nbsp; v12.0</td><td>キャリパー</td><td>n/a</td><td>マイクロCT画像処理用</td></tr><tr><td>カープリーブ、カルプロフェン 50mg/mL</td><td>アリベット</td><td>50647</td><td>抗炎症治療用</td></tr><tr><td>エチルセルロース</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>9004-57-3</td><td>管内注射用</td></tr><tr><td>エバンスブルー</td><td>シグマ</td><td>E2129-50G</td><td>注射の可視化用</td></tr><tr><td>お湯バス</td><td>Toolots</td><td>Yidu_HH-S2</td><td>カープロフェンカップの準備用</td></tr><tr><td>MediGel スクラロースカップ</td><td>ClearH2O</td><td>74-02-5022</td><td>カープロフェンの配送用</td></tr><tr><td>モデル 1750 TTL、PTFE ルアーロックシリンジ、500&mu;L</td><td>ハミルトン</td><td>81220</td><td>管内注射用</td></tr><tr><td>Photoshop 2021</td><td>Adobe</td><td>該当なし</td><td>画像処理用</td></tr><tr><td>Quantum GX2 microCT イメージング システム</td><td>パーキン・エルマー&nbsp;</td><td>CLS149276</td><td>マイクロCT画像取得用</td></tr><tr><td>メタルハブニードル、33ゲージ、カスタム(30°C、斜角、0.4インチ、ポイントスタイル 4)</td><td>ハミルトン</td><td>7747-01</td><td>管内注射用</td></tr><tr><td>実体顕微鏡 SZMシリーズ</td><td>AmScope</td><td>SM-4TPZ-144</td><td>管内注射用</td></tr><tr><td>滅菌青色食用色素</td><td>マコーミック</td><td>930641</td><td>注射の可視化用</td></tr><tr><td>滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190250</td><td>溶液調製用</td></tr><tr><td>ステッカードット</td><td>サイエンティフィック</td><td>DOTSCI-C50</td>カル<td>プロフェンカップ調製用</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Calbiochem</td><td>8550-5KG</td>管<td>内注射用</td></tr><tr><td>シリンジフィ</td><td>ッシャー14-826-79</td><td></td>カル<td>プロフェンカップ調製用</td></tr><tr><td>ボルテック</td><td>スVWR</td><td>10153-834</td><td>カルプロフェンカップの準備に</td></tr><tr><td>保温ポンプ/パッド:</td><td>Braintree Scientific</td><td>HTP-1500 120V;AP-R 26E</td><td>肛門内注射/術前準備用</td></tr></tbody></table>

ラットモデルにおける乳癌予防のための乳管内エタノール焼灼治療のx線可視化

X-Ray Visualization of Intraductal Ethanol-Based Ablative Treatment for Prevention of Breast Cancer in Rat Models

乳がん予防のための一次介入の数はまだ限られている。乳がんを発症するリスクが高い女性にとって、最も効果的な介入は予防的乳房切除術です。乳がんの原因となる乳腺上皮細胞を周囲の組織とともに完全に除去する抜本的な手術です。このプロトコルの目標は、乳がん予防のための新しい主要な介入になる可能性のある低侵襲の膵管内処置の実現可能性を実証することです。この局所手順は、乳腺上皮細胞が悪性になる前に優先的に切除します。乳がんのげっ歯類モデルにおいて、これらの上皮細胞に直接溶液を送達する管内法が、ミシガン州立大学などで開発されている。ラット乳腺は、人間の乳房と比較してより単純で直線的な構造を持つ単一の管樹で構成されています。しかし、乳がんの化学的に誘発されたラットモデルは、新しい予防的介入の概念実証研究と、マウスモデルからヒトへのスケーラビリティのための貴重なツールを提供します。ここでは、X線造影剤としての酸化タンタルナノ粒子およびゲル化剤としてのエチルセルロースを含むエタノールベースのアブレーション溶液のラット乳管管樹への管内送達の手順について説明する。乳管内注射による水性試薬(例えば、細胞傷害性化合物、siRNA、AdCre)の送達は、マウスおよびラットモデルにおいて既に記載されている。このプロトコルの説明では、アブレーション溶液の送達に特有の方法論的変更と手順、アブレーション溶液の局所的および全身的な副作用を最小限に抑えるための製剤の考慮事項、および乳管樹充填の in vivo 評価のためのX線イメージングを強調しています。透視法とマイクロCT技術により、タンタル含有造影剤との適合性により、アブレーション溶液送達の成功と乳管樹充填の程度を判断することができます。

雌ラットの12個の乳腺のそれぞれには、乳頭開口部に開く単一の乳管樹が含まれています。マウスとラットのサイズの違いにもかかわらず、乳腺の発達タイミングとこれらの動物が成人期に達する時間は非常に似ています30,31。両方のげっ歯類種を代表するラットにおける乳腺発達の重要な段階の簡単な説明が提供される。終末芽(TEB)は、管分岐を指示する伸長管樹の先端にある高度に増殖する構造です30,31。TEBの増殖および密度のピークは、思春期発達における乳管樹の伸長期の3〜4週齢で発生する30。9〜10週齢までに、乳管樹が脂肪パッド30の全長を占めるように成長したため、TEBはほとんど残っていない。その後、乳管樹の成長と拡大は、脂肪パッドと動物32の成長と拡大に比例します。ヒト乳房の末端小葉ユニット(TDLU)は、げっ歯類のTEBと同様の役割を果たします。TDLUは、発がんの開始とBC33,34への進行の主な原因です。最大300 μLの70%EtOH溶液を注入して、9週齢のSprague-Dawleyラットの胸腺と腹部乳腺の乳管樹全体を満たすことができます(図1、図2、図3)。マウス20とは異なり、Sprague-Dawleyラットの頸部腺および鼠径部の乳首は、典型的には80%以上の動物への注射に適しており、乳管樹全体を満たすには最大100μLの70%EtOH溶液が必要です(図2)。私たちは定期的に最大10個の乳腺に研究中のアブレーション溶液を注射します。典型的な実験デザインは、2つの独立した毎週のID注射セッションで構成され、5つの交互の腺に、ゲル化剤としてX線造影剤および/またはECを含むアブレーション溶液を注入します(図2)。TaOx含有(50-200 mM)アブレーション溶液の場合、各セッションの終了後に透視および/またはマイクロCTスキャンを実行して、各管樹に部分的または全量の注入溶液を注入することの個々の成功を決定および記録します(図2)。注入後の即時および縦断的なイメージングにより、製剤の変化、特にECゲル化剤の濃度が、注入量の関数としてアブレーション溶液の外向きの拡散にどのように影響し、制限されるかを評価できます(図3)。この画像分析は、最小限の側副組織損傷で最大のアブレーションを達成するための最適なパラメータを理解するための情報を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig01.jpg"> 図1:ラットにおける膵管内注射と画像解析の手順の概略図。 膵管内注射と画像分析の段階的な手順が強調されています。詳しくは動画をご覧ください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig02.jpg"> 図2:乳頭カニュレーションの例と複数の乳腺へのアブレーション溶液の送達結果。 (A)Sprague-Dawleyラット系統における乳首形状の典型的な提示。乳首の長さは、カニュレーションが成功する可能性と相関しています。長い乳首は短い乳首よりもカニューレ挿入しやすいですが、過度に短い乳首や痕跡のある乳首はカニューレ挿入できません。カニューレ挿入されると、長い乳首と短い乳首の両方に溶液を注入し、同様の分娩成功率を達成することができます。注入された溶液中の青色食用色素は、管樹の充填および送達の成功のin vivo証拠として使用され得る(最も明白なのは、脂肪パッド注入の失敗に対するドーム形成)。画像取得(C)後に生成されたリアルタイムの透視法(B)および3DマイクロCTレンディションは、送達の成功のin vivo証拠と、TEBに到達する溶液のより定量的な評価を提供します。(B<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig03large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

乳癌の画像誘導予防治療のためのラット乳管樹への化学的切除液の送達のための手順が記載されている。乳腺上皮細胞は、乳頭開口部への直接カニューレ挿入および70%エタノールベースのアブレーション溶液の管内注入により、最小限の側副組織損傷で標的にすることができる。

ラットモデルにおける乳癌予防のための乳管内エタノール焼灼治療のX線可視化

There are still a limited number of primary interventions for prevention of breast cancer. For women at a high risk of developing breast cancer, the most ...

乳がんは、重篤な負の副作用を伴う予防戦略が限られている、一般的で致命的な病気です。副作用の少ない方法を提供するために、ラット乳管樹へのエタノールベースのアブレーション液を管内注射し、in vivoイメージングと乳がん予防を同時に可能にする技術を開発しました。これは、乳頭開口部に直接注射することで、乳副組織損傷を最小限に抑えて乳腺上皮細胞を標的化できるマウスでの以前の研究に基づいています。マウスとラットの両方が乳頭開口部に由来する単一の乳管樹を含む乳腺を持っています。ラットはマウスよりも大きく、アブレーションの成功を研究するために大量のエタノールを注射して、モデルのスケーラビリティを証明することができます。この方法の別の改良は、アブレーション溶液へのエチルセルロースの添加である。エチルセルロースは、標的とする領域からエタノールの拡散を減らすために、他の臨床アプローチで以前に使用されてきました。これは、化合物の性質によって達成され、組織内の液体に接触すると化合物がゲル化します。画像検証された乳がん予防のこの方法には、5つの重要なステップがあります。まず、実験室で調製したスクラロースゲルカップを利用して、動物にカルプロフェンを経口投与し始める必要があります。この拡張抗炎症治療は、手続きの前後に維持されます。.次に、乳首の周囲から毛皮を取り除き、脱毛クリームを注射して動物を注射する準備をします。次に、乳管内注射は、針挿入のための乳首開口部の視覚化を支援するステレオスコープを使用して実行されます。注射の成功を判断するために、注射後にマイクロCTまたは透視法によって動物をスキャンまたは評価します。次に、マイクロCTスキャンを処理して、注入された乳管樹の3D再構成を作成し、成功した充填をさらに分析することができます。ストックカルプロフェンは、最初にPVSで必要な濃度に希釈されます。カップのスクラロースへの薬物の完全な混合をよりよく確認するために、滅菌食用染料を混合物に添加してもよい。次に、カップを摂氏60度の水浴中で15分間加熱します。取り外し時にカップを乾燥させ、カップの蓋を70%エタノールで洗浄すると、汚染のリスクが軽減されます。カルプロフェン溶液は、蓋を突き刺すために注射器を使用してカップに直接注入することができる。この場合、望ましい結果を得るには500マイクロリットルを注入する必要があります。カップを15秒間振ってから、さらに15秒間ボルテックスする前に、ステッカーで穴を塞いでください。均質な混合は、濃い青の塊を探すことによって評価できます。その後、カップは必要になるまで冷蔵できます。動物は注射が行われる2〜3日前に準備されるべきです。吸入剤イソフルランを使用して動物を麻酔する。麻酔をかけたラットを加温パッドのノーズコーンに移します。ノーズコーンにいる間にラットにアイローションを塗布し、動物を背中に置きます。脱毛クリームは、綿の先端のアプリケーターで注入する予定の乳首の領域に適用できます。毛皮のより速い緩みは、所望の領域の動物の皮膚を横切ってアプリケーターを上下にこすることによって達成することができる。皮膚を火傷しないように、クリームをラットにできるだけ短い時間放置することが重要です。ラットはこの手順に対してマウスよりもさらに敏感です。10〜30秒塗布した後、ガーゼに温水を使用してクリームを完全に取り除きます。きれいなガーゼで皮膚を乾かす前に、3〜4回のすすぎを使用して完全に除去してください。毛皮除去の領域で良好な視認性と乳首へのアクセスを確認します。必要に応じて脱毛手順を繰り返します。ラットを加温パッドの上の清潔な回復ケージに入れて、麻酔から回復します。回復後、家のケージで準備されたラットにカルプロフェンカップを1つ与えます。吸入剤イソフルラン麻酔を使用して動物に麻酔をかけることから始め、完全に誘導されたらラットをノーズコーンに移動します。注射のために動物を背中に置く前に、目の潤滑剤を塗布する必要があります。注射されるが必須ではない乳首の近くの脚をテープで留めると便利です。希望の量の注射液で注射器を準備したら、可能であれば先端の細かい鉗子を使用して目に見える死んだ皮膚を取り除き、乳首を準備します。最も一般的な懸念事項は、乳首の開口部自体です。ラットはしばしば開口部から突き出たプラグを持っています。このプラグを取り外すと、カニューレ挿入を改善するのに役立ちます。針の斜角が見える状態で、先端の細い鉗子のガイダンスの助けを借りて、針を乳首の先端に挿入します。乳首の開口部の経路をたどるように注意してください。ラットの乳首は開口部の周りにより多くの脂肪を持っている傾向があるため、この脂肪に突き刺さりやすく、針の前進によりカニューレ挿入を達成したと誤って信じてしまいます。針のベベルが乳首に完全に囲まれたら、ゆっくりと溶液を注入し始めます。望ましい速度は、ラットで毎分約100マイクロリットルです。管樹への損傷を防ぐために、これよりも早く注入することは避けてください。完全に注射した後、鉗子の助けを借りて乳首から針を外す前に30秒待ちます。これにより、乳首からの漏れの可能性が低くなります。漏れが発生した場合は、湿らせたガーゼまたはエタノールワイプを使用して溶液をきれいにします。コントラストやこぼれた溶液は、取得した画像を歪める可能性があります。ここには、表示されたばかりの射出シーケンスの拡大ビデオが表示されます。動物の呼吸により、乳首を単一の焦点面に保つことが困難になることに注意してください。これにより、乳首が一定の場所に留まらないため、注射がより困難になる可能性があります。この問題は、胸郭と上位3つの腺ペアが近接しているために悪化します。ニップル開口部のプラグは、カニューレ挿入を改善するために取り外されました。針は、鉗子の助けを借りて乳首に進められるように斜角を向くことができます。ベベルが完全に挿入されると、注入を開始できます。乳首の左側を注意深く見ると、注射液が管の木を通して広がってわずかに見えるところに、青い色合いの増加に気付くかもしれません。これは、皮膚が厚いため、ラットでははるかに目立ちません。ここでは、注入が完了してから30秒後に針が除去され、結果として生じる溶液が乳首からこぼれるのを見ることができます。余分な溶液はきれいにされ、脂肪パッド注射を示す乳首や領域のドミングに外傷が見られない領域の評価が可能になります。エタノールを含む溶液を注射する場合は、アルコール中毒を避けるように注意する必要があります。これには、1回のセッションで注入できるエタノールの量を知り、その影響を打ち消すために手順中にスクロース含有溶液IPを投与する必要があります。注射後、動物は加熱パッド上の清潔なケージで回収されるか、注射成功の画像化のためにマイクロCTに移動され得る。注射した動物をマイクロCT装置に移動させた後、イメージング中の麻酔を維持するためにイソフルランの投与を続けます。ラットのサイズが大きくなると、良好な画像を得るために追加の位置操作が必要になります。画像化する部位の近くで脚をテーピングする前に背骨をまっすぐにすると、一貫した画像を生成するのに役立ちます。脚を伸ばした位置にテーピングすると、骨が画像の焦点になるのを防ぐことができます。また、ラットの腹部をテーピングすると、下腺の呼吸アーチファクトを減らすのに役立つこともわかりました。いくつかのスキャンパラメータは、管治療の視覚化のために許容される。ただし、パラメータを選択する際には、常に放射線量を考慮する必要があります。これらのスキャンから生じる放射線量は、特定の系統のラットの放射線制限を超えてはなりません。画像取得ではなく透視分析により、全体的な放射線負荷を大幅に軽減できます。すべてのスキャンまたは評価が行われたら、動物は加温パッドの清潔な回復ケージに戻すことができます。動物は完全に回復してホームケージに戻るまで監視する必要があります。カルプロフェンカップは、注射後少なくとも7日まで提供する必要があります。.私たちが使用するmicroCT装置のソフトウェアを使用すると、正式な分析なしで注入の成功を評価するための迅速なレンディションを作成できます。この機能には、合理的な信号対ノイズリダクションを可能にするシンプルなコントラストスライダーがあります。これらのレンディションの主な欠陥は、画像全体を同時にしきい値に設定する必要があることです。これにより、食事中の鉄など、明らかに管樹の一部ではない明るい信号を画像に残すことができます。場合によっては、ここに見られる真の信号は背景と同じくらい暗く、画像から簡単にしきい値を取り除くことができます。より正式なレンディションは、対象領域のセグメンテーションを可能にするより高度な解析ソフトウェアを使用して行うことができます。注入された乳管樹の最良の表現を得るために、さらなる画像処理のために乳脂肪パッドをセグメント化することが最善である。乳脂肪パッドの暗い境界は、このセグメンテーションを達成するために、動物の完全な厚さにわたってスプライントレースされ得る。3 つのスライスごとにトレースし、オブジェクトを伝播するだけで、私たちの経験ではダクト全体をキャプチャできます。この時点で、所与の怒りを用いてレンディションを閾値化し、乳脂肪パッド内に含まれるコントラストのみを表示することができる。これには、ダクタルツリー内のソリューションと、すぐ近くの漏れを含める必要があります。酸化タンタル溶液は、一般に300〜3000HUの範囲で良好に表示される。ダクタルツリーの再構築を作成したら、さらに分析を行うことができます。縦方向の画像化が望ましくない場合は、管樹の複雑な構造をよりよく捉える高解像度の画像を取得してもよい。動物間の違いは、注射を多かれ少なかれ困難にする可能性があります。現在、スプレイグ・ドーリーのラットのみを扱っているため、株から株への変動性について話すことはできません。一部の動物は、ここに描かれているような目立たない乳首を持っているため、カニューレ挿入を操作して成功させることが困難になります。他の人は、ここに示されているような、より高いプロファイルの乳首を持ち、カニューレ挿入により適しています。正常にカニューレ挿入された乳首がここに描かれています。カニューレ挿入が困難な場合、ここに示すように乳首に外傷を引き起こす可能性があります。注入直後のマイクロCT画像の取得は、注入の成功を研究者に知らせるだけでなく、特定の溶液の充填特性を特定するのに役立ちます。ここでは、100ミリモルの酸化タンタルによって提供される対照的に、70%エタノールを含む同じ量の切除液を注射した同じラットの腹部腺のさまざまな側面が見られます。示されている上部腺で使用された溶液には、1%エチルセルロースも含まれていました。管枝の端に壁のような構造が見えます。これらは、溶液で満たされ、こぼれない末端の芽です。一番下の行には、ダクタルツリーからの溶液の脱出を示す、あまり定義されていないダクタルエンドが表示されます。これは、組織学的検査におけるより限定的な付随的損傷とともに。乳管樹へのエチルセルロースを含む溶液のより良い保持を示すようです。この方法は、乳がん予防の低侵襲方法のスケーラビリティに向けた一歩を提供し、予防的乳房切除術の代替手段を提供します。より大きなげっ歯類モデルでの上皮アブレーションの成功は、動物への副作用を最小限に抑えて実証されています。アブレーション溶液にエチルセルロースを添加すると、注射領域への溶液の保持が改善され、巻き添え被害が減少します。臨床的に証明されたソリューションの斬新な使用と、一般的なイメージングモダリティで送達の成功を視覚化する機能を追加することで、すぐに臨床に翻訳することができます。

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