Name: ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶホスホロチオエート法によるRNA結合タンパク質部位の飽和突然変異誘発。DNAテンプレートをドーピングしT7プライマー合成で、遺伝子制御メカニズムの理解に貢献する単一ステップ技術です。

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著者は過去の資金調達のための健康の国民の協会のおかげで、マイケル ・ r. グリーンのオリゴヌクレオチドを合成をありがちましょう。

注:図 1ホスホロチオエート変異の概要し、プロセスの主な手順の概要を示します。
1. 突然変異体のライブラリの生成 — 野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピング
<ol><li>T7 プライマーを合成 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') DNA のシンセサイザーに化学合成によって。</li>
	<li>タンパク質の結合部位に対応する DNA シンセサイザーに化学合成によるドープしたオリゴヌクレオチド (相補鎖) を合成します。化学合成の中に野生型ヌクレオチド (この比率の詳細について代表的な結果を参照) としての比 90% は野生型ヌクレオチドと 10 %t のドーピング (以下 X) の各サイトの phosphoramidites の適切な混合物を使用します。 注: ここでは、ドープされたオリゴヌクレオチドのシーケンスは 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3'。下線付きのシーケンスは SXL タンパク質結合部位、プラスの荷重コントロールがあることと同様、バインド、RNA ではすべての変更に影響を与えることを確認する便利なコントロールを提供するヌクレオチド結合部位外の逆の補数ヌクレオチド結合部位内の正規化と比較。SXL バインド サイト シーケンストランスmRNA14,15,16,17に存在する UUUUUGUUGUUUUUUUU は、提案された方法論を考案する使用されました。イタリック体でシーケンスは T7 プライマー シーケンスに補足で、T7 プロモーターの in vitro転写に。</li>
</ol>2. RNA の合成
<ol><li>
上記18としての 20 μ L 転写反応に RNA を合成します。
	<ol>
<li>1 μ M が 1 mM 10 mM ジチオトレイトール (DTT) 2 mM GTP、オリゴヌクレオチドをドープしたミックス T7 転写バッファーと 1 μ M T7 オリゴヌクレオチド、2 U/μ L T7 RNA ポリメラーゼと UTP (グアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジン三リン酸)、CTP、ATP。</li>
		<li>追加には、2 つの独立した遠心管 0.167 mM α チオ ATP または 0.05 mM α-チオ UTP Rna にホスホロチオエート (図 2の回路図を参照してください) を組み込む。 注: 代わりとなる議定書ドープしたオリゴヌクレオチド ヌクレオチド置換を残りの 2 つのテストを含む適切な転写反応に 0.2 mM α チオ CTP または 0.2 mM α チオ GTP を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 2 時間 RNA 合成反応混合物を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA のサンプルに 2.5 μ L, 易熱性アルカリフォスファターゼと 2.5 μ L 10xphosphatase バッファーを追加します。この 25 μ L 反応 5' 隣酸塩を削除する 37 ° C で 10-30 分間インキュベートします。</li>
	<li>2-5 分で 80 ° C に加熱することによりアルカリフォスファターゼ酵素を不活性化します。</li>
	<li>脱燐酸化された RNA の 5' 末端を特に (5 pmole) 1 μ L T4 ポリヌクレオチド キナーゼと 1 μ L γ-32P ATP 10 μ L 反応量を使用しています。37 ° C で 30-60 分のための反作用の組合せを孵化させなさい</li>
	<li>20-30 分の 65 ° C で加熱による T4 ポリヌクレオチド キナーゼ酵素を不活性化します。</li>
	<li>ゲルは、10% 変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって RNA を浄化します。オートラジオグラフィーによるゲルで RNA を探します。標識 RNA を含むゲルのスライスを消費税、ピペット チップの壁に対して押すことによって微量遠心チューブにつぶす、プロテイナーゼ K (PK) バッファー (100 mM トリス、pH 7.5、12.5 ミリメートルの EDTA、150 mM 1% ドデシル硫酸ナトリウム, 塩化ナトリウム) に浸します。一晩に 2 h から室温でチューブを回転させます。</li>
	<li>遠心分離機のゲル スラリー、ゲルを破棄し、緩衝液を収集します。</li>
	<li>フェノール-クロロホルムの等量で二回とクロロホルムのソリューションを展開し、水性相を収集します。</li>
	<li>水相 0.1 容積 3 M 酢酸ナトリウム、pH が 5.2、キャリアに追加 tRNA またはグリコーゲンおよび 2.5 量のエタノール。-80 ° C 1 時間でサンプルをしてください。</li>
	<li>16,873 x gで高速遠心機で 5-10 分のサンプルを遠心します。RNA の餌を乱すことがなくバッファー/エタノール溶液を慎重に削除します。</li>
	<li>70% エタノールでペレットを洗浄し、慎重に 2-5 分削除エタノールの遠心分離機します。空気でペレットを乾燥させます。</li>
	<li>20-50 μ L ジエチルエステル (DEPC) でペレットを再懸濁します-処理水。使用するまで-20 ° C で保存します。 注: 放射能から保護するために適切な予防措置とプレキシ ガラスの盾を使用して標識 RNA をすべての手順を実行します。現在、スピン列は、RNA のゲルの浄化方法として一般的に使用される、削除するより便利な法人放射能です。</li>
</ol>3. 蛋白反応と結合した RNA の分離を結合
<ol><li>組換え蛋白質の表現そしてエシェリヒア属大腸菌から浄化します。</li>
	<li>吸光光度法または知られていた蛋白質標準、ウシ血清アルブミン (BSA) の横にある SDS ポリアクリルアミドのゲルの分離による組換え蛋白質濃度を推定します。Coomassie ブリリアント ブルー R-250 とゲルの汚損によって興味および標準の BSA の蛋白質を視覚化します。同じゲルで BSA 希釈の知られている量と比較してタンパク質量的に表わします。 注: 保存組換え蛋白質 - 80 ° C まで使用と希釈で 20 mM の 4-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES)、pH 8.0、1 mM ジチオトレイトール (DTT) 0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、0.05% 20% グリセロール、NP 40。使用 0.5-1.0 mM プロテアーゼ阻害剤 phenylmethane フッ素 (PMSF) は省略可能です。</li>
	<li>10 mM トリス-HCl、pH 7.5 に RNA 結合反応 (20-100 μ L) を実行、ウシ血清アルブミン、1 mM EDTA、0.15 μ g/μ L に 0.09 μ g/μ L がアセチル化 50 mM 0.5 単位/μ L RNase 阻害剤、KCl は 1 mM DTT、tRNA、5' 末端標識 RNA および (適切な濃度の 6 μ LRNA の 〜 50% が蛋白質に結合する濃度) 蛋白質の。 注: この結合バッファーは、3 つの RNA-結合蛋白質 (U2AF65SXL と PTB) が興味の蛋白質のために標準化する必要があります。約 50% を取得するために必要な特定の蛋白質の準備のため様々 な希薄を使用して経験的にタンパク質濃度を推定 RNA 結合。この条件またはKdは、RNA 結合曲線の最も敏感な部分を表します。</li>
	<li>20-30 分 (または氷の上) 25 ° C での蛋白質の結合の反作用を孵化させなさい。</li>
	<li>
2 つの方法のいずれかを使用して非連結分数から蛋白結合 RNA 画分を分離します。
	<ol>
<li>硝酸セルロース フィルター結合<ol>
<li>結合の反作用 (20-100 μ L) を常温で真空マニホールドに接続されている硝酸セルロース フィルターに適用されます。 注: RNA 蛋白質の複合体だけフィルターに保持され、フィルターを通して RNA フローを連結しました。フィルター結合アプローチ結合した RNA の高い回復できより速く、簡単に、ゲルの移動性シフト試金と比較しています。硝酸セルロース フィルターの下に DEAE 膜を置くことによってまた非連結の RNA の一部分を収集したり、無料の RNA 連結の割合との比較することが可能としてます。</li>
			<li>剰余を含む硝酸セルロース フィルターの部分のカット微量遠心チューブに収まるように小さな断片に放射性 RNA フィルター部分を没頭する十分な PK バッファー (300-500 μ L 含む 10-20 μ g PK) に浸漬し、フィルターから RNA を溶出2-3 時間または一晩。</li>
			<li>フェノール-クロロホルム、クロロホルムで抽出し、水性相を収集します。酢酸ナトリウムとエタノールを追加、遠心分離機の冷凍庫に潜伏後、洗って、乾かし、DEPC 処理水に RNA を再懸濁します。この手順では、2.10 に 2.14 上記の手順で説明するようします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ゲルの移動性シフト<ol>
<li>準備し、5% のネイティブ ポリアクリルアミドゲルの重合 (60: 1 Acrylamide:bis-アクリルアミド) 0.5 でフィルター結合法に代わるものとして結合の反作用を開始する前に x TBE (標準 Tris ホウ酸 EDTA バッファー)。</li>
			<li>中古冷蔵室 (4 ° C) で 250 V で 15 分のためのゲルを実行します。</li>
			<li>上記実行前ゲルの別の井戸に各結合の反作用 (上記) をロードします。 注: タンパク質ストレージ バッファーは井戸にサンプル読み込みの十分なグリセロールを提供します。</li>
			<li>蛋白結合 RNA を電気泳動に特定の蛋白質と RNA のサイズに応じて、1 ~ 2 時間 250 V で冷蔵室で区切ります。</li>
			<li>オートラジオグラフィーによるゲルの RNA 蛋白質の複合体の位置を探します。RNA 蛋白質の複合体を含むゲルのスライスを切除します。ゲルのスライスを粉砕し、PK バッファーに浸漬でゲルのスライスからの RNA を溶出します。</li>
			<li>フェノール-クロロホルム、クロロホルムで抽出し、水性相を収集します。酢酸ナトリウムとエタノールを追加、冷凍庫に潜伏後遠心分離、洗浄、乾燥、空気、DEPC 処理水に RNA を再懸濁します。この手順では、2.10 に 2.14 上記の手順で説明するようします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 変異塩基位置の検出のためのヨウ素切断ホスホロチオエート製品の分析
<ol><li>1 mM ヨウ素を加えて 20 μ L の DEPC 処理水最大 10 μ g のキャリアを含む tRNA Rna (連結および総 Rna) ホスホロチオエート結合部位で切断します。5 分間室温でインキュベートします。 注: ヨウ素をわずかに異なる条件詳細-7% (v/v) iodoethanol、3 分 95 ° C で加熱、ギッシュ ・ エクスタイン 198819で見つけることができます。</li>
	<li>前述のようにナトリウム酢酸・ エタノールを追加することによって切断 RNA を沈殿させます。変性ゲルのローディングの染料に再懸濁します。15-20% の変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって RNA 断片を分離するサンプルを読み込むし、熱します。</li>
	<li>X 線フィルムに電気泳動法を公開します。</li>
	<li>オートラジオグラフィーを用いた総プールと連結の割合でバンドを検出します。 注: は、排気フードにヨウ素すべて手順を実行します。ここに示す RNA 分離、くさび状のゲルを採用、ゲルの下部に余分なインチの長さのスペーサーを挿入することによりゲル板の下部に両方のスペーサーの厚さを倍増によって達成され。この図形より均一または近い間隔短い RNA フラグメントことができます。また、検出と放射能の定量分析のため、x 線フィルムではなく、phosphorimager を使用できます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、競合する金銭的な利益を宣言していません。

変異は蛋白質の結合サイトを特徴付けるため長い間使用されています。まず、一連の変異型を構築し、結合の結合親和性に及ぼす影響を分析するアッセイで個別にテストできます。複数のステップ変異体を構築する一連の各変異体の反応をバインディングの実行など、標準的なアプローチに関連するかどうかは面倒で時間がかかるかどうか、およびことができない標準的な突然変異手法では、複数のシーケンスを分析する方法を提供しています、特に長いシーケンスのための飽和突然変異導入を許可します。第二に、シーケンスをランダム化できるし、プールにバインドおよびポリメラーゼの連鎖反応の複数のサイクル (pcr) 使用されます。蛋白質を結合するこれらのシーケンスでお越しの際にも複製し塩基配列を解読し、コンセンサス シーケンスから結合部位を検証します。それにもかかわらず、この反復バインディングと増幅オプションは複数のステップが含まれます、結合部位に重要な残基を識別するに骨の折れる。また、シーケンスの繰り返し増幅 PCR に固有シーケンス バイアスが生じる。第三に、ランダムのプールから選択されたシーケンスは、比較的高価だが高スループットがシーケンス処理の高速化オプションを使用して配置できます...

遺伝子は、生物学で重要な役割を果たしています。遺伝子の転写、mRNA のスプライシング、3' 端形成、RNA 輸出、翻訳、mRNA の局在、崩壊、翻訳後修飾/安定性など両方の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の重要な役割を再生レベルに調整できます。規制。一方、分子遺伝学的解析では、規制を多くの蛋白質を識別した、それらのごく一部のみが細胞機能の結合サイトの生体内完全に特徴づけられています。系統解析と突然変異は、DNA または RNA 蛋白質の相互作用を特徴付けるに補足のアプローチを提供しています。
RNA 結合蛋白質性分を含む発達のプロセスで重要です。セックス致死 (SXL)ショウジョウバエ蛋白質またはマスター セックス スイッチ蛋白質が存在しない、男性が女性にプレゼント。ウリジン豊富なシーケンスまたは体細胞1,2 の下流 mRNA ターゲット (トランス、セックス致死、男性固有の lethal2) で特定のスプライス部位に隣接するピリミジンの広大を認識します。 ,3,4。さらに、それは起こるサイトの初歩的な増強物(e(r)) 謄本5,6にウリジン リッチ起こるエンハンサー シーケンスに結合して切り替えを調整します。SXL 可能性が調節することを残る女性の生殖で追加のターゲット識別1,7,8,9,10、11,12,13。
通常、結合部位の特性変異原性, たとえば、削除や単一または複数のヌクレオチドの置換します。野生型 RNA 配列を基準にして各変異体の結合サイトが分析され、その結合親和性を決定するタンパク質濃度の一連を使用して (Kdまたは平衡解離定数); 興味の蛋白質のKdは 50 %rna 結合を取得するために必要な蛋白です。詳細な突然変異のこの労働集約的なプロセスを含む多数の突然変異体の生成・解析-3 つの野生型ヌクレオチド結合部位の各位置のため。従って、RNA に蛋白質の結合サイトの高速、簡単、安価な飽和突然変異導入の代替アプローチの必要性があります。
ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

<table><tbody><tr><td>ウリジン 5' a-チオ三リン酸</td><td>NEN (マサチューセッツ州ボストン)</td><td>NLP-017</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5' a-チオ三リン酸</td><td>NEN (マサチューセッツ州ボストン)</td><td>NLP-016</td><td></td></tr><tr><td>バキュームマニホールド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>XX1002500</td><td>ミリポア&nbsp;25&nbsp;mmガラス微量分析真空フィルター</td></tr><tr><td>真空マニホールド</td><td>ミリポア</td><td></td><td>XX2702552 1225サンプリング真空マニ</td></tr><tr><td>ホールドニトロセルロース</td><td>ミリポア</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースシュ</td><td>ライヒャー&Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>Dephosphorlyation Kit</td><td>NEB</td><td>M0508</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td></td><td>RNase inhibitor</td></tr><tr><td>ガラスプレート</td><td>標準</td><td>規格</td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動装置標準</td><td></td><td>標準</td><td></td></tr><tr><td>X線フィルム</td><td>標準</td><td>標準</td><td></td></tr>ポリ<tr><td>アクリルアミドゲル溶液</td><td>標準</td><td>標準</td><td></td></tr></tbody></table>

ホスホロチオエートを使用して rna の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

遺伝子の規則は開発の重要な役割を果たしています。多数の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の発現を制御する高い特異性とそのターゲット シーケンスをバインドします。これらの調節タンパク質 (転写) DNA のレベルでまたは RNA (mRNA スプライシング、起こる、mRNA の輸送、腐食および翻訳) のレベルでの遺伝子発現を制御します。制御配列の同定は、オンまたはオフの遺伝子への切り替えだけでなく、また下流遺伝子の特定規制蛋白質によって規制されているを理解するのに役立ちます。ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

ドーピングを使用して飽和突然変異導入の原理:
野生型および他のヌクレオチドの適切なモル比、1 つの位置だけの分析対象とする場合、すべての 4 つのヌクレオチドの等量混合物を使用します。ただし、同時に複数のポジションを分析、野生型のヌクレオチドに非野生型の比率が調整必要があります、すなわち、減少します。そうでなければが必要な単一の置換だけでなくがもあります単一ヌクレオチド置換の効果の解析を排除、分子に複数の野生型ヌクレオチドを含むテンプレート。したがって、親指のルールとして使用率 1/n の野生型ヌクレオチドに非野生型の n は分析する位置の数。ここでは、私たち 10 の位置も同時に解析し、野生型のヌクレオチドの 90% および野生型ヌクレオチド DNA のテンプレートをドーピングのための 10% を含む混合物を使用します。4 ホスホロチオエートのいずれかで各転写反応を実行する別の転写反応が行われます。したがって、各反応は、ドープした位置特定...

特定の RNA シーケンスを結合するタンパク質は、遺伝子発現の重要な役割を果たします。これらの結合部位の詳細な特性解析は遺伝子の規則の私達の理解にとって重要です。ここでは、RNA タンパク質結合部位の飽和突然変異導入のシングル ステップ アプローチを説明しています。このアプローチは、RNA のすべての蛋白質の結合サイトに関するものです。

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

このRNAにおけるホスホロチオエートアプローチの全体的な目標は、飽和突然変異誘発を1つのステップで行うことです。この方法は、遺伝子制御などの分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1つのステップでRNAのタンパク質結合部位の飽和突然変異誘発を達成できることです。このシングルステップ飽和突然変異誘発プロトコルの重要なステップは、タンパク質結合部位内に非野生型ヌクレオチドをDNAテンプレートにドープすることです。まず、DNAシンセサイザー上で化学合成によりT7プライマーを合成します。次に、タンパク質結合部位に対応するドープされたオリゴヌクレオチドを合成します。この例では、下線が引かれた配列は、ショウジョウバエの性致死タンパク質結合部位の逆補体を含み、各ドーピング部位はXで表されます。緑色の配列はT7プライマー配列と相補的であり、in vitro転写のT7プロモーターです。このプロトコルの次のステップは、各ホスホロチオエートヌクレオチドと別々のRNAの合成とそれに続くRNAの5プライム末端放射性標識です。各ホスホロチオエートのRNAを20マイクロリットルの転写反応で合成します。各微量遠心チューブに、T7転写バッファー、1マイクロモルT7オリゴヌクレオチド、1マイクロモルドープオリゴヌクレオチド、10ミリモルDTT、2ミリモルGTP、ATP、CTP、UTP各1ミリモル、T7 RNAポリメラーゼ1マイクロリットルあたり2ユニットを追加します。一方のチューブに0.167ミリモルのα-チオATPを、もう一方のチューブに0.05ミリモルのα-チオUTPを添加します。RNA合成反応混合物を摂氏37度で2時間インキュベートします。2時間後、2.5マイクロリットルの熱に不安定なαホスファターゼと2.5マイクロリットルの10Xホスファターゼバッファーを各RNAサンプルに加えます。摂氏37度で10〜30分間インキュベートし、5プライムリン酸塩を除去します。アルカリホスファターゼ酵素を80°Cで2〜5分間加熱して不活性化します。残りのステップには放射能の使用が含まれ、適切な予防措置と放射能から保護するためのプレキシガラスシールドを使用して実行する必要があります。脱リン酸化RNAの5プライム末端を放射性標識するには、10マイクロリットルの反応容量で1マイクロリットルのT4ポリヌクレオチドキナーゼと1マイクロリットルのGamma P32 ATPを使用します。反応混合物を摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を65°Cで20〜30分間加熱して不活性化します。10%変性ポリアクリルアミドゲルで反応液を泳動します。オートラジオグラフィーでゲル上のRNAを特定し、放射性標識RNAを含むゲルスライスを切り取ります。マイクロ遠心チューブ内でゲルスライスをピペットチップで側面に押し付けて粉砕し、プロテイナーゼKバッファーを加えます。チューブを室温で2時間から一晩回転させます。次に、ゲルスラリーを遠心分離し、緩衝液を回収し、ゲルを廃棄します。各溶液を等量のフェノールクロロホルムで2回抽出します。その後、クロロホルムで溶液を一度抽出します。水相を収集し、それに0.1容量の3モル酢酸ナトリウムpH 5.2、キャリアtRNAまたはグリコーゲン、および2.5容量のエタノールを追加します。サンプルを摂氏マイナス80度に1時間保ちます。高速微量遠心分離機でサンプルを16、873倍gで5〜10分間遠心分離します。緩衝エタノール溶液は、RNAペレットを乱さないように慎重に除去します。ペレットを70%エタノールで洗浄し、2〜5分間遠心分離します。エタノールを慎重に取り出し、ペレットを風乾します。各ペレットを20〜50マイクロリットルのDEPC処理水に再懸濁します。使用するまでマイナス20°Cで保管してください。ここでは、干渉によるパーティション分割の概念を示します。タンパク質結合の過程で、RNA分子はタンパク質結合画分と非結合画分の間で分配されます。特定の位置にある特定のヌクレオチドがタンパク質結合を阻害する場合、そのヌクレオチドはタンパク質結合画分から優先的に除外されます。その後、ヨウ素を使用して、ホスホロチオエートの取り込み部位でRNAを切断します。この手順を開始するには、10ミリモルのTris-HCl、1ミリモルのDTT、50ミリモルの塩化カリウム、0.5単位/マイクロリットルのRNase阻害剤、0.09マイクログラム/マイクロリットルのアセチル化ウシ血清アルブミン、1ミリモルのEDTA、0.15マイクログラム/マイクロリットルのtRNA、5プライムエンド放射性標識RNA、および適切な濃度のタンパク質の6マイクロリットルを含む各反応でタンパク質-RNA結合反応を設定します。タンパク質結合反応液を摂氏25度で20〜30分間インキュベートします。ニトロセルロースフィルター結合により、タンパク質結合型RNA画分と非結合型RNA画分を分離します。室温で真空マニホールドに接続されたニトロセルロースフィルターに結合反応を適用します。RNAタンパク質複合体のみがフィルターに保持され、結合していないRNAはフィルターを通過します。ニトロセルロースフィルターの保持された放射性RNAを含む部分を微量遠心チューブに収まるように小さく切り取り、十分なプロテイナーゼKバッファーを加えてフィルターピースを浸します。フィルターピースからRNAを2〜3時間または一晩溶出します。次に、各チューブから溶液を新しいチューブに移し、前に示したようにフェノールクロロホルムとクロロホルムで抽出します。水相を採取し、それに0.1容量の3モル酢酸ナトリウム、pH 5.2、および2.5容量のエタノールを加え、冷凍庫でインキュベートします。前述したようにRNAを遠心分離、洗浄、乾燥した後、DEPC処理水にRNAを再懸濁します。ヨウ素を含むすべてのステップは、排気フードで実行する必要があります。ホスホロチオエートの取り込み部位でRNAを切断するには、各RNAサンプルに、最大10マイクログラムのキャリアtRNAを含む20マイクロリットルのDEPC処理水に1ミリモルのヨウ素を加えます。室温で5分間インキュベートします。前述したように酢酸ナトリウムとエタノールを添加して、切断したRNAを沈殿させます。切断されたRNAをローディング色素に再懸濁し、変性ゲル化します。加熱後、サンプルを15〜20%変性ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動によりRNA断片を分離します。ポリアクリルアミドゲルをX線フィルムに露光し、オートラジオグラフィーを使用して結合画分と全プールのバンドを検出します。この回路図は、干渉によるパーティショニングの概念を示しています。レーンTでは、全RNAフラクション、バンド強度はすべてのドープ位置でほぼ等しくなります。タンパク質結合RNA画分では、位置1、4、および7では、ヌクレオチドは結合に影響を与えません。しかし、3位と6位では結合を阻害し、結合画分から除外されます。位置 5 では、干渉は部分的です。各ヌクレオチドのペアレーンを比較することで、4つのヌクレオチドすべての分析が可能になります。このオートラジオグラフは、変性ゲルからの2対のレーンを示しています。レーンTはトータルRNAで、レーンBはタンパク質結合RNAです。縦線は性致死性結合部位を示しています。α-チオアラインペアの場合、バンド1、2、3、および5は全RNA画分に存在しますが、結合したRNA画分には存在しないか、または大幅に減少しています。α-thio uline ペアの場合、バンド 7 とバンド 8 は、結合分数で比較的強度が低くなります。結合画分から優先的に排除される残基は、タンパク質の結合にとって重要です。RNAが合成され、5プライムエンドが標識されると、この手法は適切に実行されれば12時間で実行できます。この手順を試みる際には、適切なレベルのホスホロチオエートの取り込みと、結合のための適切なタンパク質濃度の決定が重要な考慮事項であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、適切な機能アッセイやin vivo試験などの他の方法を実行して、突然変異誘発アプローチの結果を検証し、生物学的関連性を理解することができます。この手法は、より高価またはより面倒な、あるいはその両方の他の方法に代わるものを提供します。このビデオを見れば、変異体ライブラリーの設計と合成の方法、結合反応の実施方法、各プール内の変異型ヌクレオチドの同定方法、および試験した各位置での非野生型ヌクレオチドの影響の定量的分析方法について十分に理解できるはずです。ポリアクリルアミドや放射能を扱う作業は危険である可能性があり、この手順を実行する際には、手袋の使用、適切な排気、放射性シールドなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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学ぶホスホロチオエート法によるRNA結合タンパク質部位の飽和突然変異誘発。DNAテンプレートをドーピングしT7プライマー合成で、遺伝子制御メカニズムの理解に貢献する単一ステップ技術です。

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングルステップの特性

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