癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

このsiRNAスクリーニングプロトコールの目標は、遺伝子サイレンシングががん細胞株スフェロイドの増殖に及ぼす影響を調査することです。従来の二次元細胞培養技術と比較して、がんスフェロイドはin vivoで腫瘍に遭遇するものとより類似した状態を示します。この方法は、ヒトのがんで頻繁に変更される遺伝子の機能評価に有用であり、さらに重要なことに、三次元培養で見られるような複雑な培養条件下で、特に低酸素下で、どの遺伝子が潜在的ながん遺伝子または腫瘍抑制因子であるかを決定するために使用できます。

この技術の主な利点は、研究者が自分の好みの細胞株で関心のある特定の遺伝子を研究するために使用できるように、容易に適応できることです。これは、現在の標的sRNAスクリーニングアプローチに基づいていると考えています。一般的には、全ゲノム株ではなく、標的を絞ったスクリーニングにより、科学者が特定の疑問を投げかけ、より堅牢な結果を生み出すことができると評価されています。

私たちは、遺伝子サイレンシングがスフェロイドの生存率とサイズに及ぼす影響を分析しましたが、アポトーシスなど、別のスクリーニング読み出しに生体認証色素を使用することもできます。その手順を実演しているのは、当研究室のPatty Waiさんです。まず、siRNAライブラリーを含む96ウェルプレートを室温で解凍します。

次に、ベンチトップ遠心分離機を使用して、1, 000倍gで5分間回転させます。マルチチャンネルピペットを使用して、最適化されたトランスフェクション試薬を含む10マイクロリットルの還元血清培地を各プレートのウェルに加えます。15分間インキュベートして、siRNAを含むトランスフェクション複合体が形成されます。

他のスクリーニングパイプラインと同様に、トランスフェクション条件での細胞株のスフェロイド形成能力は、フルスクリーニングを実行する前に確実に最適化する必要があります。次に、スクリーニングする細胞がフラスコから分離するまでトリプシンします。細胞が分離したら、トリプシンを適切な量の細胞株特異的培地で中和し、遠心分離管に移し、ベンチトップ遠心分離機で1, 000倍gで5分間回転して細胞を収集します。

上清を捨て、ペレットを適切な量の培地を含む単一細胞懸濁液に再懸濁します。自動セルカウンターを使用してセルカウントを実行します。次に、懸濁液を冷たい培地で180マイクロリットルあたり5, 000細胞に希釈します。

細胞懸濁液をリザーバーに移します。180マイクロリットルに設定されたマルチチャンネルピペットを使用してピペットで細胞懸濁液を混合し、siRNAを含む96ウェルプレートに移します。予冷した摂氏4度の遠心分離機で10分間、プレートを1, 000倍gで遠心分離し、次に37°Cの組織培養インキュベーターでプレートをインキュベートします。

この時点で、セルはウェルの底にモザイクとして表示されます。24時間後、顕微鏡で細胞を観察します。この時点で、細胞を凝集させて、ウェルの中央に単一のスフェロイドを形成する必要があります。

各ウェルに100マイクロリットルの完全培地を加えて、インキュベーターに戻る前に成長を促進します。成長の3日後、各ウェルから100マイクロリットルの培地を静かに取り出し、100マイクロリットルの新鮮な培地を追加します。7日目に、顕微鏡でスフェロイドを検査し、その後、スフェロイドの成長を経時的に定量的に監視できるプレートリーダーでスフェロイドのサイズを定量化します。

スフェロイドのサイズを定量化するには、まずコンピュータでソフトウェアを開きます。96ウェルプレートを選択し、適切なプレートタイプを選択して、実験名を入力します。次に、スフェロイドを含む96ウェルプレートをベンチトップのマイクロウェルプレートイメージングサイトメーターに挿入します。

次に、Tumorsphere アプリケーションを選択します。画像ベースのフォーカスを選択して、回転楕円体にピントが合い、最適なコントラストが得られるようにフォーカスを変更します。スキャンが必要なウェルを選択し、スキャンを開始します。

次に、オブジェクトマスクが回転楕円体のサイズを正確に表していることを確認します。BT474 スフェロイドを 7 日間成長させる場合は、Precision を High に調整し、Colony Diameter の最小値を 200 ミクロンに設定します。Export機能を使用して、スフェロイド領域に統計的に有意な影響を与えるsiRNAを特定するために分析される注釈付きデータファイルの形式でデータをエクスポートします。

イメージング後、各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り出し、100マイクロリットルの発光生存率色素を添加して細胞生存率を決定します。プレートを15分間インキュベートした後、発光プレートリーダーを使用してプレートをスキャンします。このプロトコールは、他の癌細胞株との使用にも適合させることができます。

ノンターゲティングコントロールのリバーストランスフェクション手順は、試験したどの系統でも生存率に有意な影響を与えませんでしたが、陽性の細胞死滅コントロールであるユビキチンBのトランスフェクションは生存率を有意に低下させました。BT474細胞を200遺伝子のヒトsiGENOME siRNAライブラリーと三重に逆トランスフェクトしました。スフェロイドの面積と生存率が観察されました。

Z スコアが 1.7 を超える有意な外れ値が特定されました。スフェロイドの面積と生存率が大幅に増加または減少したSiRNAは青色で、赤色はコントロールのsiRNAを示しています。この一連の顕微鏡写真は、非標的コントロールであるE-Cadherin、PIK3CA、ERBB2、またはSF3B1 siRNAによる逆トランスフェクションの7日後のBT474スフェロイドの代表的な画像を示しています。

このヒストグラムは、各siRNAによる処理がリバーストランスフェクションの7日後に細胞生存率にどのような影響を与えたかを示しています。ERBB2およびPIK3CAのノックダウンは、コントロールと比較して細胞生存率を有意に低下させました。この画像は、スフェロイドを免疫染色に成功して、標的タンパク質に対する遺伝子サイレンシングの影響を明らかにすることができることを示しています。

習得すれば、1日で数百の遺伝子を複数の細胞株でスクリーニングすることができ、これにより、三次元培養での生存に重要な潜在的に新しい遺伝子を確実に同定することができます。このビデオを見れば、sRNAを介した遺伝子サイレンシングに適したがん細胞スフェロイドをうまく培養する方法を理解できるはずです。また、スフェロイドに対する免疫組織化学を行うことにより、遺伝子サイレンシングの影響を調査することもできます。

これにより、基礎となる生物学を知らせる貴重な空間情報を提供できます。