エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出
2018年8月3日
次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々 の方法をについて説明します。
この方法は、前がんクローンの検出、治療後の白血病患者の予後評価、骨髄ドナーの潜在的に病原性変異の同定など、さまざまな研究分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。私と一緒にこの手順を実演するのは、研究室の技術者であるスペンサーです。このビデオでは、エラー訂正シーケンシングプロトコルをIlluminaケミストリーおよび市販の遺伝子パネルと組み合わせて、クローン性単一ヌクレオチド変異体および小さなインデルを10, 000分の1の感度で検出する方法について説明します。
必要な固有の分子識別子を組み込むために、カスタマイズされた16N i5およびi7アダプターはPCRを使用します。まず、市販の代替品よりも忠実度の高いポリメラーゼを使用したQ5 Master Mixを調製します。次に、各反応について、37.5マイクロリットルのQ5マスターミックス、6マイクロリットルの5マイクロモル16N i5アダプター(一意の分子識別子)、および6マイクロリットルのi7アダプターを組み合わせます。
多重化が目的である場合は、別々のサンプルで異なる i7 アダプターを使用します。次に、摂氏98度で30秒、摂氏98度で10秒、摂氏66度で30秒、摂氏72度で30秒の4〜6サイクルのパラメータを使用してPCRを実行します。摂氏72度で2分間の延長で反応を終了し、摂氏4度で保持します。
次に、それらに対して行わなければならない両方のPCRサイクルは、使用する遺伝子パネルのサイズに依存する可能性が高く、私たちの経験から、遺伝子パネルに約1500の異なる遺伝子特異的オリゴのパスがある場合は4サイクルPCRで十分ですが、約5〜600ペアのオリゴを持つパネルには約6サイクルのPCRが必要です。次に、磁気ビーズを使用してPCR反応をクリーンアップし、各75マイクロリットルのPCR産物に56.25マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を加え、次に各反応を別々の1.5ミリリットルの低結合チューブに移し、少なくとも10回ピペッティングで上下させて混合し、5分間待ちます。次に、混合物を磁気ホルダーに移し、上清を2分間透明にします。
次に、上清を取り除いて捨てます。次に、200マイクロリットルの70%エタノールを追加し、30秒待ってから、エタノールを取り除きます。このエタノール洗浄ステップを一度繰り返してから、ビーズを5分間自然乾燥させます。
最後に、ビーズから修飾されたライブラリーを20マイクロリットルの二重蒸留水で溶出します。次に、チューブを磁気ラックに置き、磁気ビーズを溶離液から分離します。まず、前のステップのECSライブラリをPCRストリップの1,000個あたり1個まで10倍に段階希釈します。
次に、1.5ミリリットルのチューブにマスターミックスを調製します。各反応について、10マイクロリットルのddPCR EvaGreen Mix、0.2マイクロリットルのP5プライマー、0.2マイクロリットルのP7プライマー、および4.6マイクロリットルの二重蒸留水を組み合わせてください。次に、EvaGreen Master Mixの15マイクロリットルを新しいチューブセットにピペットで移し、最後に1〜1,000 ECSの5マイクロリットルをマスターミックスに追加します。
次に、ドロップレットジェネレーターを使用してPCRドロップレットを作成します。まず、カセットをロードし、70マイクロリットルの液滴発生油をカセットのウェルにピペットし、標識油をピペットし、ddPCR反応混合物の20マイクロリットルをウェル標識サンプルにピペットします。次に、カセットをゴム製のガスケットで覆い、液滴発生器にロードし、すべての液滴生成を進めます。
次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各カセットウェルから採取した45マイクロリットルの液滴を5秒以上かけてゆっくりと新しいPCRプレートにロードします。次に、PCRプレートをアルミホイルで密封します。次に、次の条件を使用して液滴内の信号を増幅します:摂氏95度で5分間、続いて摂氏95度で30秒のサイクルを40回、摂氏63度で1分間、次に反応を摂氏4度まで5分間冷却してから、摂氏90度まで5分間上げます。 そして摂氏4度で保持します。
次に、ddPCRテンプレートドロップレットリーダーマシンを準備します。絶対定量用のパラメーターを選択し、QX200 ddPCR EvaGreen Supermix を使用します。次に、反応を液滴リーダーに通します。
ddPCR解析が完了したら、各サンプルに同じ分割閾値を適用します。次に、各ライブラリを目的の分子数に正規化します。まず、25マイクロリットルのQ5マスターミックス、2マイクロリットルの1マイクロモルP5プライマー、2マイクロリットルの1マイクロモルP7プライマー、および21マイクロリットルの正規化DNAライブラリーからなる50マイクロリットルの反応を行います。
次に、摂氏98度で30秒、摂氏98度で10秒、摂氏66度で30秒、摂氏72度で30秒、摂氏72度で2分、摂氏4度で保持するパラメータを使用してPCRを実行します。次に、ライブラリ内のDNA濃度を定量し、シーケンシングのためにライブラリを等量でプールし、約4ナノモルを標的とします。次に、Illumina シーケンシングプラットフォームを使用して、プールされた ECS ライブラリのシーケンシングを、144 ペアエンドリードの 2 倍、インデックス 1 の 8 サイクル、インデックス 2 の 16 サイクル
のシーケンシング設定でシーケンシングします。GATA1に変異を有する患者のDNAを、市販のゲノムDNAで元のVAF0.19で希釈した。記載されたプロトコルを使用して、ECSは、単一ヌクレオチド変異体に対して1〜10,000のレベルまで定量的であることが証明されました。次に、20人の健康な個人からのバフィーコートサンプルを、568アンプリコンで構成される市販のシーケンシングパネルを使用して分析しました。
要約すると、109のクローン体細胞変異が、既知の宇宙表現を持つ突然変異の0.0003から0.1451.21の範囲の変異対立遺伝子画分を持つ少なくとも1つの収集時点の両方の反復に存在し、それぞれがデジタル液滴PCRを使用して検証されました。プロトコルのエラー訂正された発現レベルを実証するために、さまざまながんに関連することが知られている415の遺伝子からなるカスタマイズされた遺伝子パネルを使用して、各遺伝子の最も一般的に発現するエクソンから構築されたライブラリを作製しました。低存在量の転写産物の発現レベルは、反復間で非常に再現性が高かった。
次に、デジタルドロップレットPCRを使用して、発現の異なる6つの選択された遺伝子を検証しました。比較により、遺伝子の発現レベルは、正規化を必要とせずに、ECSプロトコルによって正しく捕捉されたことが示されています。一度テクニックをマスターすれば、このテクニックは1日半で快適に行うことができます。
時間の大部分はインキュベーションに費やされ、研究者が同時に処理するサンプルの数にもよりますが、手作業による処理は必要な合計時間の約30〜40%を占めます。この手順を試行する際には、同じサンプルのレプリケートシーケンシングライブラリを用意することが非常に重要です。これにより、低頻度の突然変異が真陽性であるという確信が持てるようになります。これは、突然変異自体が両方の反復で独立してコアである場合です。
この手順に続いて、ECS RNAなどの他の事項を実行して、低存在量の転写産物の検出や融合転写産物などの質問に答えることができます。開発後、この技術は主に血液悪性腫瘍の分野の研究者に道を開き、この技術を使用して健康な個人の白血病前クローンを探索し、寛解した白血病患者の微小残存病変を検出します。
概要
本記事では、エラー率を低減させることで次世代シーケンシング（NGS）の精度を高める、エラー訂正シーケンシングの手法について解説します。この技術により、非常に低いバリアントアレル頻度での変異検出が可能となり、さまざまな研究アプリケーションにおいて有用となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- ゲノミクス
- シーケンシング技術
- 変異検出
背景
- 次世代シーケンシング（NGS）は、約0.5–2.0%という高いエラー率を有しています。
- エラー訂正シーケンシング法を用いることで、このエラー率を軽減することが可能です。
- 希少変異の検出は、腫瘍学や遺伝学などの分野において極めて重要です。
- 正確な変異検出には、ユニーク分子識別子（UMI）が不可欠です。
研究目的
- Illumina社製ケミストリーを用いたエラー訂正シーケンシングのプロトコルを提示すること。
- クローナルな単一塩基バリアントの検出における本手法の感度を実証すること。
- さまざまな研究コンテキストにおける本プロトコルの有効性を検証すること。
使用した手法
- 高正確性ポリメラーゼを用いたQ5 Master Mixの調製。
- カスタマイズしたアダプターによるユニーク分子識別子（UMI）の使用。
- 特定のサイクルパラメータを用いたPCR増幅。
- 変異の定量および検証のためのデジタルドロップレットPCR。
主な結果
- バリアントアレル頻度が0.0001という低濃度であっても、変異を正常に検出しました。
- さまざまなサンプルから109個のクローン性体細胞変異を特定しました。
- デジタルドロップレットPCRを用いて変異を検証しました。
- エラー訂正シーケンシング法の定量的な正確性を実証しました。
結論
- エラー訂正シーケンシングにより、変異検出感度が大幅に向上します。
- 本手法は、ゲノム解析における臨床および研究の両設定に適用可能です。
- 今後の研究により、希少な遺伝的バリアントの検出における活用範囲が広がることが期待されます。
よくある質問
業界における実用的な関連性
エラー訂正シーケンシング（ECS）は、エラー率を低減させることで、0.0001という極めて低いバリアントアレル頻度での変異検出を可能にし、次世代シーケンシングにおける重大な限界を解消します。この能力は、血液悪性腫瘍における前白血病クローンの早期検出や微小残存病変（MRD）のモニタリングを支援し、腫瘍学の創薬開発における治療方針の決定や患者の層別化に直接的な影響を与えます。希少なクローナルバリアントの定量的かつ再現可能な検出を提供することで、ECSはターゲットバリデーションおよびバイオマーカー探索パイプラインにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：超低頻度のクローナルな体細胞変異を検出することで治療仮説の検証を可能にし、推定されるがん標的の生物学的リスク軽減を支援します。
- 運用上の価値：定量的変異アレル頻度の測定を提供し、疾患モデルにおけるパスウェイの関与および遺伝子改変の機能的関連性を明らかにします。
- 予測的価値：真の低頻度変異とシーケンシング上のアーティファクトを区別することで、標的優先順位付けの信頼性を向上させ、標的バリデーションキャンペーンにおける偽陽性リードを減少させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：Illuminaシーケンシングに適合し、エラー補正済みの標準化されたライブラリを生成することで、体細胞変異検出に向けた大規模な遺伝子パネルのスケーラブルなスクリーニングを可能にします。
- 定量的な出力：変異アレル頻度の精密なデータを提供し、変異検出ワークフローにおけるアッセイの標準化およびラボ間での再現性をサポートします。
- プラットフォームの再利用：患者固有のインデックスによるマルチプレックス試料処理を促進し、大規模なジェノタイピングにおけるスループットの向上と試料あたりのコスト削減を実現します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：治療後の白血病患者における微小残存病変のモニタリングに直接適用でき、前臨床有効性試験における臨床的に重要なエンドポイントと一致している。
- トランスレーショナルな連続性：経時的なクローン力学の定量的追跡を通じて、探索相における変異検出と前臨床検証を橋渡しする。
- リスク調整後の進展：前臨床治療研究において出現した耐性クローンの高感度な検出を提供することで、Go/No-Go判断を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
ECSは、初期のターゲット仮説検証からリード化合物の同定、そして前臨床バリデーションに至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、特にクローン進化が治療反応性に影響を与える血液悪性腫瘍モデルにおいて有用です。
- 探索生物学：健常ドナー試料中の前白血病クローンを高感度に検出することを可能にし、仮説検証をサポートして悪性腫瘍の起源を明らかにします。
- スクリーニング：再現性の高い、定量的なシーケンシングデータをアッセイ可能な状態で提供し、遺伝的に定義されたモデルにおける信頼性の高い化合物スクリーニングを促進します。
- 分析：正確な変異アレル頻度の測定値およびデジタルドロップレットPCRで検証された出力を生成し、実験条件間での変異負荷の正確な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：白血病治療開発における重要なバイオマーカーである微小残存病変のモニタリングを通じて、前臨床研究との連続性を構築します。
- エンタープライズでの再利用：複数のプロジェクトや治療領域にわたるクローンダイナミクスの縦断的追跡のための、再利用可能なジェノタイピング能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：変異検出におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、遺伝的バイオマーカーおよび治療標的への信頼性を高めます。
- 運用的価値：固有分子識別子（UMI）を用いてライブラリ調製を標準化し、再現性の向上とシーケンシングデータにおけるバッチ効果の低減を実現します。
- 戦略的価値：臨床的に意味のある閾値で耐性変異を検出することにより、より早期に確信を持ってgo/no-go判断を下すことが可能となり、後期の開発失敗リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：前臨床モデルにおける出現クローン変異の検出感度に基づいた、リスク調整済みの候補薬の優先順位付けを支援します。
実施上の考慮事項
- 希少変異を正確に検出するためには、分子ライブラリ調製、PCR最適化、およびデジタルドロップレットPCRバリデーションに関する専門知識が必要です。
- ライブラリ処理には、高正確性ポリメラーゼ、磁気ビーズ精製システム、およびドロップレット生成装置へのアクセスが必要です。
- マルチプレックスの互換性を確保するため、遺伝子パネルの複雑さに基づいたインデックス設計およびPCRサイクル数のチーム間標準化が不可欠です。
- DNAベースの変異検出以外に、本手法をRNAシーケンシングや融合転写産物検出に適用する場合は、適応に関する検討が必要です。
- 入力DNAの品質と量に関連する実用的な制限があり、収量の低いサンプルではPCRサイクル数を増やす必要があり、それがバイアスの導入につながる可能性があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Incorporating i5 and i7 Adapters onto Error-corrected Sequencing Libraries
3:36
Quantifying the Libraries with QX200 Digital Droplet PCR (ddPCR)
6:14
Amplifying and Normalizing the Libraries for Sequencing
7:37
Results: Mutation-calling with Error-corrected Sequencing (ECS)
9:14
Conclusion
