ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

このRNAにおけるホスホロチオエートアプローチの全体的な目標は、飽和突然変異誘発を1つのステップで行うことです。この方法は、遺伝子制御などの分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1つのステップでRNAのタンパク質結合部位の飽和突然変異誘発を達成できることです。

このシングルステップ飽和突然変異誘発プロトコルの重要なステップは、タンパク質結合部位内に非野生型ヌクレオチドをDNAテンプレートにドープすることです。まず、DNAシンセサイザー上で化学合成によりT7プライマーを合成します。次に、タンパク質結合部位に対応するドープされたオリゴヌクレオチドを合成します。

この例では、下線が引かれた配列は、ショウジョウバエの性致死タンパク質結合部位の逆補体を含み、各ドーピング部位はXで表されます。緑色の配列はT7プライマー配列と相補的であり、in vitro転写のT7プロモーターです。このプロトコルの次のステップは、各ホスホロチオエートヌクレオチドと別々のRNAの合成とそれに続くRNAの5プライム末端放射性標識です。

各ホスホロチオエートのRNAを20マイクロリットルの転写反応で合成します。各微量遠心チューブに、T7転写バッファー、1マイクロモルT7オリゴヌクレオチド、1マイクロモルドープオリゴヌクレオチド、10ミリモルDTT、2ミリモルGTP、ATP、CTP、UTP各1ミリモル、T7 RNAポリメラーゼ1マイクロリットルあたり2ユニットを追加します。一方のチューブに0.167ミリモルのα-チオATPを、もう一方のチューブに0.05ミリモルのα-チオUTPを添加します。

RNA合成反応混合物を摂氏37度で2時間インキュベートします。2時間後、2.5マイクロリットルの熱に不安定なαホスファターゼと2.5マイクロリットルの10Xホスファターゼバッファーを各RNAサンプルに加えます。摂氏37度で10〜30分間インキュベートし、5プライムリン酸塩を除去します。

アルカリホスファターゼ酵素を80°Cで2〜5分間加熱して不活性化します。残りのステップには放射能の使用が含まれ、適切な予防措置と放射能から保護するためのプレキシガラスシールドを使用して実行する必要があります。脱リン酸化RNAの5プライム末端を放射性標識するには、10マイクロリットルの反応容量で1マイクロリットルのT4ポリヌクレオチドキナーゼと1マイクロリットルのGamma P32 ATPを使用します。

反応混合物を摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を65°Cで20〜30分間加熱して不活性化します。10%変性ポリアクリルアミドゲルで反応液を泳動します。

オートラジオグラフィーでゲル上のRNAを特定し、放射性標識RNAを含むゲルスライスを切り取ります。マイクロ遠心チューブ内でゲルスライスをピペットチップで側面に押し付けて粉砕し、プロテイナーゼKバッファーを加えます。チューブを室温で2時間から一晩回転させます。

次に、ゲルスラリーを遠心分離し、緩衝液を回収し、ゲルを廃棄します。各溶液を等量のフェノールクロロホルムで2回抽出します。その後、クロロホルムで溶液を一度抽出します。

水相を収集し、それに0.1容量の3モル酢酸ナトリウムpH 5.2、キャリアtRNAまたはグリコーゲン、および2.5容量のエタノールを追加します。サンプルを摂氏マイナス80度に1時間保ちます。高速微量遠心分離機でサンプルを16、873倍gで5〜10分間遠心分離します。

緩衝エタノール溶液は、RNAペレットを乱さないように慎重に除去します。ペレットを70%エタノールで洗浄し、2〜5分間遠心分離します。エタノールを慎重に取り出し、ペレットを風乾します。

各ペレットを20〜50マイクロリットルのDEPC処理水に再懸濁します。使用するまでマイナス20°Cで保管してください。ここでは、干渉によるパーティション分割の概念を示します。

タンパク質結合の過程で、RNA分子はタンパク質結合画分と非結合画分の間で分配されます。特定の位置にある特定のヌクレオチドがタンパク質結合を阻害する場合、そのヌクレオチドはタンパク質結合画分から優先的に除外されます。その後、ヨウ素を使用して、ホスホロチオエートの取り込み部位でRNAを切断します。

この手順を開始するには、10ミリモルのTris-HCl、1ミリモルのDTT、50ミリモルの塩化カリウム、0.5単位/マイクロリットルのRNase阻害剤、0.09マイクログラム/マイクロリットルのアセチル化ウシ血清アルブミン、1ミリモルのEDTA、0.15マイクログラム/マイクロリットルのtRNA、5プライムエンド放射性標識RNA、および適切な濃度のタンパク質の6マイクロリットルを含む各反応でタンパク質-RNA結合反応を設定します。タンパク質結合反応液を摂氏25度で20〜30分間インキュベートします。ニトロセルロースフィルター結合により、タンパク質結合型RNA画分と非結合型RNA画分を分離します。

室温で真空マニホールドに接続されたニトロセルロースフィルターに結合反応を適用します。RNAタンパク質複合体のみがフィルターに保持され、結合していないRNAはフィルターを通過します。ニトロセルロースフィルターの保持された放射性RNAを含む部分を微量遠心チューブに収まるように小さく切り取り、十分なプロテイナーゼKバッファーを加えてフィルターピースを浸します。

フィルターピースからRNAを2〜3時間または一晩溶出します。次に、各チューブから溶液を新しいチューブに移し、前に示したようにフェノールクロロホルムとクロロホルムで抽出します。水相を採取し、それに0.1容量の3モル酢酸ナトリウム、pH 5.2、および2.5容量のエタノールを加え、冷凍庫でインキュベートします。

前述したようにRNAを遠心分離、洗浄、乾燥した後、DEPC処理水にRNAを再懸濁します。ヨウ素を含むすべてのステップは、排気フードで実行する必要があります。ホスホロチオエートの取り込み部位でRNAを切断するには、各RNAサンプルに、最大10マイクログラムのキャリアtRNAを含む20マイクロリットルのDEPC処理水に1ミリモルのヨウ素を加えます。

室温で5分間インキュベートします。前述したように酢酸ナトリウムとエタノールを添加して、切断したRNAを沈殿させます。切断されたRNAをローディング色素に再懸濁し、変性ゲル化します。

加熱後、サンプルを15〜20%変性ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動によりRNA断片を分離します。ポリアクリルアミドゲルをX線フィルムに露光し、オートラジオグラフィーを使用して結合画分と全プールのバンドを検出します。この回路図は、干渉によるパーティショニングの概念を示しています。

レーンTでは、全RNAフラクション、バンド強度はすべてのドープ位置でほぼ等しくなります。タンパク質結合RNA画分では、位置1、4、および7では、ヌクレオチドは結合に影響を与えません。しかし、3位と6位では結合を阻害し、結合画分から除外されます。

位置 5 では、干渉は部分的です。各ヌクレオチドのペアレーンを比較することで、4つのヌクレオチドすべての分析が可能になります。このオートラジオグラフは、変性ゲルからの2対のレーンを示しています。

レーンTはトータルRNAで、レーンBはタンパク質結合RNAです。縦線は性致死性結合部位を示しています。α-チオアラインペアの場合、バンド1、2、3、および5は全RNA画分に存在しますが、結合したRNA画分には存在しないか、または大幅に減少しています。

α-thio uline ペアの場合、バンド 7 とバンド 8 は、結合分数で比較的強度が低くなります。結合画分から優先的に排除される残基は、タンパク質の結合にとって重要です。RNAが合成され、5プライムエンドが標識されると、この手法は適切に実行されれば12時間で実行できます。

この手順を試みる際には、適切なレベルのホスホロチオエートの取り込みと、結合のための適切なタンパク質濃度の決定が重要な考慮事項であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、適切な機能アッセイやin vivo試験などの他の方法を実行して、突然変異誘発アプローチの結果を検証し、生物学的関連性を理解することができます。この手法は、より高価またはより面倒な、あるいはその両方の他の方法に代わるものを提供します。

このビデオを見れば、変異体ライブラリーの設計と合成の方法、結合反応の実施方法、各プール内の変異型ヌクレオチドの同定方法、および試験した各位置での非野生型ヌクレオチドの影響の定量的分析方法について十分に理解できるはずです。ポリアクリルアミドや放射能を扱う作業は危険である可能性があり、この手順を実行する際には、手袋の使用、適切な排気、放射性シールドなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。