Name: げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶ心不全モデルにおけるラット筋細胞の収縮機能とカルシウム一過性の測定法。サルコメア長検出と蛍光イメージングを用いて神経ホルモン応答や治療薬効果を評価し、心機能メカニズム解明に貢献します。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 HL144777(MVW)によってサポートされています。

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<li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+basis+of+Starling%27s+law+of+the+heart%3A+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li>
<li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li>
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著者には、競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません。

ステップ1で概説した慢性ペーシングプロトコルは、単離された筋細胞を研究し、より長い治療の影響を評価するための有用な時間を延長します。私たちの研究室では、慢性ペースの筋細胞のサルコメア長を使用して収縮機能を測定すると、分離後4日まで一貫した結果が得られました。しかし、筋細胞の収縮機能は、筋細胞のペースを合わせるために1週間以上経過した培地を使用すると急速に悪化します。
収縮機能研究の場合、データはラットの体温に近い37°Cで収集されます。筋細胞の生存率を最適化し、各筋細胞の一貫した痕跡を得るために、これらの実験は、ラットの生理的心拍数~5Hzよりも低いペーシング周波数で実施されます。これらの設定は一貫した収縮機能データを生成しますが、短縮トレースが同じ治療グループの筋細胞を含む複数のCS間で一貫している場合は、チャンバー温度および/またはペーシング頻度を調整できます。さらに、ブレブがなく、CSに完全に接着し、棒状細胞の両端で収縮する筋細胞を選択することによって、最適な結果が得られます。片端のみに付着した細胞、複数のブレブを有する細胞、および/または片端のみで収縮する筋細胞は望ましくな...

心臓ポンプ機能の解析には、特に心不全(HF)の動物モデルについて、適切な洞察を得るためにさまざまなアプローチが必要になることがよくあります。心エコー検査または血行動態測定は、in vivo心機能障害1への洞察を提供しますが、in vitroアプローチは、機能障害が筋フィラメントおよび/または結合興奮に関与するCa2+過渡性の変化、または収縮機能(例えば、興奮収縮[E-C]結合)に起因するかどうかを特定するためにしばしば採用されます。in vitroアプローチはまた、費用のかかるおよび/または面倒なin vivo治療戦略を追求する前に、神経ホルモン、ベクター誘発性遺伝子変化、および潜在的な治療薬2に対する機能的応答をスクリーニングする機会を提供します。
インビトロ収縮機能を調査するために、無傷の小柱3または透過処理された筋細胞4での力測定、ならびにHF 5,6の存在下および非存在下での無傷の筋細胞における無負荷短縮およびCa2+過渡現象を含むいくつかのアプローチが利用可能です。これらのアプローチのそれぞれは、心臓ポンプ機能に直接関与する心筋細胞収縮機能に焦点を当てています2,7。しかしながら、収縮およびE−C結合の両方を一緒に分析することは、単離されたCa2+耐性成体筋細胞における筋肉長の短縮およびCa2+過渡性を測定することによって最も頻繁に行われる。実験室は、このステップ8のためにラット心臓から筋細胞を単離するために詳細に公開されたプロトコルを利用します。
Ca2+一過性および筋フィラメントの両方が、無傷の筋細胞の短縮および再延長に寄与し、収縮機能障害に寄与する可能性がある2,7。したがって、このアプローチは、in vitro機能解析で、Ca2+サイクリング機構と筋フィラメントを含む無傷の筋細胞が必要な場合に推奨されます。例えば、無傷の単離された筋細胞は、遺伝子導入9を介して筋フィラメントまたはCa2+サイクリング機能を改変した後の収縮機能を研究するために望ましい。さらに、下流のセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路および/または治療薬への応答の影響を研究する際に、神経ホルモンの機能的影響を分析するために、無傷の筋細胞アプローチが提案されています2。単一筋細胞における負荷依存力の代替測定は、ほとんどの場合、低温(≤15°C)での膜透過処理(またはスキニング)後に行われ、Ca2+過渡寄与を除去し、筋フィラメント機能に焦点を当てます10。無傷の筋細胞における負荷依存力とCa2+過渡現象の測定は、特に神経ホルモンシグナル伝達に対する応答の測定や治療薬のスクリーニングなど、より高いスループットが必要な場合に、アプローチ11の複雑で技術的な課題のために主にまれです。心臓小柱の解析は、これらの技術的課題を克服しますが、非筋細胞、線維症、および/または細胞外マトリックスリモデリングの影響を受ける可能性があります2。新生児筋細胞および誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋細胞は、成体筋フィラメントタンパク質の完全な補体をまだ発現しておらず、通常、成体桿体状筋細胞に存在する筋フィラメント組織のレベルを欠いているため、上記の各アプローチは成体筋細胞を含む調製物を必要とする2。現在までに、iPS細胞における証拠は、成体アイソフォームへの完全な移行が培養で134日以上を超えることを示しています12。
このコレクションの焦点がHFであることを考えると、プロトコルには、障害のある無傷の筋細胞と失敗していない無傷の筋細胞における収縮機能を区別するためのアプローチと分析が含まれています。代表的な例は、腎上縮窄の18〜20週後に研究されたラット筋細胞から提供され、5、13に記載される。次に、偽処理ラットの筋細胞と比較します。
ここで説明するプロトコルとイメージングプラットフォームは、HFの発生中の桿体状心筋細胞における短縮およびCa2+過渡現象の変化を分析および監視するために使用されます。この解析では、前述のように、2 x 104 Ca2+耐性の棒状筋細胞を22 mm2ラミニンコーティングガラスカバースリップ(CS)に播種し、一晩培養します8。このイメージングプラットフォーム用に組み立てられたコンポーネントは、最適なイメージングに使用されるメディアとバッファーとともに、材料の表に記載されています。ソフトウェアを使用したデータ分析のガイドと代表的な結果もここに提供されています。全体的なプロトコルは別々のサブセクションに分割され、最初の3つのセクションでは単離されたラット筋細胞とデータ分析に焦点を当て、続いて細胞Ca2+一過性実験と筋細胞におけるデータ分析が続きます。

<table><tbody><tr><td>MEDIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma (Roche)</td><td>3117057001</td><td>最終濃度 = 0.2% (w/v)</td></tr><tr><td>グルタチオン</td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>最終濃度 = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES Σ</td><td></td><td>H-7006</td><td>最終濃度 = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Σ</td><td>M-2520</td><td>1 本で 1 L; pH7.45</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>最終濃度 = 4 mM</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー</td><td>15140122</td><td>最終濃度 = 100 U/mL ペニシリン、100 &mu;g/mL ストレプトマイシン</td></tr><tr><td><ストロング>Ca2+ イメージング</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>F1221</td><td>50 &mu;g /バイアル;&nbsp;1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicidのDMSO溶液を調製します。&nbsp;メディア中の最終Fura2-AM濃度は&nbsp;5 &mu;M</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>P36400</td><td>7.2 mg プロベニシド (0.5 M) を 1 mM Fura-2AM ストックに加えます。メディアの最終濃度は2.5 mM</td></tr><tr><td>ラット筋細胞用材料 PACING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1 22&nbsp; mm2ガラスカバースリップ</td><td>コーニング</td><td>2845-22</td><td></td></tr><tr><td>バナナジャック付き3 x 36インチケーブル</td><td>ポモナエレクトロニクス</td><td>B-36-2</td>補足<td>図1、パネルC</td></tr><tr><td>37oCインキュベーター&nbsp;O2:5% CO2&nbsp;</td><td>Forma</td><td>3110</td><td>補足図1、パネルE.&nbsp;複数のモデルが適切です</td></tr><tr><td>クラスII A/B3 UVランプ付きバイオセーフティキャビネット</td><td>Forma</td><td>1286</td><td>複数のモデルが適切です</td></tr><tr><td>鉗子 - デュモン #5 5/45</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>低倍率倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM-IL&nbsp;</td><td>この顕微鏡をインキュベーターに隣接して配置し、ペーシングの開始時および培地交換後のペーシング筋細胞の収縮をモニターします。 &nbsp;4Xおよび10X対物レンズを推奨</td></tr><tr><td>ペーシングチャンバー</td><td>カスタム</td><td></td><td>補足 図1、パネルA。Ionoptix C-paceシステムは、市販の代替品であるか、22</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td>補足<td>図1、パネルDを参照してください。.</td></tr><tr><td>収縮機能のための材料および/またはCa2+ IMAGING ANALYSIS</td><td></td><td></td> <td>ID in Supplemental Figure 2 &代替案/推奨オプション</td></tr><tr><td>Ca2+イメージング分析用追加コンポーネント</td><td>Ionoptix</td><td>必須システムコンポーネント: -- フォトンカウンティングシステム&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;--&nbsp;デュアル励起光源付きキセノン電源&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;--&nbsp;蛍光インターフェース</td><td>&nbsp;- フォトンカウンティングシステムには、光電子増倍管(PMT)とダイクロイックミラーが含まれており、CCDカメラに隣接して設置されています&nbsp;(パネルA #4).&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;- キセノン電球光源(パネルA#5およびパネルC左を参照)の電源は、パネルA#6に示されているデュアル励起インターフェース(340/380nm&nbsp;励起および510nm放射)と統合されています。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;- コンピュータと&nbsp;との間の蛍光界面光源はパネルB、#12に示されています。</td></tr><tr><td>画像取得付きCCDカメラ&nbsp;ハードウェアおよびソフトウェア(240フレーム/秒)</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>CCDコントローラー付きMyocam&nbsp;</td><td>MyocamとCCDコントローラは、それぞれ補足図2のパネルA#4&nbsp;とパネルA#5とパネルC#5(右)に示されています。コントローラはPCコンピュータシステム(パネルB#14)と統合されています。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;チャンバー刺激装置</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>ミオペイサー</td><td>パネルB、#13;代替案:&nbsp;グラスモデル S48</td></tr><tr><td>カバースリップマウント 灌流チャンバー</td><td>22 mm2 カバースリップ用カスタムチャンバー、シリコンアダプターと 2-4 フィリップスなべ頭 #0 ネジ付き&nbsp;(矢印、パネルF)</td><td></td><td>パネルA#10&パネルF;&nbsp;&nbsp;チャンバー温度は、TH-10KmプローブとTC2>Cを使用して37<o/supCに校正します。(温度コントローラーを参照)。商用の代替案:&nbsp;Ionoptix FHDまたはC-stim細胞&nbsp;室;Cell MicroControls培養刺激システム</td></tr><tr><td>機能/Ca2+過渡現象のデータ収集と分析のための専用コンピュータ&ソフトウェア</td><td>Ionwizard</td><td>PCボードとソフトウェア</td><td>パネルB、#14;収縮機能は、IonWizard ソフトウェアの SarcLen (サルコメア長) または SoftEdge (筋細胞長) 取得モジュールを使用して測定します。Ionwizardソフトウェアには、レシオメトリック用のPMT取得ソフトウェアも含まれています&nbsp;Fura-2AM負荷myoyctes.><2+イメージング - 4ポスト電子ラックマウントキャビネットと棚は、somputerと細胞刺激装置を収容するために推奨されます。&nbsp;Ca2+イメージング用の蛍光界面もこのキャビネットに収納されています(下記参照)。</td></tr><tr><td>鉗子 - Dumont #5 TI</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td>Panel F</td></tr><tr><td>メディア用断熱チューブホルダー</td><td>カスタム</td><td></td><td>パネルA #9;このホルダーは、発泡スチロール&を使用して簡単に組み立てることができます。メディアを暖かく保つための予熱ゲルパック</td></tr><tr><td>倒立型明視野顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>TE-2000S</td><td>Ca2+イメージング用の落射蛍光用回転タレット(パネルA #2)を取り付けます。&nbsp; &nbsp;Ca2+イメージング中の蛍光漂白を最小限に抑えるために、深赤色(590 nm)のコンデンサーフィルターも推奨されます。</td></tr><tr><td>アイソレータテーブル</td><td>TMC振動制御</td><td>30 x 36インチパネル</td><td>A、#1;望ましい:&nbsp;高架棚、ファラデーシールド&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>顕微鏡接眼レンズ&対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>10倍CFI接眼レンズ 40倍水CFIプラン 蛍光対物レンズ</td><td>パネルA #3; 40倍対物レンズ:&nbsp; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&nbsp;Cell MicroControls HLS-1対物レンズヒーターは、対物レンズの周囲に取り付けられています(以下の温度コントローラーを参照)。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ノート:&nbsp;水浸漬ディスペンサーは、水ベースの対物レンズにも対応できるようになりました。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>パネル A #8 およびパネル E</td></tr><tr><td>小型計量ボート</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr>温度<tr><td>調節器</td><td>セルMicroControls</td><td>TC2BIP</td><td>パネルA#7;パネルD。この温度コントローラーは、カバースリップチャンバーを37oCに加熱します。&nbsp;&nbsp;このプラットフォームには、予熱器と対物レンズヒーターをお勧めします。&nbsp;Cell MicroControls HPRE2予熱器 &nbsp;HLS-1対物レンズヒーターを制御&nbsp;TC2BIP温度コントローラーによる研究のために。</td></tr><tr><td>モーションセンサー付きキャビネット下のLEDライト&nbsp;</td><td>Sylvania</td><td>#72423 LEDライト</td><td>最小限の室内光の下でのCa2+過渡イメージング中のデータ収集に推奨されます。&nbsp;代替案:&nbsp;柔軟なネックを備えた懐中電灯/ブックライトのクリップ-複数のサプライヤーが利用可能です。</td></tr><tr><td>インラインEhrlenmeyerフラスコ&保護フィルター</td><td>フィッシャー</td><td>タイゴンチューブ付き真空ライン - E363;&nbsp;ポリプロピレンEhrlenmeyerフラスコ - 10-182-50B;真空フィルター - 09-703-90</td><td>パネルA #11</td></tr></tbody></table>

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とca2+ 一過性の解析

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

収縮性機能障害およびCa2+ 過渡性は、心臓誘発性損傷および/またはリモデリングの包括的な評価の一環として、細胞レベルで分析されることがよくあります。これらの機能的変化を評価するための1つのアプローチは、初代成人心筋細胞におけるアンロード短縮およびCa2+ 過渡分析を利用する。このアプローチでは、成体筋細胞をコラゲナーゼ消化によって単離し、Ca2+ 耐性にしてから、ラミニンコーティングされたカバーガラスに接着し、続いて無血清培地で電気ペーシングを行います。一般的なプロトコルは、成体ラット心筋細胞を利用しますが、他の種からの初代筋細胞に対して容易に調整することができます。損傷した心臓からの筋細胞の機能的変化は、偽の筋細胞および/または in vitro 治療と比較することができます。この方法論には、筋細胞のペーシングに必要な重要な要素と、細胞室およびプラットフォームコンポーネントが含まれています。このアプローチの詳細なプロトコルには、サルコメア長検出による無負荷短縮の測定、およびレシオメトリックインジケータFura-2 AMで測定されたセルラーCa2+ 過渡現象の測定、および生データ分析の手順が組み込まれています。

収縮機能研究は、単離の翌日(2日目)から分離後4日までラット筋細胞に対して行われます。筋細胞は単離の翌日(すなわち、2日目)に記録することができるが、遺伝子導入または収縮機能を変更するための処理の後、より長い培養時間が必要になることが多い8。単離後18時間以上培養された筋細胞の場合、セクション1に記載されているペーシングプロトコルは、T尿細管を維持し、一貫した短縮および再延長の結果を維持するのに役立ちます。
短縮研究のための筋細胞を含むCSの代表的な部分を、ROIを設定する前に適切に配置された筋細胞とともに図1Aに示します(図1B)。ROIが特定されると(図1C、ピンクのボックス)、筋細胞の下に表示されるアルゴリズム情報は、記録前の筋細胞の位置決めを最適化するのにも役立ちます。具体的には、線形光学密度(LOD、黒線)はサルコメアの数と間隔の指標であり、高速フ...

単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

このアプローチは、心不全の発症中の収縮機能の変化を検出します。神経ホルモンおよび潜在的な治療薬に対する筋細胞における機能的応答もスクリーニングすることができる。筋細胞の位置決めには練習が必要ですが、一貫したサルコメア長イメージングを得るために不可欠です。手順を実演するのは、研究所の准教授兼主任研究者であるマーガレットウェストフォールです。実験を開始する前に、ゲルパックと培地をインキュベーター内で摂氏37度で30分間予熱します。原稿に記載されているように収縮機能プラットフォームコンポーネントの電源を入れ、チューブを蠕動ポンプに組み立てます。次に、予熱したゲルパックをチューブホルダーに移し、細胞刺激装置の電源を入れて真空にします。メディアの入った50ミリリットルのチューブを断熱チューブホルダーに入れて、蠕動ポンプチューブを通して毎分0.5ミリリットルで灌流を開始します。次に、2ミリリットルの予熱培地を小さな計量ボートに加え、筋細胞を含むカバースリップ1枚を刺激チャンバーから計量ボートに移します。刺激室を摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベーターに戻します。計量ボートからカバースリップを取り外し、下側をそっと拭いてから、グリースを塗りたてのカバースリップチャンバーに移し、カバースリップにメディアを一滴加えます。プラチナ電極マウントをカバースリップの上に置き、次に新しいカバースリップを鉗子で上部に置き、カバースリップサンドイッチの上にトップマウントを置きます。2つまたは4つのゼロなべネジを取り付けて、チャンバーの組み立てを完了します。蠕動ポンプで、チューブ全体に媒体が存在する場合は、チューブを予熱器に取り付け、予熱器をカバースリップチャンバーに取り付けます。次に、毎分0.5ミリリットルで灌流を開始し、漏れがないことを確認するためにチャンバーの下にティッシュワイプを置きます。カバースリップチャンバーを顕微鏡のステージアダプターに配置した後、加熱システムをオンにし、アセンブリを5〜10分間平衡化して、チャンバーの中央で摂氏37度の一定の媒体温度を達成します。真空システムに接続されたチューブを使用して、チャンバーの反対側の端に灌流された媒体が収集されるのを観察します。平衡化時間中に、40倍の水浸対物レンズで筋細胞を顕微鏡で可視化します。ペーシング刺激装置をアクティブにするには、電圧を35〜40ボルトに設定し、刺激周波数を0.2ヘルツに調整して、収縮機能と筋細胞の生存を最適化します。サルコメア短縮トレースを収集するには、コンピューターでソフトウェアを開き、[OK]、[ファイル]、および[新しい]タブを選択します。トレースを選択して画面テンプレートを準備し、ユーザー制限とサルコメアの長さを編集します。ファイルと新しいタブでサルコメアの長さのトレースを記録し、収縮筋細胞を特定し、筋細胞をカメラの縦軸に沿って配置して、線条パターンが垂直になるようにします。コンピューターのマウスを使用して、関心領域またはROIボックスを筋細胞の上に配置します。収集を選択して収縮機能の記録を開始します。0.5ヘルツの低刺激周波数で各筋細胞から60秒間の短縮を記録します。カバースリップごとに5セルから10セルに短縮するサルコメアを記録します。周波数範囲の短縮を測定するには、各周波数に筋細胞を配置して、記録前に定常状態の短縮を取得します。灌流速度を2倍にし、刺激後15〜20秒で0.2〜2ヘルツの範囲の新しい周波数で記録を開始し、所定の範囲の刺激周波数にわたって短縮するためにカバースリップごとに2つ以下の筋細胞を記録します。セルごとに少なくとも7つの収縮を記録して、信頼性の高い信号平均データを取得します。ファイルを選択し、記録されたトレースを選択して、[開く] を選択します。基本トレースのタブ 1 を選択し、トレースの上部にある黄色のパネルを設定して、sarc の長さを取得します。操作単調過渡解析オプションとTTLイベントマークを含む解析テンプレートを、メニューから必要なオプションの[T Zeroの定義]ボックスに用意します。テンプレートを選択してこれらの解析オプションを保存し、解析テンプレートを識別子とともに保存します。各トレースを分析する前に、分析テンプレートをロードします。データを解析するには、マークを選択し、ゲートし、過渡値を追加してから、イベントマークと解析範囲から変換します。0.2ヘルツでペースを合わせた筋細胞の時間範囲をマイナス0.01秒から1.20秒に設定します。より高い周波数で刺激された筋細胞については、より短い時間範囲を選択します。操作と平均イベントを選択して、元のベーストレースの下に平均化された信号記録を生成します。次に、信号平均トレースのタブ1を選択し、上部メニューのマークに移動してから過渡を追加し、操作と単調過渡解析を選択して、ベースラインサルコメアパラメータの信号平均値を信号平均表示パネルに表示します。単調過渡解析とクリップボード電流をエクスポートし、複数の筋細胞の複合解析のために非定常サルコメア解析をスプレッドシートに転送します。信号平均トレースをコピーするには、エクスポート、現在のトレース、クリップボード、オプションの順に選択し、小数点以下の桁数を5に設定します。タブ区切り文字を選択し、[OK]をクリックします。各筋細胞のシグナル平均トレースを2番目のスプレッドシートに記録します。この研究は、圧力過負荷またはPOが、偽群と比較して筋細胞の収縮機能を低下させることを示した。しかし、心筋トロポニンIT144DまたはcTnIT144Dの遺伝子導入から4日後、PO筋細胞の収縮能力は偽レベルに戻り、筋細胞の機能が回復する可能性があることを示しました。初期の研究では、cTnIT144Dの遺伝子導入は、CTnIと比較してピーク短縮と拡張期カルシウムレベルの上昇を促進しました。心筋細胞の位置の微調整は、明確な短縮痕跡を得るためにしばしば必要とされる。このプロトコルは、Fura-2 AMなどのカルシウム感受性蛍光色素を負荷した心筋細胞に対して実行して、短縮に加えてカルシウム過渡現象を検出することもできます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。...

マウス心筋細胞の単離と生理解析

マウスの左心室の乳頭筋は 、インビトロで心筋収縮性を調べるために使用することができます。この記事では詳細に心臓収縮特性を研究するためのアイソレーションと実験プロトコルを説明しています。...

マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

この記事では、ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における詳細なプロトコルおよび膜貫通電位 （Vm）のデュアル光学マッピングとフリーイントラ筋小胞体（SR）のために必要な機器のCa 2+を説明しています。この方法は、無傷の中心部にあるV mとSRのCa 2+動態の直接観察と定量化を可能にします。...

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

この論文は、ラットの心臓から分離された心筋細胞における収縮中のミオフィラメントCa2+感度の変化を評価するプロトコルについて説明しています。心臓電気生理学、収縮期/拡張期サイトゾルCa2+レベル、収縮/弛緩とともに、この測定は、健康な心臓と病気の心臓の心臓の興奮-収縮結合を媒介するメカニズムを支えるために不可欠です。...

筋フィラメントのCaの評価<sup&gt; 2+</sup&gt;感度基礎心臓興奮収縮連関

マウス筋細胞の単離の方法論と、同時デジタル細胞幾何学的測定と蛍光光光測定を用いたサルコメア短縮トレースと同時に電圧またはカルシウムの痕跡を得る方法を提示する。...

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

このプロトコルは、皮をむいた心筋細胞を用いた心機能の抽出および評価の技術を段階的に記述することを目的とする。この方法論は、マウスから男性まで、異なる心臓の場所から収集することができる小さな凍結生検を使用して、myofilament機能の測定および急性調節を可能にする。...

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

ウサギ心筋細胞におけるGtACR1活性化の電気機械効果を評価するプロトコルを提示する。細胞分離、培養、アデノウイルス伝達、パッチクランプ、炭素繊維技術による機能実験に関する詳細な情報を提供します。...

光遺伝学的変調型心筋細胞活性の電気機械評価

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

このプロトコルはMyoBLAZERシステム、前臨床開発の間にcontractilityの薬物誘発性の変更を評価するための信頼できるプラットホームのドナーの中心からの大人の人間の原発性心筋細胞のcontractilityを測定する方法を記述する。...

単離された成人ヒト一次心筋細胞における心臓収縮性の測定

このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能の膜貫通電圧および細胞内Ca2+...

カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

学ぶ心不全モデルにおけるラット筋細胞の収縮機能とカルシウム一過性の測定法。サルコメア長検出と蛍光イメージングを用いて神経ホルモン応答や治療薬効果を評価し、心機能メカニズム解明に貢献します。

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害と^Ca2+ 一過性の解析

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