原発性月経困難症ラットにおける液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法を用いた生および加工されたCyperi根腫サンプルの分析
December 23rd, 2022
ここでは、原発性月経困難症のラットを対象に、超高速液体クロマトグラフィー-高分解能タンデム質量分析(UPLC-MS/MS)を使用して、生および処理されたCyperi根腫(CR)サンプルの比較分析を示します。CR処理ラットと酢処理CR(CRV)ラットの血中濃度および試料成分の変化を調べた。
メタボノミクスは、全体的および動的な代謝反応を測定し、伝統的な漢方薬の全体的な有効性を決定することと一致しています。体の代謝反応による薬物成分の変化は、メタボノミクスで決定することができます。TCMの有効成分をスクリーニングする範囲は、この技術を利用することによって絞り込むことができる。
個々の構成要素を研究することによって、一方性を避けることができます。この方法は同時であり得、血液中に吸収される内因性代謝産物および外因性成分を決定することができる。メタボノミクスは、TCM、薬物毒物学、健康管理、スポーツ、食品などの分野で広く使用されています。
まず、6匹のSprague Dawleyラットのグループを3日間治療するために、Cyperi根腫、CR、または酢(CRV)で処理されたCyperi根腫の必要な抽出物を決定します。この式を使用して、ラットあたりに適用されるCRまたはCRVの体積を計算します。CRVを処理するには、100ミリリットルあたり5.5グラムを超える酢酸を含む100グラムのCRと20グラムの酢を完全に混合し、12時間インキュベートします。
インキュベーション後、混合物を鉄鍋で110〜120°Cで10分間炒めます。次に、混合物を取り出し、室温で冷却します。CR抽出物を調製するには、CR量を摂取したCR量の10倍の純水でCRを2時間浸し、薬用材料が液面以下であることを確認します。
次に、水と薬の混合物を強火で沸騰させ、弱火で20分間沸騰させ続けます。その後、内容物を100メッシュのろ布でろ過し、ろ液を回収します。次に、回収したろ液をロータリーエバポレーターで1ミリリットルあたり1グラムまで抽出液に濃縮します。
CRV抽出物を調製するには、CR抽出で示されているように、浸漬、煮沸、および濃縮の手順を実行します。CRおよびCRV抽出物を試験するために、500マイクロリットルの抽出物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブ中の500マイクロリットルのメタノールにピペットし、30秒間ボルテックスして混合する。サンプルを摂氏4度で16, 500 gで15分間遠心分離します。
次に、上清を取り除き、テストのためにサンプルバイアルに移します。サンプルをテストした後、主成分分析(PCA)と、分析ソフトウェアを使用してモデリングを実行します。代謝物の標準化データをソフトウェアにインポートし、Autofitを使用して分析モデルを構築します。
最後に、スコアを使用してPCAのスコア散布図を取得します。直交偏最小二乗判別分析(OPLS-DA)を実行するには、代謝物とCRおよびCRVグループに関する標準化データをソフトウェアにインポートします。次に、CRデータとCRVデータを、作成したそれぞれのグループにインポートします。
次に、自動調整を使用して分析モデルを構築し、スコアを使用してOPLS-DAのスコア散布図を取得します。最後に、VIP を使用して、プロジェクションの可変有意性または OPLS-DA の VIP 値を取得します。潜在的に異なる代謝物を特定するには、VIP値が1より大きい代謝物を選別します。.
次に、統計ソフトウェアを使用して、学生のT検定によってスクリーニングされた代謝物のP値を計算します。次に、差分代謝物を特定するために、注釈付き代謝物を使用し、KEGGデータベースで照合する差分代謝物を選別します。CR群とCRV群の代謝差の変化をヒートマップで示す。
潜在的な代謝経路を調べるには、MetaboAnalystデータベースにアクセスしてください。パスウェイ分析を使用してさまざまな代謝物をアップロードし、潜在的な代謝経路を取得します。さまざまな代謝物をKEGGデータベースにアップロードして、潜在的な代謝経路を分析します。
分析された月経困難症モデル実験は、プロスタグランジンレベルに有意差を示した。モデルCR群およびCRV群のラットは、オキシトシン注射後に実質的な身もだえ反応を示した。PCA解析の結果、モデル群と比較したCRとCRVのクラスターは、正イオンモードと負イオンモードの両方で有意に分離されていることが示されました。
OPLS-DAを使用して代謝の違いをスクリーニングし、散布図の結果はCRグループとCRVグループが分離されていることを示しました。代謝変動を特定するために単変量統計解析を実施した。火山プロットが示され、各点は異なる代謝物に対応する。
陽性モードでは63の代謝物、陰性モードでは30の代謝物に有意な変化が観察された。差次的代謝物はKEGGおよびHDMBデータベースを使用して決定され、正確に一致する化合物がリストされました。CR群とCRV群の間の示差代謝物の定量値を計算し、クラスター化した。
カラーパッチは、各代謝物が他の代謝物と比較してどのように発現されるかを示します。CR群と比較して、CRV群の4つの異なる代謝物のレベルは増加し、11の代謝物はポジティブイオンモードで減少しました。マイナスイオンモードの場合、4つの差動代謝物が増加し、7つの代謝物が減少した。
KEGG経路解析の結果、代謝差はポジティブモードとネガティブモードの9つの経路と関連していることが示されました。代謝物の違いが多いほど、結果は良くなるため、十分な代謝経路をリンクでき、スクリーニングされた主要な代謝経路がより正確になります。
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概要
本研究は、一次性月経困難症のラットを用いて、超高速液体クロマトグラフィー高分解能タンデム質量分析（UPLC-MS/MS）を用いた原生および加工済みのCyperi rhizoma（CR）サンプルの比較分析を提示します。CR処理済みおよび酢酸で処理したCR（CRV）で処理したラットの血中代謝物およびサンプル成分のレベルの変化を検討します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- メタボロミクス
- 伝統的な中国医学
背景
- メタボロミクスは動的な代謝反応を測定します。
- 伝統的な中国医学（TCM）の有効性を決定するのに役立ちます。
- この技術を使用してTCMの有効成分をスクリーニングできます。
- 内因性代謝物と外因性成分の同時測定を可能にします。
研究目的
- 原生および加工CRの代謝反応を分析すること。
- CRとCRVの血中代謝物レベルへの効果を比較すること。
- 代謝プロファイリングを通じてTCMの有効性を理解を深めること。
使用した方法
- 超高速液体クロマトグラフィー高分解能タンデム質量分析（UPLC-MS/MS）。
- ラットモデルにおける代謝物レベルの比較分析。
- 処理されたラットの血液サンプルの評価。
- サンプル成分の変化の評価。
主な結果
- CRおよびCRV処理間での代謝物レベルの有意な違いの特定。
- CRおよびCRVが影響する代謝経路への洞察。
- 一次性月経困難症の管理における加工CRの有効性を支持する証拠。
- 代謝分析を通じたTCM理解への貢献。
結論
- メタボロミクスはTCMを評価する上で貴重なツールです。
- 加工CRは代謝反応において原生CRよりも潜在的な利点を示します。
- これらの発見の意味をさらに探求するにはさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Metabonomics-driven profiling of Cyperi rhizoma (CR) and its vinegar-processed form (CRV) in a dysmenorrhea rat model enables precise mapping of metabolic pathway modulation and constituent bioavailability. This approach supports mechanistic de-risking and target validation for botanical therapeutics, informing early discovery and translational research decisions. Quantitative metabolite analysis enhances predictive confidence for portfolio triage and prioritization in natural product drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping metabolic pathway shifts after CR and CRV administration.
- Supports biological de-risking through identification of differential metabolites and pathway associations.
- Provides functional target validation by linking constituent changes to analgesic and anti-inflammatory pathways.
- Facilitates predictive confidence for advancing botanical leads in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Delivers validated quantitative metabolite profiles for downstream screening workflows.
- Standardizes measurement of exogenous and endogenous metabolites for reproducibility.
- Enables robust comparison of raw versus processed botanical extracts in assay development.
- Supports reliable evaluation of compound efficacy and mechanistic impact.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic pathway modulation with disease-relevant mechanisms in dysmenorrhea models.
- Provides continuity from discovery-stage metabolic profiling to preclinical biomarker identification.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying pathway-specific effects of botanical processing.
- Enhances predictive de-risking for natural product-based therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This UPLC-MS/MS-based metabonomics workflow integrates from early discovery through preclinical validation, supporting lead identification and mechanistic de-risking for botanical therapeutics.
- Discovery Biology: Quantitative metabolite profiling clarifies pathway engagement and constituent bioavailability.
- Screening: Standardized metabolite measurements enable reproducible comparison of extract efficacy.
- Analytics: Multivariate and univariate statistical outputs (PCA, OPLS-DA, VIP, volcano plots) facilitate condition comparison and differential metabolite identification.
- Translational Research: Pathway analysis links metabolic changes to disease-relevant mechanisms, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for other botanical extracts and disease models, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in botanical drug discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable metabolite analysis workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management for natural product leads.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of botanical candidates based on quantitative pathway data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in UPLC-MS/MS operation and metabolomics data analysis.
- Demands access to advanced analytical instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data processing protocols.
- Adaptation across botanical sources and disease models may require pathway-specific validation.
- Interpretation of metabolic pathway data must be grounded in robust statistical analysis and database annotation.
