げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析
May 25th, 2022
単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。
このアプローチは、心不全の発症中の収縮機能の変化を検出します。神経ホルモンおよび潜在的な治療薬に対する筋細胞における機能的応答もスクリーニングすることができる。筋細胞の位置決めには練習が必要ですが、一貫したサルコメア長イメージングを得るために不可欠です。
手順を実演するのは、研究所の准教授兼主任研究者であるマーガレットウェストフォールです。実験を開始する前に、ゲルパックと培地をインキュベーター内で摂氏37度で30分間予熱します。原稿に記載されているように収縮機能プラットフォームコンポーネントの電源を入れ、チューブを蠕動ポンプに組み立てます。
次に、予熱したゲルパックをチューブホルダーに移し、細胞刺激装置の電源を入れて真空にします。メディアの入った50ミリリットルのチューブを断熱チューブホルダーに入れて、蠕動ポンプチューブを通して毎分0.5ミリリットルで灌流を開始します。次に、2ミリリットルの予熱培地を小さな計量ボートに加え、筋細胞を含むカバースリップ1枚を刺激チャンバーから計量ボートに移します。
刺激室を摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベーターに戻します。計量ボートからカバースリップを取り外し、下側をそっと拭いてから、グリースを塗りたてのカバースリップチャンバーに移し、カバースリップにメディアを一滴加えます。プラチナ電極マウントをカバースリップの上に置き、次に新しいカバースリップを鉗子で上部に置き、カバースリップサンドイッチの上にトップマウントを置きます。
2つまたは4つのゼロなべネジを取り付けて、チャンバーの組み立てを完了します。蠕動ポンプで、チューブ全体に媒体が存在する場合は、チューブを予熱器に取り付け、予熱器をカバースリップチャンバーに取り付けます。次に、毎分0.5ミリリットルで灌流を開始し、漏れがないことを確認するためにチャンバーの下にティッシュワイプを置きます。
カバースリップチャンバーを顕微鏡のステージアダプターに配置した後、加熱システムをオンにし、アセンブリを5〜10分間平衡化して、チャンバーの中央で摂氏37度の一定の媒体温度を達成します。真空システムに接続されたチューブを使用して、チャンバーの反対側の端に灌流された媒体が収集されるのを観察します。平衡化時間中に、40倍の水浸対物レンズで筋細胞を顕微鏡で可視化します。
ペーシング刺激装置をアクティブにするには、電圧を35〜40ボルトに設定し、刺激周波数を0.2ヘルツに調整して、収縮機能と筋細胞の生存を最適化します。サルコメア短縮トレースを収集するには、コンピューターでソフトウェアを開き、[OK]、[ファイル]、および[新しい]タブを選択します。トレースを選択して画面テンプレートを準備し、ユーザー制限とサルコメアの長さを編集します。
ファイルと新しいタブでサルコメアの長さのトレースを記録し、収縮筋細胞を特定し、筋細胞をカメラの縦軸に沿って配置して、線条パターンが垂直になるようにします。コンピューターのマウスを使用して、関心領域またはROIボックスを筋細胞の上に配置します。収集を選択して収縮機能の記録を開始します。
0.5ヘルツの低刺激周波数で各筋細胞から60秒間の短縮を記録します。カバースリップごとに5セルから10セルに短縮するサルコメアを記録します。周波数範囲の短縮を測定するには、各周波数に筋細胞を配置して、記録前に定常状態の短縮を取得します。
灌流速度を2倍にし、刺激後15〜20秒で0.2〜2ヘルツの範囲の新しい周波数で記録を開始し、所定の範囲の刺激周波数にわたって短縮するためにカバースリップごとに2つ以下の筋細胞を記録します。セルごとに少なくとも7つの収縮を記録して、信頼性の高い信号平均データを取得します。ファイルを選択し、記録されたトレースを選択して、[開く] を選択します。
基本トレースのタブ 1 を選択し、トレースの上部にある黄色のパネルを設定して、sarc の長さを取得します。操作単調過渡解析オプションとTTLイベントマークを含む解析テンプレートを、メニューから必要なオプションの[T Zeroの定義]ボックスに用意します。テンプレートを選択してこれらの解析オプションを保存し、解析テンプレートを識別子とともに保存します。
各トレースを分析する前に、分析テンプレートをロードします。データを解析するには、マークを選択し、ゲートし、過渡値を追加してから、イベントマークと解析範囲から変換します。0.2ヘルツでペースを合わせた筋細胞の時間範囲をマイナス0.01秒から1.20秒に設定します。
より高い周波数で刺激された筋細胞については、より短い時間範囲を選択します。操作と平均イベントを選択して、元のベーストレースの下に平均化された信号記録を生成します。次に、信号平均トレースのタブ1を選択し、上部メニューのマークに移動してから過渡を追加し、操作と単調過渡解析を選択して、ベースラインサルコメアパラメータの信号平均値を信号平均表示パネルに表示します。
単調過渡解析とクリップボード電流をエクスポートし、複数の筋細胞の複合解析のために非定常サルコメア解析をスプレッドシートに転送します。信号平均トレースをコピーするには、エクスポート、現在のトレース、クリップボード、オプションの順に選択し、小数点以下の桁数を5に設定します。タブ区切り文字を選択し、[OK]をクリックします。
各筋細胞のシグナル平均トレースを2番目のスプレッドシートに記録します。この研究は、圧力過負荷またはPOが、偽群と比較して筋細胞の収縮機能を低下させることを示した。しかし、心筋トロポニンIT144DまたはcTnIT144Dの遺伝子導入から4日後、PO筋細胞の収縮能力は偽レベルに戻り、筋細胞の機能が回復する可能性があることを示しました。
初期の研究では、cTnIT144Dの遺伝子導入は、CTnIと比較してピーク短縮と拡張期カルシウムレベルの上昇を促進しました。心筋細胞の位置の微調整は、明確な短縮痕跡を得るためにしばしば必要とされる。このプロトコルは、Fura-2 AMなどのカルシウム感受性蛍光色素を負荷した心筋細胞に対して実行して、短縮に加えてカルシウム過渡現象を検出することもできます。
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概要
この記事では、サルコメア長検出とカルシウム暫定測定を通じて、分離されたラットの心筋細胞における収縮機能を測定するプロトコルを紹介します。これらの方法は、動物モデルにおける心不全の研究に適用可能です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 心血管生理学
- 細胞生物学
- 心不全研究
背景
- 収縮機能は心臓の性能にとって重要です。
- カルシウム暫定は筋肉収縮において重要な役割を果たします。
- 分離された心筋細胞は研究のための管理された環境を提供します。
- 心不全は収縮機能とカルシウム処理に影響を与えます。
研究の目的
- ラットの心筋細胞における収縮機能を測定すること。
- 神経ホルモンと治療薬の影響を評価すること。
- サルコメア長の一貫したイメージングのためのプロトコルを確立すること。
使用した方法
- 実験のためのラットの心筋細胞の分離。
- サルコメア長とカルシウム暫定の測定。
- 収縮機能プラットフォームの使用。
- 最適な条件のための培地とゲルパックの予熱。
主な結果
- 心不全中の収縮機能の変化を実証しました。
- 神経ホルモンと潜在的な治療法への反応を特定しました。
- 心筋細胞イメージングのための信頼できる位置決め技術を確立しました。
- 心臓機能の将来の研究のための枠組みを提供しました。
結論
- これらのプロトコルは心筋細胞機能の詳細な研究を可能にします。
- 研究結果は心不全メカニズムの理解に貢献します。
- 将来の研究はこれらの方法に基づいて治療法の開発を行うことができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of contractile dysfunction and Ca2+ transients in rodent myocytes provides critical mechanistic insight for early-stage cardiac target validation and de-risking. This methodology enables direct comparison of functional alterations in disease models and therapeutic interventions, supporting predictive confidence in translational cardiac research. Integrating these cellular assays into discovery pipelines enhances portfolio decision-making for cardiovascular drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac contractile mechanisms and pathway involvement in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying functional restoration after genetic or pharmacological intervention.
- Facilitates predictive confidence in target selection through direct measurement of myocyte response.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary myocyte systems for downstream compound screening workflows.
- Standardizes sarcomere length and Ca2+ transient measurements for reproducible quantitative outputs.
- Enables reliable evaluation of candidate therapies on contractile function and calcium handling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular functional readouts with disease-relevant cardiac injury and remodeling models.
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical validation of therapeutic efficacy.
- Provides mechanistic de-risking for translational biomarker development in cardiac research.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling functional assessment of cardiac myocytes under controlled conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on contractile dysfunction and calcium signaling in disease and intervention models.
- Screening: Delivers standardized, reproducible contractility and Ca2+ transient data for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative sarcomere and calcium readouts for robust statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects cellular functional outcomes to preclinical cardiac injury models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac functional analysis across multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability for cross-study comparisons.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust functional endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac programs based on quantitative functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary myocyte isolation and functional imaging techniques.
- Demands specialized instrumentation for sarcomere length detection and Ca2+ transient measurement.
- Necessitates cross-team standardization of data acquisition and analysis protocols.
- Adaptable to multiple rodent species and cardiac injury models with protocol adjustments.
- Dependent on precise myocyte positioning and consistent pacing for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:40
Contractile Function Analysis of Adult Rat Cardiac Myocytes
4:20
Data Analysis of Contractile Function in Isolated Myocytes
6:18
Results: Contractile Function in Cardiac Myocytes in Response to Pressure Overload (PO) and Gene Transfer
6:59
Conclusion
