硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

DMS-MaPはシーケンシングベースの手法で、RNA構造のスナップショットを取得し、さまざまな条件下でどのように変化するかを学習することができます。結晶学や電子顕微鏡などの従来の構造決定方法とは対照的に、DMS-MaPは細胞やデコンボリュートRNA構造アンサンブルに使用できます。RNA構造は多くの生物学的現象に影響を与えるため、私たちの方法は生物学的研究のほぼすべての分野に機構的な洞察を提供することができます。

まず、89マイクロリットルのリフォールディングバッファーを、最終容量100マイクロリットルの反応ごとに指定された1.5ミリリットルのチューブに移します。化学フードの下に置かれたサーモシェーカーで摂氏37度でチューブを予熱します。10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をPCRチューブに加え、その中に1〜10ピコモルのRNAを移します。

摂氏95度のサーモサイクラーで1分間インキュベートして、RNAを変性させます。そして、RNAのミスフォールディングを避けるために、すぐにチューブをアイスブロックに置きます。次に、RNAをリフォールドするには、摂氏37度のリフォールディングバッファーを含む指定されたチューブにサンプルを追加し、よく混合してから10〜20分間インキュベートします。

次に、RNAサンプルを入れたチューブに10.5モルの濃度の100%硫酸ジメチル(DMS)1マイクロリットルを加え、毎分800〜1, 400回転で振とうしながら反応混合物を5分間インキュベートします。5分間の反応後、60マイクロリットルの100%β-メルカプトエタノールでクエンチし、ボルテックスしてすぐにRNAを氷上に置く前によく混合します。次に、RNAをクリーンアップし、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で溶出します。

分光光度計を用いてRNAを定量する。最後に、修飾RNAを摂氏マイナス80度で保存します。反応混合物をPCRチューブに加えた後、溶出した修飾RNAの少なくとも100ナノグラムを10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水中でPCRチューブに移します。

混合物を摂氏57度でサーモサイクラーで30分から1.5時間インキュベートします。500ヌクレオチドを含む製品を作るには30分で十分です。次に、これに1マイクロリットルの4モル水酸化ナトリウムを加え、ピペットでよく混合し、摂氏95度で3分間インキュベートしてRNAを分解し、相補的DNAからTGIRTを放出します。

カラムベースのアプローチを使用してプライマーを除去し、相補的DNAをクリーンアップします。そしてそれを増幅するためにPCRを行う。ライブラリ調製に進む前に、アガロースゲル上で2マイクロリットルのPCR産物を実行して、PCRの成功を確認します。

次に、シーケンシングのためにフラグメントにインデックスを付ける前に、分光光度計を使用して抽出されたフラグメントを定量します。目的の感染段階まで増殖したウイルス感染細胞を、必要なバイオセーフティレベルを備えた専用の適切なヒュームフードに移します。細胞を含む培養液に2.5%容量のDMSを加え、容器をパラフィルムで密封します。

直ちに容器を摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、慎重にピペットで取り出し、DMS含有培地を適切な化学廃棄物に廃棄します。次に、10ミリリットルのストップバッファーをセルに静かに加え、セルをこすり、15ミリリットルの円錐形のチューブに移します。

チューブを3, 000 gで3分間遠心分離して細胞をペレットダウンします。上清を除去し、細胞ペレットを10ミリリットルのPBSで2回洗浄する。洗浄後は、残留PBSをできるだけ慎重に取り除きます。

ペレットを適量のRNA単離試薬に溶解し、RNA抽出を行う。次に、RNA単離試薬中のホモジナイズ細胞1ミリリットルに200マイクロリットルのクロロホルムを加え、細胞溶液が明るいピンク色になるまで15〜20秒間ボルテックスします。相分離が起こるまで待ちます、それは底に沈降するピンク色の脂質相によって示されます。

上部水相を新しいチューブに移す前に、摂氏4度で15分間約20, 000 gの速度でチューブを回転させます。RNAをクリーンアップし、十分な量のヌクレアーゼフリー水で溶出します。次に、好ましいアプローチを使用してリボソームRNA枯渇を実行した後、適切な量のヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出し、分光光度計を使用して定量します。

精製されたRNAは、RT-PCRで再び使用することができます。上記のWebサーバーを使用して、DMS-MaPデータを便利に分析できます。リードは参照にマップされ、塩基ごとの突然変異がカウントされます。

得られた母集団平均ファイルは、周知のRNA構造予測ソフトウェアにおける制約として使用することができる。結果として得られる最小自由エネルギー構造は、VARNAなどのソフトウェアを使用して視覚化できます。現在のところ、DREAMの安定バージョンのみがRNA構造アンサンブルをデコンボリューションできます。

ただし、この機能をコミュニティ全体でよりアクセスしやすくするための作業は進行中です。T7ポリメラーゼプロモーターの付着により伸長したgBlockフラグメントのin vitro転写は、目的のRNAを生成し、1%アガロースゲル上に300ヌクレオチドの単一バンドとして現れました。DMS修飾RNAに対して実施された遺伝子特異的RT−PCRの成功は、2%アガロースゲル上の300塩基対における単一バンドによって示された。

インデックス付きフラグメントは、予想どおりに約150塩基対高く見えました。DMS処理は、ウイルス感染後4日目に細胞変性効果を示すHCT-8細胞に対して行った。抽出された全RNAは、40Sおよび60Sサブユニットを占める2つの明るいバンドとしてアガロースゲル上に現れました。

リボソームRNAが枯渇した後、2つの明るいバンドは消え、対応するレーンに塗抹標本を残しました。ライブラリー調製後、サンプルはさまざまなサイズ分布を持ち、塗抹標本として現れました。バンドを200〜500ヌクレオチドの間で切り出し、アダプターダイマーを分離した。

SARS-CoV-2ゲノムの構造モデルは、オープンコンフォメーションを有する塩基が塩基対形成に従事する塩基と比較してより高い反応性を有することを示した。塩基の反応性プロファイルは、ウラシルおよびグアニンの反応性値が低く、DMSによって修飾されていないことを示した。我々の手法では、サイズ制約のないハイスループットな方法で細胞内の構造を予測することができます。

制御メトリックは、構造予測の精度に関する洞察を提供するため、非常に重要です。予測の精度をさらに検証するには、構造を乱したり変更したりする実験をさらに実施する必要があります。