Name: 光遺伝学的変調型心筋細胞活性の電気機械評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学ぶパッチクランプとカーボンファイバー技術を組み合わせたGtACR1光遺伝学的変調によるウサギ心筋細胞の電気機械評価法。この手法は心臓生理学における光遺伝学実験の発展に貢献します。

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ステファニー・ペレス=フェリスの優れた技術支援に感謝します, 博士ジョナス・ヴィーテック (フンボルト大学, ベルリン、ドイツ)pUC57-GtACR1プラスミドを提供するために、マイケル・シュップ教授(チャリテ-大学ベルリン、ベルリン研究所、ベルリン、ベルリン)は、アデノウイルス生産とアナスタシア・ホクロワ博士(ウラル連邦大学)に細胞分離プロトコルを改善し、再設計するための専門知識を共有しました。プロジェクトはドイツ研究財団(SPP1926:SCHN 1486/1-1;;エミー・ヌーザー・フェローシップ:SCHN1486/2-1)とERCアドバンスト・グラント・カーディオNECT。

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<li>Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+electric+potential+in+the+phototaxis+of+the+alga+Haematococcus+pluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis.</a> Nature. 271, 476-478 (1978).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+A+Light-Gated+Proton+Channel+in+Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
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<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Light+Sensitivity+Optical+Neural+Silencer%3A+Development+and+Application+to+Optogenetic+Control+of+Non-Human+Primate+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
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<li>Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties%2C+substrate+specificity+and+optogenetic+potential+of+the+engineered+light-driven+sodium+pump+eKR2%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2.</a> Scientific Reports. 8, 9316(2018).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Mohamed, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+inhibition+of+larval+zebrafish+behaviour+with+anion+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins.</a> BMC Biology. 15 (1), 103(2017).</li>
<li>Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Neuronal+Silencing+in+Drosophila+during+Visual+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing.</a> Scientific Reports. 7, 13823(2017).</li>
<li>Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channelrhodopsins+for+inhibitory+cardiac+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics.</a> Scientific Reports. 6, 33530(2016).</li>
<li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806(2018).</li>
<li>Peyronnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Load-dependent+effects+of+apelin+on+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+mechanics+of+rat+cardiomyocytes+under+isometric%2C+unloaded%2C+and+physiologically+loaded+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).</li>
<li>Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials%2C+ion+channel+currents+and+transverse+tubule+density+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes+maintained+for+6+days+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).</li>
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<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Janssen, P. M., Hunter, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force%2C+not+sarcomere+length%2C+correlates+with+prolongation+of+isosarcometric+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction.</a> The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).</li>
<li>Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+force+decline+from+calcium+decline+by+preload+in+isolated+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca+2%2B-permeable+channelrhodopsin+CatCh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Schneider-Warme, F., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+to+fight+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Using light to fight atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).</li>
<li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
<li>Bernal Sierra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channel-based+optogenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Potassium channel-based optogenetic silencing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4611(2018).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9 (1), 3949(2018).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

光遺伝学的ツールは非侵襲的な方法で興奮性細胞電気生理学の変調を可能にするのに対し、それらは特定の実験計画のための最良の利用できるツールを選び出すことを可能にする異なった細胞タイプ(例えば、CM)での徹底的な特徴付けを必要とする。パッチクランプ技術は細胞の電気生理学を評価するための標準的な方法である。全細胞構成では、光刺激/阻害後の細胞膜全体の光活性化電流または膜電圧の時間的変化を記録することができます。電気励起の光遺伝学的操作もCM収縮に影響を与える。サルコメア追跡と炭素繊維支援力測定を用いて、光の問い合わせが筋細胞の機械的活動に及ぼす影響を定量化します。
光ゲートクロリドチャネルGtACR1の基本効果をCMで特徴付けるプロトコルについて説明する。モデルシステムとして、我々は、その電気生理学的特性(例えば、AP形状および耐火期間)がげっ歯類CMよりもヒトCMで観察されるものに類似しているウサギCMを選んだ。さらに、ウサギCMは、腺ウイルスの送達およびGtACR1-eGFPの発現に十分な長さの数日間培養することができる。特に、分離されたCMは、細胞終末の丸めおよび交差線の緩やかな喪失、T管状システムおよびカヴェノラ23、24を含む、培養におけるそれらの構造的特性を経て変化させる。これに伴い、培養されたCMでは、静置膜電位の脱分極、APの延長、細胞Ca2+処理の変化など、機能的変化が報告されている。培養における細胞適応のレビューについては、Louchらの25を参照してください。補足図2は、培養されたCMで観察されたものと比較するための、新たに分離されたCMの例示的なAPおよび収縮測定を示す(図6、図7)ここで提示されたプロトコルを用いた。
全細胞パッチクランプ記録により、光電流特性(振幅や運動論など)や高い時間分解能での膜電位やAP特性の光誘起変化を直接測定できます。しかし、このような記録にはいくつかの制限があります:まず、細胞質は全細胞記録においてピペット溶液に置き換えられ、イオン電気化学的勾配を制御するのに有利であるが、細胞小器官、タンパク質および他の化合物を洗浄する本質的な欠点を有し、細胞の電気応答に影響を与える可能性がある。第二に、非生理学的に長い脱分極(例えば、光ゲートイオンチャネルの遅い時間定数)に起因する追加のイオンチャネルの活性化のような副作用は、我々の方法がAPDの変化を検出することしかできないが、電気生理学的に関連する細胞コンパートメントにおけるイオン濃度の直接測定を行わないので評価することは困難である。これは蛍光インジケーター(例えば、Ca2+センサー)またはイオン選択電極で行うことができる。さらなる特徴付けには、光強度滴定、pH依存性の決定、異なる膜電位での光電流運動論、および反復光刺激時の回復運動薬が含まれ得る。
パッチクランプ記録とは対照的に、単細胞力測定は、細胞内ミリューに影響を与えることなく、無傷の筋細胞の細胞収縮の分析を可能にする。イオン濃度に対する二次的効果(例えば、Ca2+)は、生成された力振幅およびダイナミクス(例えば、収縮および弛緩の最大速度;ここでは分析されない)を決定することによって間接的に評価することができる。炭素繊維技術による力測定は、プリロードされた細胞(すなわち、インシチュまたはインビボ設定と類似した条件)において受動的および活動的な力に関する直接的な情報を提供するので、自由収縮細胞よりも有利である。機械的プリローディングは、ストレッチが力の生産とリラクゼーション26、27に影響を与える細胞収縮性を分析する際に特に重要です。
光遺伝学的アプローチは、単一CMおよび無傷の心臓組織の両方で、細胞膜電位の空間的に正確な操作を可能にする。古典的に、ChR2は、光ゲート陽イオン非選択的チャネルであり、膜電位の脱分極に使用されてきたのに対し、光駆動プロトンおよび/または塩化ポンプは膜過分極に使用された。光遺伝学的アクチュエータの両方のグループは、ChR2が本質的に低い単一チャネル伝導度28と光駆動ポンプが吸収光子あたり1イオンを最大輸送することを特徴とするので、高い発現レベルを必要とする。さらに、CMにおけるChR2の長時間の活性化は、Na+および/またはCa2+過負荷を引き起こし、光駆動ポンプはトランスサルコレムH+またはCl-勾配29、30を変化させる可能性がある。CM活性の光遺伝学的制御のための代替ツールを探すに、我々は最近、ChR2のようなカチオンChRと比較して優れた単一チャネル伝導度および高い光感度を特徴とする自然アニオンチャネルロドプシンGtACR1を試験した。GtACR1活性化はCMを脱分極し、光パルスのタイミングと持続時間に応じて光ペーシングおよび阻害に使用できることを発見した。カチオンChRの代わりにACRを使用する追加の利点は、Clのより負の反転電位である可能性があります- Na+と比較して、人工的に導入されたイオン電流を減少させる。既に示したように、GtACR1による光ペーシングは、GtACR1チャネル閉鎖の遅い成分の結果としてAP延長を招く可能性があり、これはより速いGtACR1変異体19を用いて克服できる。しかし、低い、より生理的な細胞内Cl-濃度を使用する場合、AP延長ははるかに顕著ではない(図6を参照)。さらに、長い照明によるGtACR1媒介阻害は深い膜脱分極をもたらし、二次Na+およびCa2+流入を再び活性化させ、それによって電圧ゲートチャネルの活性を変化させる。我々の測定では、APおよび収縮パラメータは、1分間の光誘発阻害後に40s以内のベースラインに回復することを発見した(Kopton et al. 2018,図6,図7を参照)。ライトゲートK+チャネルは、CMの静止膜電位31に影響を与えることなくCMをサイレンシングするための強力な代替手段を提供する。
今後は、さまざまな光遺伝学的ツールを定量的に比較して、心臓活動を阻害する可能性を比較したいと考えています。このため、ACR、ChR2および赤シフトChRバリアント32を含む様々な光ゲートイオンチャネル、ならびにハロロドプシンまたはライトゲート付きアデニルシクラーゼbPACなどの超分極アクチュエータをカリウムチャネルSthK(PAC-K)31と組み合わせて試験する。
ここで提示されるプロトコルはCMの電気機械特性の詳細な特徴付けのために使用することができる。これは主に他の種からのCMにも適用可能であり、疾患を持つ心筋から分離されたCMにも適用される。光刺激はCMを異なる周波数でペースを上げることができ、炭素繊維収縮実験の間に異なるプリロードをテストすることができる。興味深い実験は、疾患進行中の心臓組織リモデリングの開発中に観察されるように、静止膜電位の徐々に増加を模倣するために、閾値下偏光のための低強度照明を使用することである。最後に、機能的測定をCa2+イメージングと組み合わせて、励起収縮結合に関するさらなる洞察を得たり、薬理学的介入を行ってCM活性に対する異なる薬物の影響を評価したりすることが可能です。

単細胞緑藻1,2の眼球に初めて記録されたChR媒介光電流。クラミドモナス・レインハルトイChR1およびChR2の遺伝的クローニングおよび異種発現の直後に、ChRは、キセノプス卵母細胞および哺乳類細胞における膜電位を光3,4によって変化させるツールとして使用された。カチオン非選択的ChR脱分極は、ChRの逆転電位に負の安静膜電位を有する細胞の膜を脱分極する。したがって、ニューロンやCMを含む興奮性細胞でAPを引き出すために使用することができ、光ペーシング5、6を可能にする。
陽イオンChRと相補的に、光駆動陽子、塩化物およびナトリウムポンプ7、8、9は、ニューロン活性10、11、12を阻害するために使用されてきた。しかし、後者には限界があり、吸収された光子ごとに1つのイオンが輸送されるように、高い光強度と持続的な照明を必要とする。2014年、Wietekらおよびベルントらの2つの独立した研究は、チャネル細孔13、14の突然変異を介してカチオン伝導ChRをACRに変換する方法について説明した。1年後、自然ACRはクリプトフィテギラルディアシータ(GtACR)15で発見されました。設計されたACRが残留カチオン伝導を示したように、それらは自然なACRに置き換えられ、大きな単一チャネル伝導度および高い光感度15によって特徴付けられる。GtACRは、塩化物16,17の反転電位に向かって膜電位を偏光させることによって神経活動を沈黙させるために用いた。Govorunovaら他の培養ラット心室CMにGtACR1を適用し、プロトンポンプArch18のような以前に利用可能な阻害ツールを活性化するのに十分ではなかった低光強度レベルで効率的な光抑制を示した。我々のグループは最近、CMのGtACR1媒介光抑制は脱分極に基づいており、GTACR1もCM19の光ペーシングに使用できることを報告した。
ここでは、培養ウサギ心室CMに対するGtACR1光活性化の電気生理学的および機械的効果を研究するためのプロトコルを提示する。まず、細胞の分離、培養、および伝達について説明します。電気生理学的効果は全細胞パッチクランプ記録を使用して測定される。所定の膜電圧での光媒介電流は、Vクランプモードで評価されます。膜電位ダイナミクスは、CM(Iクランプモード)を電気的または光学的にペーシングしながら測定されます。電気的にトリガされるAPの光学的阻害は、持続光アプリケーションを使用して試験される。機械的効果は、サルコメア長さのイメージングベースの追跡と組み合わせて炭素繊維を使用して測定されます。そのために、光学的にペース可能な細胞は、反対側の細胞端付近の形質膜に2つの炭素繊維を取り付けることによって機械的にプリロードされる。サルコメアの長さの変化は光学か電気ペーシングの間に記録される。最後に、細胞の電界刺激時に光抑制を測定し、発生した力を分析する。
このプロトコルには、図1のフローチャートに示すステップが含まれています:ウサギの深部麻酔、チオペンタール過剰摂取注射、心臓切除、ランゲンドルフ灌流および組織消化、組織の機械的解離から細胞を放出する、CM収量の顕微鏡分析、CMの培養、アデノウイルス5型のトランスダクション、および機能的実験の続く。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg"> 図1:電気的および光学的にペース可能なCMを得るために使用されるプロトコルのフローチャート。心臓は生後9〜10週のウサギから切除され、ランゲンドルフのセットアップを使用して心臓組織を浸透させながら消化される。細胞は機械的な攪拌によって解放される。CMの収率は顕微鏡の下で計る。CMは培養され、アデノウイルス5型および機能実験で導入され、48〜72時間の導入後に行われる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>機器 - 細胞単離/培養/形質導入</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adeno-X アデノウイルスシステム 3 CMV</td><td>TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大動脈カニューレ</td><td>Radnoti</td><td></td><td>4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L</td></tr><tr><td>mm カバースリップ & オスラッシュ; 16 mm, Thickness No. 0</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>631-0151</td><td>ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>グリフィンシルク、ブラック、長さ2 m、サイズ3、0.5 mm</td><td>Samuel Findings、ロンドン、英国</td><td>TSGBL3</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ニューブランズウィック州、エッペンドルフ、Sch&ouml;ネンブーフ、スイス</td><td>ギャラクシー170S</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff-perfusion set-up</td><td>Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbl&auml;serei、フライブルク、ドイツ</td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>のランゲンドルフポンプ</td><td>Ismatec、Labortechnik-Analytik、Glattbrugg-Z&uuml;リッチ、スイス</td><td>ISM444</td><td></td></tr><tr><td>メッシュ:ナイロンモノデュール濾布</td><td>Cadisch Precision Meshes Ltd</td><td></td><td>800 & マイクロ;m holes, 1 m wide</td></tr><tr><td>Neubauer chamber</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>717806</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit, New Zealand White</td><td>Charles River</td><td>Strain Code: 052</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td><td>BC774R</td><td>Bauchdeckenschere ger. 18cm</td></tr><tr><td>滅菌フィルター, 0.22 & micro;m</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Patch-clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplfier</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip &oslash; 50 mm, Thickness No. 1</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>631-0178</td><td>ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>デジタイザー Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, United States</td><td>1550A</td><td></td></tr><tr><td>Filter (530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>11513878</td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Filter (630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Interface</td><td>Scientifica,英国アックフィールド</td><td>1U ラック、352036</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices、カリフォルニア州サニーベール、米国</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>LED制御ソフトウェア</td><td>Essel Research and Development、トロント、カナダ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED制御システム</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のマイクロピペットプーラー</td><td>成重株式会社、東京、日本</td><td>PP-830</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>反転</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Motorised Micromanipulator</td><td>Scientifica, Uckfield, UK</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Optical power meter</td><td>Thorlabs, Newton, NJ, United States</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Grease</td><td>RS Components, Corby, UK</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems, Sequim, WA, United States</td><td>787500</td><td>シルバー、裸 0.015インチ、コーティング 0.0190インチ、長さ 25 フィート</td></tr><tr><td>ソーダ石灰ガラス キャピラリー</td><td>Vitrex Medical A/S、Vasekaer、デンマーク</td><td>160213 BRIS、ISO12772</td><td>1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm</td></tr><tr><td>Software Axon pClamp</td><td>Molecular Devices、San Jos&eacute;、CA、United States</td><td>バージョン 10.5</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステージマイクロメーター</td><td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Carbon fibers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon fibers</td><td>provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec</td><td></td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Digitizer Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States</td><td>1550B</td><td></td></tr><tr><td>Filter (530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>11513878 Filter</td><td></td></tr><tr><td>(630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence System Interface</td><td>IonOptix, Milton, MA United States</td><td>FSI-800</td><td>2.0 OD x 1.16 ID x 100 L</td></tr><tr><td>mm Force Transducer System</td><td>Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada</td><td>406A</td><td></td></tr><tr><td>力用ガラス毛細管測定</td><td>ハーバード・デバイス、マサチューセッツ州ホリストン、米国</td><td>GC200F-10</td><td></td></tr><tr><td>インターフェース ナショナルインスツルメンツ</td><td>ナショナルインスツルメンツ、ブダペスト、ハンガリー</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>ルミナスデバイス、カリフォルニア州サニーベール、米国</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>LEDコントロールボックス</td><td>エッセル研究開発、トロント、カナダ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEDコントロールシステム</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microcontroller Parallax Inc., Rocklin, California, United States</td><td>Propeller</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Narishige Co., Tokyo, Japan</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inverted</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S camera</td><td>IonOptix, Dublin, Ireland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S カメラ Power</td><td>IonOptix, Milton, MA, United States</td><td>MCS-100</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer Field Stimulator</td><td>IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States</td><td>MYP100</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Motor</td><td>Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>E-501.00</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Grease</td><td>RS Components, Corby, UK</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Software Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, United States</td><td>Version 10.5</td><td></td></tr><tr><td>Software IonWizard</td><td>IonOptix, Dublin, Ireland</td><td>Version 6.6.10.125</td><td></td></tr><tr><td>Software MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステージマイクロメーター</td><td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>A9251-100G</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td><td>21114-1L</td><td></td></tr><tr><td>L-カルニチン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>C9500-25G</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ2型, 315 U/mg</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Creatine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>C0780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&beta;-D-アラビノフラノシド</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL</td><td>Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany</td><td>PZN-07829486</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン 50 mg/mL</td><td>Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>PZN-03029843</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>インスリン (ウシ膵臓)</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>I6634-50MG</td><td></td></tr><tr><td>K-アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>A6558-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR International GmbH、ルーヴェン、ベルギー</td><td>26764.260</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Honeywell Fluka、マスキーゴン、ミシガン州、米国</td><td>35113-1L</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm マウス肉腫のラミニン基底膜</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>M199-Medium</td><td>Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>A9187-1G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-L&ouml;歌われる 0.9%</td> <td>ブラウン メルズンゲン AG、メルスンゲン、ドイツ</td><td>3200950</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem GmbH、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>A6579</td><td>Ca2+/Mg2+</sup</td></tr><tr><td>>Na-pyruvat</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズー</td>リ州、アメリカ合衆国 <td>P2256-100MG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)</td><td>Sigma、プール、英国</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ</td>州、米国<td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>T0625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental Inresa 0.5 g</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH、フライブルク、ドイツ</td><td>PZN-11852249</td><td></td></tr><tr><td>塩酸キシラジン、Rompun 2%</td><td>Bayer Vital GmbH、レバークーゼン、ドイツ</td><td>PZN-01320422</td><td></td></tr></tbody></table>

光遺伝学的変調型心筋細胞活性の電気機械評価

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

過去20年間、光遺伝学的ツールは、心臓を含む興奮性組織における細胞型特異的活性を調節する強力な手段として確立されてきた。チャネルロドプシン-2(ChR2)は心筋細胞(CM)における膜電位を脱分極する一般的なツールであるが、潜在的に作用電位(AP)を引き出す可能性があるが、CM活性の信頼できるサイレンシングのための有効なツールは欠けている。光遺伝学的阻害のためにアニオン・チャネルロドプシン(ACR)を用いることが示唆されている。ここでは、培養ウサギCMにおけるギラルディア・セタから天然ACR GtACR1を活性化する効果を評価するプロトコルについて述べた。このプロトコルには、ウサギの心臓からのCM分離、最大4日間の細胞の播種および培養、光ゲートクロリドチャネル用のアデノウイルスコーディングによるトランスダクション、パッチクランプおよび炭素繊維の調製、データ収集および分析が含まれる。全セル構成でパッチクランプ技術を使用すると、光作動電流(電圧クランプモード、Vクランプ)とAP(電流クランプモード、I-クランプ)をリアルタイムで記録できます。パッチクランプ実験に加え、細胞内ミリューを乱すことなくCM活性の機能評価のための収縮性測定を行います。そのために、細胞は炭素繊維を用いて機械的にプリロードされ、収縮はサルコメア長さおよび炭素繊維距離の変化を追跡することによって記録される。データ解析には、Iクランプ記録からのAP期間の評価、Vクランプ記録からのピーク電流、炭素繊維測定からの力計算が含まれます。記述されたプロトコルは、CM活性に対する異なる光遺伝学アクチュエーターの生物物理学的影響の試験に適用することができ、心臓組織および心臓全体における光遺伝学的実験の機械学的理解の開発のための前提条件である。

GtACR1-eGFPは培養ウサギCM(図6挿入)で発現し、パッチクランプ技術で光電流を測定した。GtACR1の光活性化は、-74 mVでの大きな内向きの電流を示しています。図6では、4 mW/mm2 のピーク電流(IP)は245 pAである。APは、電気的に(図6B)または光学的に(図6C)電流注入をしきい値の1.5倍、または短い脱分極光パルスをそれぞれ10ミリ秒でトリガした。APD値を分析すると、電気的にペースが速いCMは、0.24±0.08 sのAPD 20と0.75±0.17sのAPD 90を示し、 光学ペースのCMは0.31 ±0.08 sのAPD 20および0.81 ±0.19 sのAPD 90を示すのに対し(SE,n = 5,N = 2,ここで提示した例APD 20電気=0.17 s;APD 20光 = 0.27 s および APD 90電気 = 0.61 s;APD 90光 = 0.68 s;図 6D)。光ペースのCMは遅いAPの発症を示す(図6D)。CM活性化は、塩化物の反転電位に向けて膜電位を偏光させることにより、持続型照明(64s、4 mW/mm2)で阻害された、ここで-58 mV(図6E)。しきい値の 1.5 倍より高い電流注入は AP 生成を引き起こさない(図 6F)。発生したピーク力は、炭素繊維の曲げから求めた(図7B,C,E)。CMは、電気ペーシング時に232 μN/mm2を生成し(図7B)、261 μN/mm2を光ペーシングに続く(図7C)。長時間の緑色光パルスは収縮を阻害する(図7E)。64sの光学的阻害に続いて、再発収縮は収縮力を低下させ、かつ、ウサギCMからの拡張期カルシウム損失に合わせて、収縮(0.25Hzでのペース、図7D)を10度後に力値がベースラインに回復する。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg"> 図6:電気および光学的にペース/阻害されたCMの代表的なパッチクランプ記録。(A)300 ms、4 mW/mm2の光パルスを使用して-74 mVで代表的な光電流。IPはピーク電流を示す。挿入物はGtACR1-eGFP陽性の細胞を示す。(B)10msの電流ランプを使用して0pAでの代表的AP記録、CMを電気的にペースする0.6 nA(C)10ms、0.4 mW/mm2の光パルスを用いて0pAでの代表的AP記録。(D)上グラフは、電気(青)と光学的(緑色)活性化CMの10番目のAPのオーバーレイを示しています。下のグラフは、光学的および電気的にトリガされるAP(E光-E電気)との膜電位差を示す。(E) 電気的にトリガされた AP は、64 s,4 mW/mm2の持続光下で阻害された。APは、持続光下での閾値の1.5倍(0.1 nAから2.2 nAのステップで0.7 nAから)より高い電流注入によって阻害される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg"> 図7:光および電気的にペース/阻害されたCMの炭素繊維記録からの代表的なデータ。(A) データ収集ソフトウェアに表示されます。画像(I)は、サルコメア長さを算出するための窓を有する測定されたCMを示す。セルの幅はオレンジ色で表示されます。(1) 関連する周波数の範囲。(2)FFTパワースペクトルは、セル上のサルコメア間隔の周波数を示す。平均サルコメア長さはピーク周波数から計算されます。(3)サルコメアの長さの追跡ウィンドウ。(4) 強度トレース。(5) ハミングウィンドウを掛けた強度トレースは、ウィンドウの強度トレースです。スキーム(II)は、セルの楕円断面を示す。オレンジ色の幅と、青の破線で太い。画像(III)は、それぞれの検出ボックスを有する炭素繊維の位置を示し、緑色で赤色、右に左に表示する。(6) 強度トレース。(7) 強度トレースの第1の導出物(データ取得ソフトウェアマニュアル参照)。(B)電気的に引き出された収縮の代表的な痕跡。パネル(I)は、サルコメア長短さを示し、パネル(II)は2つの炭素繊維間の距離を示す。(C) 光学的に引き出された収縮の代表的なトレース (525 nm, 0.25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2).パネル(I)は、サルコメア長短さを示し、パネル(II)は2つの炭素繊維間の距離を示す。(D) AP生成の阻害によって生じた一時停止後の収縮1から11までのピーク力を発生させる。(E) 持続的な照明下での収縮の光学的阻害の代表的な痕跡 (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2)。パネル(I)は、2つの炭素繊維間の長さのサルコメア長短さ、パネル(II)を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>A</td>
			<td>領域</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acr</td>
			<td>アニオンチャネルロドプシン</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ap</td>
			<td>行動の可能性</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apd</td>
			<td>アクションの潜在的な期間</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cfu</td>
			<td>コロニー形成ユニット</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr</td>
			<td>チャネルロドプシン</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cm</td>
			<td>心筋細胞</td>
		</tr>
<tr>
<td>eGFP</td>
			<td>強化された緑色蛍光タンパク質</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esd</td>
			<td>エンドシストリックセル変形</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eu</td>
			<td>内毒素単位</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>力</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fft</td>
			<td>高速フーリエ変換</td>
		</tr>
<tr>
<td>GtACR</td>
			<td>ギラルディア・シータアニオン・チャネルロドプシン</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gui</td>
			<td>グラフィカル ユーザー インターフェイス</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iクランプ</td>
			<td>電流クランプ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iu</td>
			<td>国際単位</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moi</td>
			<td>感染の多重度</td>
		</tr>
<tr>
<td>ポリヘマ</td>
			<td>ポリ(2-ヒドロキジエチルメタクリレート)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vクランプ</td>
			<td>電圧クランプ</td>
		</tr>
</tbody></table>表5:略語の一覧。
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg"> 補足図1:光パワーメータによる光強度測定(A)4 mW/mm2で10ミリ秒の光パルスを測定する。(B)4 mW/mm2で64sの持続型照明の測定<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg"> 補足図2:分離したばかりのCMの特性と、培養におけるそれらの構造適応(A)新たに分離された CM の AP 記録(APD 20 の 1.11 ± 0.34 s、APD 90 の 1.96 ± 0.32 s、n = 7、N = 2)。平均安静膜電位は-79.3±0.8mV(n=7、N=2)です。(B)電気的にペースを合たたして分離されたCMの炭素繊維記録。平均ピーク力は205±78μN/mm2(n = 7、N=2)。(C) 新たに分離された CM の共焦点画像 (I);培養後48時間後に未伝達(II)および(III)CMをトランスフェクトした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足材料:MATLabスクリプトは、APDと安静時膜電位を決定します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ウサギ心筋細胞におけるGtACR1活性化の電気機械効果を評価するプロトコルを提示する。細胞分離、培養、アデノウイルス伝達、パッチクランプ、炭素繊維技術による機能実験に関する詳細な情報を提供します。

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

このプロトコルを、心筋細胞活動に対する異なる光遺伝学アクチュエーターの生物物理学的効果として使用して、心臓組織および心臓全体における光遺伝学的実験の開発を支援するために試験することができる。パッチクランプ技術とサルコメアトラッキングと炭素繊維支援力測定を組み合わせることで、心室心筋細胞の電気および力学に対するGtACR1光活性化の効果を研究することができます。光遺伝学的阻害は、光除細動に使用される可能性がある。GtACR1は、心臓活動のサイレンシングを可能にする光遺伝学的ツールです。この技術は、滑らかな、単細胞筋細胞研究などの他の研究分野に完全に適用されます。このプロトコルは高スループットスクリーニングには使用できませんが、心筋細胞の電気的および機械的機能を包括的に分析する手段となります。だから、ことわざにあるように、写真は千以上の言葉を言います。ビデオでどれだけ多くの情報を得ることができるでしょうか?単一の筋細胞のストレッチやプローブの準備に関わるツールやテクニックの中には非常に複雑なものがあり、説明に比べてビデオで伝える方がはるかに簡単です。生後9~10週齢のニュージーランドの白いウサギから生理食い物の心臓から血液を洗い流した後、パーフューザスを低カルシウム、高カリウム溶液に切り替え、心臓が鼓動を止めてからさらに2分間心臓を穿ファフーします。酵素溶液を浸透させ、酵素溶液を2分間消化した後にリ循環してリブルした後、5分間消化した後、1分間に16ミリリットルの速度を下げる。消化の40〜50分後に組織が柔らかく見えたら、カニューレから心臓を切断し、すぐに心臓をブロッキング溶液に入れます。組織が完全に覆われるまでブロッキング溶液を追加します。右心室と中隔を切り取り、左心室を分離します。乳頭筋を取り除き、細かい鉗子とピペットを使用して組織を穏やかに引き離し、機械的解離によって細胞を放出します。1ミリメートル平方の細孔でメッシュを通して細胞懸濁液をろ過し、遠心分離によって細胞を沈める。次いで、新鮮なブロッキング溶液中の心筋細胞ペレットを再懸濁する。パッチクランプ実験では、細胞培養の直前にラミニン1ミリリットルあたり100マイクログラムのペトリ皿にオートクレーブカバーリップをコーティングします。炭素繊維実験では、95~5個のエタノールから水への溶液で、ポリHEMAのミリリットル当たり0.12グラムのペトリ皿をコーティングします。心筋細胞を再懸濁してから10~15分後、上清を取り除き、培地中の細胞を再懸濁する。カウント後、ペトリ皿のカバースリップに細胞を1ミリリットル当たり4個の細胞に1.75倍の10倍の目標密度で播種します。37°Cと5%の二酸化炭素で3〜4時間培養します。インキュベーションの終わりに、75の感染の多重度でGtACR1-eGFP用のアデノウイルスタイプ5コードを含む新鮮な培地とカバースリップ培養からの培地を交換する。培養物を48時間培養器に戻します。パッチクランプ実験を行う場合は、マイクロピペットプーラーを使用して、ソーダライムガラスの毛細血管から1.7~2.5メガオームパッチピペットを引き出し、データ取得ソフトウェアを初期化します。細胞を含むカバースリップを外部溶液を含む測定チャンバーに入れ、そのeGFP蛍光に基づいて心筋細胞を選択します。次に、パッチピペットに内部溶液を充填し、ピペットをピペットホルダーに取り付け、塩化銀被覆銀記録ワイヤーを内部溶液に挿入します。ゼロミリボルトのベースラインで15ミリ秒間10ミリボルトパルスを適用するように膜試験を設定します。セルに接続された構成に到達した後、データ収集ソフトウェアでマイナス60ミリボルトの保持電位を持つセル全体モードに切り替えます。次に、膜を破裂させることで細胞全体の構成にアクセスするために、穏やかに負圧を加えます。破裂が成功すると、測定された静電容量の即時増加によって証明されます。光パルスが300ミリ秒のマイナス74ミリボルトで、またはゼロピコインで現在のクランプモードでアクション電位を持つ電圧クランプモードで光活性化プロトコルを記録します。炭素繊維を製造するには、まずピペットをプーラーのピペットホルダーに取り付けます。ガラスの毛細血管を2つのピペットに引き込み、総テーパー長は約11ミリメートル、最終内径は約30マイクロメートルです。次に、ステレオ顕微鏡を使用して、配向円の1つの毛細管を整列させ、ベンダーでキャピラリーの先端を押し下げて最大45度曲げます。ベンダーを取り外した後も、毛細管が45度の角度を維持するまでフィラメントを加熱します。毛細管を曲げた後、柔らかいチューブを装備した細かい鉗子を使用して、チューブから1つの炭素繊維を取り出し、毛細血管の細かい先端に収めます。毛細血管の繊維を曲げまで押し上げましょう。炭素繊維を切って毛細血管の先端から2ミリリットルを投影し、シアノアクリル酸接着剤を使用して各毛細管の前部に繊維を固定します。繊維を校正するには、マイクロマニピュレーターとピエゾモーターで制御されるホルダーに1本のキャピラリーを取り付けます。キャピラリーをセンサーの方向に移動し、センサーに対して位置合わせします。力を生じさせることなく、力センサーに接触する繊維の先端を置きます。ピエゾモーターの総移動は60マイクロメートルです。圧電計を6つの10マイクロメートルのステップで力センサーに向かって動かします。センサーは、電圧当たり0.05ミリニュートンの感度と0〜0.5ミリニュートンの力範囲を有する。各ステップの測定電圧を読み出し、センサーから炭素繊維を取り除きます。心筋細胞を収縮させる力を記録するには、カバーグラスの表面をPoly-HEMAでコーティングし、測定室に置きます。外湯溶液でチャンバーを充填します。両方の炭素繊維を装填した毛細血管をステージマイクロマニピュレータに取り付け、炭素繊維が測定室の表面に水平になるように角度で位置合わせします。繊維が正しく揃っているかどうかを確認するには、測定室の表面に焦点を合わせ、最初のファイバーを下げ、繊維を水平に動かします。繊維の先端は測定室の表面に滑っているべきである。2 番目のファイバーでも同じ手順を実行します。ライトを消した後、培養細胞懸濁液を数滴チャンバーに加え、短い緑色の光パルスを適用して、緑色光刺激に応答して収縮する細胞を選択します。最初の繊維を取り付けるには、繊維を下げて細胞を静かに圧縮し、圧力を解放します。2つの繊維間のサルコメアの最大数を有するために、心筋細胞のもう一方の端にある第2の繊維に平行に第2の繊維を取り付ける。両方の繊維が取り付けられた後、セルがチャンバー表面に接触しなくなるように繊維を持ち上げます。サルコメアを焦点に持ち込み、繊維間のサルコメア長さの追跡ウィンドウを設定し、エッジ検出モジュールを使用してファイバー曲げを追跡します。赤と緑のウィンドウで検出領域を設定し、光強度トレースの最初の導関数でしきい値を定義します。サルコメアの長さと繊維曲げを追跡しながら、光学的に細胞をペースします。この場合、私たちは0.25ヘルツでペースを上げました。少なくとも15の光学的に引き出された収縮を記録した後、フィールドは、細胞を電気的に刺激する。収縮を引き出すしきい値を見つけ、電気ペーシングのしきい値電圧の1.5倍を適用します。阻害プロトコルの場合、電気刺激を適用して収縮を引き出し、様々な光強度でセルを持続光パルスにさらす。光誘発阻害後に少なくとも15の収縮を記録する。GtACR1は、培養ウサギ心筋細胞で発現する。300ミリ秒の光強度でのGtACR1光活性化は、測定されたピーク電流245ピコアアンペアでマイナス74ミリボルトで、内向きの大電流を生じます。この代表的な実験では、アクション電位は、電流注入で1.5倍の閾値を持つか、光パルス10ミリ秒で光学的にトリガされた。光学的にペースの速い心筋細胞は、より遅い作用電位発症を示した。電気的に誘発された作用電位は、持続光下で阻害された。より高い電流注入および持続光適用の間の1.5倍の閾値はまた、作用電位を引き出さない。心筋細胞は、電気ペーシング時に232マイクロニュートン/ミリメートルの収縮力を生成し、光ペーシングに続いて1ミリメートルあたり261マイクロニュートンを261マイクロニュートン生成した。長引く緑色光パルスは、ウサギ心筋細胞からの拡張期カルシウム損失に合わせて収縮力を低下させる抑制後の再発収縮で収縮を阻害した。特に暗闇の中でマイクロプローブを配置することは困難な場合があるため、実験を行う前にこの技術を練習することをお勧めします。それは力の生産と緩和に影響を与えることができる心筋細胞の収縮を分析する際に非常に重要です。等張および園筋収縮解析には、さまざまな後荷重を適用することもできます。これらの技術は、各実験に最も適した光遺伝学的ツールを選択するために重要である心筋細胞における新たに開発された光遺伝学的アクチュエータを活性化することの生物物理学的効果の特徴付けを可能にする。アデノウイルスのトランスダクションと、その後の全てのステップは、バイオセーフティレベルIIの条件下で行う必要がありますのでご注意ください。

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Medicine

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