Name: 硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶ硫酸ジメチルによるRNA構造プロービング法DMS-MaP。in vitroおよび細胞内でRNA構造をシーケンスベースで解析し、突然変異プロファイリングを行う手法を解説。構造生物学研究に応用可能です。

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<li>Olson, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+large-scale%2C+cell-state-responsive+allosteric+switch+in+the+7SK+RNA+using+DANCE-MaP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery of a large-scale, cell-state-responsive allosteric switch in the 7SK RNA using DANCE-MaP.</a> Molecular Cell. 82 (9), 1708-1723 (2022).</li>
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<li>Lan, T. C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structural+ensembles+of+the+SARS-CoV-2+RNA+genome+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Secondary structural ensembles of the SARS-CoV-2 RNA genome in infected cells.</a> Nature Communications. 13 (1), 1128(2022).</li>
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<li>Fischer, N. M., Polěto, M. D., Steuer, J., vander Spoel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Na%2B+and+Mg2%2B+ions+on+RNA+structures+studied+with+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Influence of Na+ and Mg2+ ions on RNA structures studied with molecular dynamics simulations.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 4872-4882 (2018).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反はありません。

ここでのプロトコルでは、DMS突然変異プロファイリング実験を使用して 、in vitro および細胞内のRNAをプローブする方法について説明します。さらに、Illuminaシーケンシング用のライブラリを準備して、遺伝子特異的データを生成し、取得した.fastqファイルを分析するための手順を説明します。さらに、ゲノムワイドライブラリーアプローチを使用することができる。ただし、遺伝子特異的RT-PCRは、最高品質で最も堅牢なデータを生成します。したがって、サンプル間で比較する場合は、ライブラリの生成によってバイアスが発生するため、サンプルが同じシーケンシング戦略で調製されていることを確認することが重要です。再現性は、常に反復を使用して測定する必要があります。
いくつかの注意事項 RNAは不安定な分子であり、高温とRNaseの両方による分解に敏感です。したがって、個人用保護具(PPE)、RNAseフリー材料、およびRNAse阻害剤の使用などの特別な対策が推奨されます。最も重要なことは、RNAは可能な限り氷上に保管する必要があるということです。これは特に、高温に対してさらに敏感なメチル化RNAに当てはまります。
目的のRNA構造がDMS濃度および緩衝条件に敏感でないことを確認することが重要です。pH 7〜7.5の100mMトリス、100mM MOPS、および100mM HEPESなどの緩衝液は高いシグナルを与えるが、反応中にpHを維持するには十分ではない可能性がある21。DMSは水中で加水分解してpHを低下させるため、修飾反応中に中性pHを維持するためには強力な緩衝液が重要です。ビシンの添加は、pHをわずかに塩基性21 として維持するのに役立つことが示されていますが、GsおよびUsのDMS修飾が低くなり、有益である可能性がありますが、AsおよびCsよりもはるかに低いシグナルが生成されるため、個別に分析する必要があり、このプロトコルではこれ以上説明しません。
遺伝子特異的RT-PCRでは、修飾されたRNAはDNAに逆転写され、PCRによって断片に増幅されます。RNAのサイズは理論的には無制限ですが、逆転写反応中のバイアスを防ぐために、これらのPCRフラグメントは400〜500塩基対(bp)の長さを超えてはなりません。理想的には、フラグメントはシーケンシング実行の範囲内にある必要があります(すなわち、シーケンシングが150 x 150サイクルのペアエンドシーケンシングプログラムを使用して行われる場合、単一のフラグメントは300 bpを超えてはなりません)。サイクル数が少ないシーケンシングプログラムを使用する場合、dsDNaseを使用してPCR産物を断片化できます。さらに、プライマー配列内の配列は構造情報を保持しないため、プローブされたRNAが>1フラグメントを含む場合、フラグメントは重なり合う必要があります。RT反応には、異なるフラグメント(最大10種類のRTプライマー)に対する複数のRTプライマーを含めることができます。配列によっては、RTプライマーをプールすると逆転写の効率が低下する可能性がありますが、通常はうまく機能します。各PCR反応は別々に実施する必要があります。
DMSでRNAをプロービングする場合、多くのRNAは熱力学的に不安定であり、温度などの環境要因に基づいて立体構造を変化させるため、実験条件がさらに役割を果たします。不規則性を避けるために、実験条件は、反応時間に関しても、可能な限り一定に保つ必要があります。バッファー条件は、RNA24の適切な折り畳みを確実にするために、緩衝能と一価イオン(Na)および二価イオン(Mg)の存在という基本条件が維持されている場合、ある程度交換可能であるようです17、20、22、23。
改変RNAのライブラリー調製に関しては、いくつかの側面を考慮する必要があります。まず、前述のように、修飾されたRNAは修飾されていないRNAよりも安定性が低いため、最適なフラグメントサイズ分布のために断片化時間の最適化が必要になる場合があります。さらに、特定のRNAライブラリ調製キット、および他の多くのRNAseqアプローチでは、逆転写キットでランダムプライマーを使用します。これにより、特に遺伝子の3'で参照のカバレッジが低下し、最終的にはカバレッジの深さが不十分になる可能性があります。特定の領域のカバレッジが低すぎる場合は、構造予測からそれらのベースを削除する必要がある場合があります。RT-PCRおよび全ゲノムRNAseqキットとは別に、他のライブラリ調製アプローチを使用できます。RNAへの3'および/または5'アダプターのライゲーションを含むプロトコルは、RNAの小さな断片を使用する場合、またはプライマー領域でのプロービング情報の損失を回避する必要がある場合に有利です。
最後に、化学プロービング実験の分析は常に慎重に解釈する必要があります。現在、配列単体から任意のRNAのRNA構造を高精度に予測するソフトウェアはありません。化学的プロービングの制約により精度が大幅に向上しますが、長いRNA(>500 nt)の優れたモデルを生成することは依然として困難です。これらのモデルは、他のアプローチおよび/または突然変異誘発によってさらにテストする必要があります。RNA予測ソフトウェアは、塩基対の最大数を最適化するため、RNAフォールディングを正確に表さない可能性のあるオープンコンフォメーションに著しくペナルティを課します5。したがって、得られた構造モデルは、Lanら20に例示されているように、基礎となる化学プロービングデータ(例えば、AUROCによる)および反復間(例えば、mFMIによる)との予測一致を定量化することによってテストされるべきである。
理想的には、得られた構造モデルに挑戦するための異なるシステムでのいくつかの実験を使用して、仮説を強化する必要があります。これらには、 in vitro および細胞内アプローチ、代償的突然変異、および異なる細胞株および種の使用が含まれます。さらに、生の反応性は、RNAフォールディングアンサンブルの「グラウンドトゥルース」スナップショットを記録するため、構造予測と同等かそれ以上に有益であることがよくあります。そのため、生の反応性は、異なる条件間の構造変化を比較するのに非常に適しており、有益です。重要なことに、計算予測を伴う化学的プロービング制約を使用して計算された最も低い自由エネルギー構造は、完全な構造モデルに向けた出発仮説としてのみ使用する必要があります。

RNAが構造1,2と触媒3の両方の特性を持っているという発見以来、RNAの重要性と多数の生物学的プロセスにおけるその調節機能が徐々に明らかにされてきました。実際、遺伝子制御に対するRNA構造の影響はますます注目を集めています4。タンパク質と同様に、RNAは一次、二次、三次構造を持ち、それぞれヌクレオチドの配列、塩基対相互作用の2Dマッピング、およびこれらの塩基対構造の3Dフォールディングを指します。三次構造を決定することは、RNA依存プロセスの背後にある正確なメカニズムを理解するための鍵ですが、二次構造はRNA機能に関しても非常に有益であり、さらなる3Dフォールディングの基礎となります5。
しかし、RNA構造の決定は、従来のアプローチでは本質的に困難でした。タンパク質については、結晶学、核磁気共鳴(NMR)、極低温電子顕微鏡(クライオEM)により構造モチーフの多様性を決定できるようになり、配列のみからの構造予測が可能になりましたが6、これらのアプローチはRNAに広く適用できません。実際、RNAは、対応するアミノ酸と比較してはるかに多くの立体配座および回転自由度を有するビルディングブロック(ヌクレオチド)を有する柔軟な分子である。さらに、塩基対形成による相互作用は、アミノ酸残基の相互作用よりも動的で汎用性が高い。その結果、古典的なアプローチは、明確に定義された非常にコンパクトな構造を持つ比較的小さなRNAに対してのみ成功しています7。
RNA構造を決定するための別のアプローチは、次世代シーケンシング(NGS)と組み合わせた化学的プロービングによるものです。この戦略は、RNA配列中の各塩基の結合状態(すなわち、その二次構造)に関する情報を生成する。簡単に言えば、塩基対形成に関与していないRNA分子中の塩基は、小さな化合物によって差動的に修飾される。これらのRNAを特殊な逆転写酵素(RT)で逆転写すると、その修飾が変異として相補的デオキシリボ核酸(cDNA)に組み込まれます。次に、これらのcDNA分子はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅され、配列決定されます。結合または非結合としてのそれらの「状態」に関する情報を得るために、目的のRNAの各塩基における突然変異頻度が計算され、制約8として構造予測ソフトウェアに入力される。最近傍ルール9 および最小自由エネルギー計算10に基づいて、このソフトウェアは、得られた実験データ11、12に最も適合する構造モデルを生成する。
DMS-MaPseqはDMSを使用しており、ワトソンクリック面のアデノシン中のN1窒素とシトシン中のN3窒素を非常に特異的な方法でメチル化します13。逆転写に耐熱性第II群イントロン逆転写酵素(TGIRT-III)を使用すると、前例のないS/N比の突然変異プロファイルが作成され、2つ以上の代替立体配座によって生成された重複プロファイルのデコンボリューションも可能になります14,15。さらに、DMSは細胞膜や組織全体を貫通できるため、生理学的状況でのプロービングが可能になります。ただし、処理手順のばらつきが結果に影響を与える可能性があるため、高品質のデータを生成することは困難です。したがって、in vitroおよび細胞内DMS-MaPseqの両方の詳細なプロトコルを提供して、バイアスを減らし、新規参入者が遭遇する可能性のある困難を乗り越えてメソッドに導くようにします。特に最近のSARS-CoV2のパンデミックに照らして、RNAウイルスに関する高品質のデータは、遺伝子発現を研究し、可能な治療法を見つけるための重要なツールです。

<table><tbody><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>10787018</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>M6250-250ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5</td><td>AM9720</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>Advantage PCR</td><td>639206</td><td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>CloneAmp HiFi PCR Premix</td><td>639298</td><td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>DMS</td><td>D186309 &nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 各 10 mM</td><td>U151B</td><td>Promega</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel EX アガロースゲル、2%</td><td>G402022</td><td>サーモ</td><td>プレキャストアガロースゲル</td></tr><tr><td>エタノール (200 プルーフ)</td><td>E7023-4X4L</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Falcon チューブ、15 mL、50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td></td><td></td><td>共沈殿物</td></tr><tr><td>HCT-8 細胞&nbsp;</td><td>ATCC #CCL-244</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インビトゲン&nbsp;MgCl<サブ>2</サブ>&nbsp;(1メートル)</td><td>AM9530G</td><td>fisherscientific</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>278475</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 転写</td><td>AM1334</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novex TBE ゲル、8%、10 ウェル</td><td>EC6215BOX</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>OC43&nbsp;</td><td>ATCC #VR-1558</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboRuler Low Range RNA Ladder</td><td>SM1831</td><td>Thermo</td><td></td></tr><tr><td>RNAse H</td><td>M0297L</td><td>NEB</td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム、0.4 M、pH 7.2</td><td>102090-964</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液</td><td>S8263-150ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II FSB および DTT 用</td><td>Thermo</td><td></td> <td>18064014逆転写酵素</td></tr><tr><td>TGIRT-III 酵素</td><td>TGIRT50</td><td>インゲックス</td><td></td></tr><tr><td>ザ オリゴ クリーン &コンセントレーター</td><td>D4060</td><td>Genesee</td><td></td></tr><tr><td>The RNA Clean &濃縮器キットは、RNAクリーンアップキット</td><td>R1016</td><td>Genesee</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol試薬</td><td>15596018</td><td>Thermo</td><td>RNA単離試薬</td></tr><tr><td>水(RNA作業用)(DEPC処理、DNASE、RNASEフリー/分子バイオル。</td><td>BP561-1</td><td>fisherscientific</td><td></td></tr><tr><td>xGen Broad-range RNA Library Prep 16rxn</td><td>10009865</td><td>IDT</td><td></td></tr><tr><td>Zymo RNA クリーンカラムおよび濃縮カラム</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

硫酸ジメチルによるrna構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells

事実上あらゆる生物学的プロセスにおけるRNA構造の役割は、特に過去10年間でますます明らかになっています。しかし、RNA結晶構造解析やクライオEMなどのRNA構造を解明するための古典的なアプローチは、急速に進化する分野とハイスループットソリューションの必要性に追いつくことができませんでした。硫酸ジメチル(DMS)を用いたシーケンシングによる変異プロファイリング MaPseqは、塩基とDMSとの反応性からRNA構造を推測するためのシーケンシングベースのアプローチです。DMSは、塩基が不対の場合、ワトソンクリック面でアデノシン中のN1窒素とシトシン中のN3をメチル化します。改変RNAを耐熱性第II群イントロン逆転写酵素(TGIRT-III)で逆転写すると、メチル化塩基がcDNAに変異として組み込まれます。得られたcDNAをシーケンシングし、それを参照転写物にマッピングする場合、各塩基の相対突然変異率は、塩基の「状態」がペアまたは非ペアであることを示します。DMS反応性はin vitro と細胞の両方で高いS/N比を持っていますが、この方法は取り扱い手順のバイアスに敏感です。このバイアスを減らすために、この論文は、細胞内のDMSおよび in vitro 転写RNAを使用したRNA治療のプロトコルを提供します。

遺伝子特異的イン ビトロ DMS-MaP SARS2の5'UTRを調べるために、ウイルスの最初の300 bpを3つのプライマーとともにgBlock配列として注文しました。それらには、PCR を介して フラグメントを伝播するための2つのプライマー(「FW」および「RV」)と、T7プロモーター(「FW-T7」)を結合するための1つが含まれていました。これらの配列を 表1に見ることができる。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>名前</td>
			<td>シーケンス (5'-&gt;3')</td>
		</tr><tr><td>ティッカー</td>
			<td>ATTAAAGGTTTATTATTACCTTCCCAGGTAAC</td>
		</tr><tr><td>ティッカー</td>
			<td>GCAAACTGAGTTGGACGTGT</td>
		</tr><tr><td>FW-T7</td>
			<td>TAATACGACTCACTATAGG ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC</td>
		</tr></tbody></table>表1:SARS-CoV2 5'UTRのDMS-MaP RT-PCRのプライマー配列。 ここで、FW-T7およびRVは、 インビトロ 転写のためのDNA鋳型を生成するために必要であり、RVは逆転写に使用され、FW-RVプライマーペアは、その後のcDNAのPCR増幅に使用される。プライマーは、SARS-CoV2ゲノム(FW)の冒頭と、関心のある領域のすぐ下流の配列にアニールします。略語:DMS-MaP =硫酸ジメチルを用いたシーケンシングによる変異プロファイリング;RT-PCR = 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;SARS-CoV2 =重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2;UTR = 未翻訳領域;RV =リバースプライマー;FW = フォワードプライマー。
gBlock断片からRNAを生成するために、T7ポリメラーゼプロモーターの配列を、 図2Aに見られるスキームに従ってPCRプレミックスを用いたオーバーラップPCRを用いて結合させた。細長い断片から、T7転写キットを用いてRNAを生成した。続いて、DNAテンプレートをDNaseを用いて消化し、RNAクリーン&amp;コンセントレータカラムを用いて単離したRNAとした。
in vitro転写の品質管理は、RNA産物をssRNAラダーと一緒に1%アガロースゲル上で実行することによって行われました。目に見えるバンドは1つしかなかったため、in vitro DMSプロービングとRT-PCRを実行しました(図2Bを参照)。
PCR反応の成功を検証するために、dsDNAラダーを使用してサンプルを2%アガロースゲル上で実行しました。インデックス作成後、バンドは同じゲル上で~150 bp高く、インデックスプライマーのサイズを考慮します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig2v2.jpg"> 図2:DNAテンプレートの インビトロ 転写。 (ア)内因性RNAポリメラーゼプロモーターをまだ有していないDNAテンプレートを in vitro で転写するには、最初にオーバーラップPCRによってテンプレートを添付する必要があります。これは、所望の断片と重なる最初の塩基の上流の配列TAATACGACTCACTATAGG(T7 RNAポリメラーゼの場合)を含むフォワードプライマーを使用することによって行われる。ここでの下線付き基部は、ポリメラーゼの転写開始部位を象徴する。プロモーターがdsDNA断片に結合すると、T7ポリメラーゼによって転写することができます。重要なことに、ポリメラーゼは、言及されたプロモーター配列に対向する鎖を鋳型(青)として使用し、示されたプロモーター配列(赤)のすぐ下流の配列と同一のRNAを効果的に生成する。(B)ssRNAラダー(レーン1)および300ntで in vitro 転写されたRNA産物(レーン2)を有する1%アガロースゲル。(C)GeneRuler 1 kbとラダーを加えた2%アガロースゲル(レーン1)、RT-PCR後のPCR産物を300 bpで実行した後(レーン2)、およびライブラリ調製後のインデックスフラグメントを470 bpで実行(レーン3)。略語:RT-PCR =逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;DMS = 硫酸ジメチル;nt =ヌクレオチド;dsDNA = 二本鎖DNA;ssRNA = 一本鎖RNA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ウイルス感染細胞を用いた全ゲノム インビボ DMS-MaP DMS処理の前に、HCT-8細胞をOC43に感染させた。感染後4日目に細胞変性効果(CPE)が観察された場合( 図3Aに見られるように)、これらの細胞を処理し、RNAを抽出してリボデロールしました。アガロースゲル上で全RNAを走らせると、リボソームの40Sおよび60Sサブユニットを占める2つの明るいバンドが見え、これらは総RNA質量の約95%を占めます( 図3Bを参照)。RNA抽出が失敗した場合、または分解された場合(例えば、複数回の凍結融解サイクルによって)、RNA分解産物がゲルの底部に見えた( 図3C、2番目のレーンを参照)。さらに、rRNAが枯渇した後、2つの明るいバンドは消失し、レーンに塗抹標本を残しました( 図3C、3番目のレーンを参照)。最後に、ライブラリ調製後、サンプルはさまざまなサイズ分布を持ち、最終的なPAGEゲルに塗抹標本として示されました。バンドは、これらのライブラリを分析するために計画された150 x 150ペアエンドシーケンシングランと一致して、200ヌクレオチド(nt)から500ntの間で切除されました。最も重要なことは、~150 ntで動作するアダプターダイマーが分離されたことです( 図3Dを参照)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig3v2.jpg"> 図3:ウイルス感染細胞を用いた 生体内 DMS-MaPのチェックポイント 。 (a)ウイルスに感染したHCT-8細胞の光学顕微鏡像、4日間dpi。細胞死による悪影響を最小限に抑えながら、全RNAから可能な限り最高のウイルスRNAを得るには、画像に見られるように、CPEの開始時またはその前にDMSを追加する必要があります。(B)1 μgの総RNAの6つのサンプルを含む1%アガロースゲル。各レーンには、リボソームRNAが全RNAの~95%を占めるため、40Sおよび60Sサブユニットを占める2つの明るいバンドが見えます。注:細胞内DMS処理では、RNAの断片化と塗抹標本が発生しますが、2つのrRNAバンドはまだ見えるはずです。修飾後の軽度の断片化は、メチル化マークを含む情報が生成され、細胞がまだ生きている間にDMSインキュベーション中にRNA構造について報告するため、許容されます。(C)GeneRuler 1 kbの1%アガロースゲルとラダーDNAマーカー(レーン1)を-80°Cで6ヶ月間保存した全RNAとリボデポリマーRNA(レーン3)。数回の凍結融解サイクルでRNAを長期間保存すると、RNAは分解を開始するため、プロービング実験には使用しないでください。さらに、全RNAをリボデロールした後、リボソームの40Sおよび60Sサブユニットを占める2つの明るいバンドがフェードし、残留RNAの塗抹標本が現れ始める。(D)GeneRuler 1 kbとラダーDNAマーカー(レーン1)のPAGEゲルと、全ゲノムで調製されたRNAのライブラリサンプル。ゲルは、シーケンシングのニーズに基づいて切除する必要があります。両側から150サイクルに及ぶペアエンドシーケンシングランの場合、ゲルは300 bpから500 bpの間で切除する必要があります。アダプターダイマー(170 bpで実行)を分離する必要があります。略語:DMS-MaP =硫酸ジメチルを用いたシーケンシングによる変異プロファイリング;DPI =感染後の日数。CPE =細胞変性効果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
シーケンス処理後、.fastq ファイルは、.fasta 参照ファイルと共に DREEM ウェブサーバー (http://rnadreem.org/) にジョブをサブミットすることによって分析されました。サーバーによって生成される出力には、fastqc(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)およびTrimGalore(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)によって生成された品質管理ファイル、および母集団平均突然変異頻度を含むその他の出力ファイルが含まれます。インタラクティブ.html(図4Aを参照)形式の突然変異頻度を示す図と、塩基あたりの生の再活性化を含む.csvファイルと、いくつかのRNA構造予測ソフトウェアで読み取り可能なstruct_constraint.txtファイルとは別に、これには、バイリード突然変異について報告するbitvector.txtファイルも含まれています。これらから、.fastaファイルとstruct_constraint.txtファイルをRNAfoldウェブサーバーに提出することによって、母集団平均構造を計算しました(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)。これは、ViennaRNAソフトウェアを使用して、最小自由エネルギーに基づいて構造予測を生成し、オンラインで表示したり、ctまたはVienna形式でダウンロードしたりできます。RNA構造モデルを生成するために、これらのダウンロード可能なファイルをVARNAに提出しました(https://varna.lri.fr/、図4Bを参照)。最後に、ビットベクトル.txtファイルをDRIEM(https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1)の安定バージョンで使用して、代替RNAコンフォメーションを検索できます。DREEMを使用して優れた構造モデルを取得するには、ベースあたり10,000リードのカバレッジを達成する必要があります。クラスタリングの場合、ベースあたり最大 100,000 回の読み取りが必要になる場合があります。ワークフロー全体の概要を図 4C に示します。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64820/64820fig4v2.jpg"> 図4:SARS-CoV2 5'UTRの化学的プロービング実験から得られた例示的なデータ。 (A)塩基で着色されたSARS-CoV2ゲノムの最初の300塩基の反応性プロファイル(A:赤、C:青、U:緑、G:黄)。生の反応性は、絶対突然変異頻度をカバレッジで割ったものとして計算されます。開環立体配座を有する塩基は高い反応性値を有する。塩基対形成を行う塩基は反応性値が低い。uとGはDMSによって修飾されておらず、ポリメラーゼの不忠実性に起因する反応性値が低い。予測はDREEMウェブサーバーで行われました。(B)VARNAで得られた反応性値から予測されたSARS-CoV2 5'UTRの構造モデル。反応性値の高い塩基は赤色で表示されます。反応性の低い塩基は白色に着色されます。(C)シーケンシングから得られた.fastqファイルから始まるDMS-MaP解析のワークフロー。これらはfastqcを使用して品質管理できます。アダプター配列は TrimGalore を使用してトリミングされ、Bowtie2 を使用して参照配列にマップされます。取得した .bam ファイルから、DREEM は各読み取りのミューテーションをカウントし、ミューテーション マップまたは .bitvector.txt ファイルを作成します。これらは、位置依存的な方法で各リードの突然変異を報告し、それに基づいて母集団平均反応性プロファイルを作成することができます。あるいは、DREEMを使用してビットベクターをクラスタリングし、代替RNAコンフォメーションを検索することもできます。最後に、得られた構造モデルをソフトウェア(VARNAなど)を使用して視覚化します。略語:DMS-MaP =硫酸ジメチルを用いたシーケンシングによる変異プロファイリング;SARS-CoV2 =重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64820/64820fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、突然変異プロファイリング実験のために硫酸ジメチルでRNAを修飾するための指示を提供します。これには、2つの代替ライブラリ調製方法を使用したin vitro および in vivo プロービングが含まれます。

硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

The role of RNA structure in virtually any biological process has become increasingly evident, especially in the past decade. However, classical ...

DMS-MaPはシーケンシングベースの手法で、RNA構造のスナップショットを取得し、さまざまな条件下でどのように変化するかを学習することができます。結晶学や電子顕微鏡などの従来の構造決定方法とは対照的に、DMS-MaPは細胞やデコンボリュートRNA構造アンサンブルに使用できます。RNA構造は多くの生物学的現象に影響を与えるため、私たちの方法は生物学的研究のほぼすべての分野に機構的な洞察を提供することができます。まず、89マイクロリットルのリフォールディングバッファーを、最終容量100マイクロリットルの反応ごとに指定された1.5ミリリットルのチューブに移します。化学フードの下に置かれたサーモシェーカーで摂氏37度でチューブを予熱します。10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をPCRチューブに加え、その中に1〜10ピコモルのRNAを移します。摂氏95度のサーモサイクラーで1分間インキュベートして、RNAを変性させます。そして、RNAのミスフォールディングを避けるために、すぐにチューブをアイスブロックに置きます。次に、RNAをリフォールドするには、摂氏37度のリフォールディングバッファーを含む指定されたチューブにサンプルを追加し、よく混合してから10〜20分間インキュベートします。次に、RNAサンプルを入れたチューブに10.5モルの濃度の100%硫酸ジメチル(DMS)1マイクロリットルを加え、毎分800〜1, 400回転で振とうしながら反応混合物を5分間インキュベートします。5分間の反応後、60マイクロリットルの100%β-メルカプトエタノールでクエンチし、ボルテックスしてすぐにRNAを氷上に置く前によく混合します。次に、RNAをクリーンアップし、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で溶出します。分光光度計を用いてRNAを定量する。最後に、修飾RNAを摂氏マイナス80度で保存します。反応混合物をPCRチューブに加えた後、溶出した修飾RNAの少なくとも100ナノグラムを10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水中でPCRチューブに移します。混合物を摂氏57度でサーモサイクラーで30分から1.5時間インキュベートします。500ヌクレオチドを含む製品を作るには30分で十分です。次に、これに1マイクロリットルの4モル水酸化ナトリウムを加え、ピペットでよく混合し、摂氏95度で3分間インキュベートしてRNAを分解し、相補的DNAからTGIRTを放出します。カラムベースのアプローチを使用してプライマーを除去し、相補的DNAをクリーンアップします。そしてそれを増幅するためにPCRを行う。ライブラリ調製に進む前に、アガロースゲル上で2マイクロリットルのPCR産物を実行して、PCRの成功を確認します。次に、シーケンシングのためにフラグメントにインデックスを付ける前に、分光光度計を使用して抽出されたフラグメントを定量します。目的の感染段階まで増殖したウイルス感染細胞を、必要なバイオセーフティレベルを備えた専用の適切なヒュームフードに移します。細胞を含む培養液に2.5%容量のDMSを加え、容器をパラフィルムで密封します。直ちに容器を摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、慎重にピペットで取り出し、DMS含有培地を適切な化学廃棄物に廃棄します。次に、10ミリリットルのストップバッファーをセルに静かに加え、セルをこすり、15ミリリットルの円錐形のチューブに移します。チューブを3, 000 gで3分間遠心分離して細胞をペレットダウンします。上清を除去し、細胞ペレットを10ミリリットルのPBSで2回洗浄する。洗浄後は、残留PBSをできるだけ慎重に取り除きます。ペレットを適量のRNA単離試薬に溶解し、RNA抽出を行う。次に、RNA単離試薬中のホモジナイズ細胞1ミリリットルに200マイクロリットルのクロロホルムを加え、細胞溶液が明るいピンク色になるまで15〜20秒間ボルテックスします。相分離が起こるまで待ちます、それは底に沈降するピンク色の脂質相によって示されます。上部水相を新しいチューブに移す前に、摂氏4度で15分間約20, 000 gの速度でチューブを回転させます。RNAをクリーンアップし、十分な量のヌクレアーゼフリー水で溶出します。次に、好ましいアプローチを使用してリボソームRNA枯渇を実行した後、適切な量のヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出し、分光光度計を使用して定量します。精製されたRNAは、RT-PCRで再び使用することができます。上記のWebサーバーを使用して、DMS-MaPデータを便利に分析できます。リードは参照にマップされ、塩基ごとの突然変異がカウントされます。得られた母集団平均ファイルは、周知のRNA構造予測ソフトウェアにおける制約として使用することができる。結果として得られる最小自由エネルギー構造は、VARNAなどのソフトウェアを使用して視覚化できます。現在のところ、DREAMの安定バージョンのみがRNA構造アンサンブルをデコンボリューションできます。ただし、この機能をコミュニティ全体でよりアクセスしやすくするための作業は進行中です。T7ポリメラーゼプロモーターの付着により伸長したgBlockフラグメントのin vitro転写は、目的のRNAを生成し、1%アガロースゲル上に300ヌクレオチドの単一バンドとして現れました。DMS修飾RNAに対して実施された遺伝子特異的RT−PCRの成功は、2%アガロースゲル上の300塩基対における単一バンドによって示された。インデックス付きフラグメントは、予想どおりに約150塩基対高く見えました。DMS処理は、ウイルス感染後4日目に細胞変性効果を示すHCT-8細胞に対して行った。抽出された全RNAは、40Sおよび60Sサブユニットを占める2つの明るいバンドとしてアガロースゲル上に現れました。リボソームRNAが枯渇した後、2つの明るいバンドは消え、対応するレーンに塗抹標本を残しました。ライブラリー調製後、サンプルはさまざまなサイズ分布を持ち、塗抹標本として現れました。バンドを200〜500ヌクレオチドの間で切り出し、アダプターダイマーを分離した。SARS-CoV-2ゲノムの構造モデルは、オープンコンフォメーションを有する塩基が塩基対形成に従事する塩基と比較してより高い反応性を有することを示した。塩基の反応性プロファイルは、ウラシルおよびグアニンの反応性値が低く、DMSによって修飾されていないことを示した。我々の手法では、サイズ制約のないハイスループットな方法で細胞内の構造を予測することができます。制御メトリックは、構造予測の精度に関する洞察を提供するため、非常に重要です。予測の精度をさらに検証するには、構造を乱したり変更したりする実験をさらに実施する必要があります。

probing-rna-structure-with-dimethyl-sulfate-mutational-profiling-with

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硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

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