エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々 の方法をについて説明します。

この方法は、前がんクローンの検出、治療後の白血病患者の予後評価、骨髄ドナーの潜在的に病原性変異の同定など、さまざまな研究分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。私と一緒にこの手順を実演するのは、研究室の技術者であるスペンサーです。このビデオでは、エラー訂正シーケンシングプロトコルをIlluminaケミストリーおよび市販の遺伝子パネルと組み合わせて、クローン性単一ヌクレオチド変異体および小さなインデルを10, 000分の1の感度で検出する方法について説明します。

必要な固有の分子識別子を組み込むために、カスタマイズされた16N i5およびi7アダプターはPCRを使用します。まず、市販の代替品よりも忠実度の高いポリメラーゼを使用したQ5 Master Mixを調製します。次に、各反応について、37.5マイクロリットルのQ5マスターミックス、6マイクロリットルの5マイクロモル16N i5アダプター(一意の分子識別子)、および6マイクロリットルのi7アダプターを組み合わせます。

多重化が目的である場合は、別々のサンプルで異なる i7 アダプターを使用します。次に、摂氏98度で30秒、摂氏98度で10秒、摂氏66度で30秒、摂氏72度で30秒の4〜6サイクルのパラメータを使用してPCRを実行します。摂氏72度で2分間の延長で反応を終了し、摂氏4度で保持します。

次に、それらに対して行わなければならない両方のPCRサイクルは、使用する遺伝子パネルのサイズに依存する可能性が高く、私たちの経験から、遺伝子パネルに約1500の異なる遺伝子特異的オリゴのパスがある場合は4サイクルPCRで十分ですが、約5〜600ペアのオリゴを持つパネルには約6サイクルのPCRが必要です。次に、磁気ビーズを使用してPCR反応をクリーンアップし、各75マイクロリットルのPCR産物に56.25マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を加え、次に各反応を別々の1.5ミリリットルの低結合チューブに移し、少なくとも10回ピペッティングで上下させて混合し、5分間待ちます。次に、混合物を磁気ホルダーに移し、上清を2分間透明にします。

次に、上清を取り除いて捨てます。次に、200マイクロリットルの70%エタノールを追加し、30秒待ってから、エタノールを取り除きます。このエタノール洗浄ステップを一度繰り返してから、ビーズを5分間自然乾燥させます。

最後に、ビーズから修飾されたライブラリーを20マイクロリットルの二重蒸留水で溶出します。次に、チューブを磁気ラックに置き、磁気ビーズを溶離液から分離します。まず、前のステップのECSライブラリをPCRストリップの1,000個あたり1個まで10倍に段階希釈します。

次に、1.5ミリリットルのチューブにマスターミックスを調製します。各反応について、10マイクロリットルのddPCR EvaGreen Mix、0.2マイクロリットルのP5プライマー、0.2マイクロリットルのP7プライマー、および4.6マイクロリットルの二重蒸留水を組み合わせてください。次に、EvaGreen Master Mixの15マイクロリットルを新しいチューブセットにピペットで移し、最後に1〜1,000 ECSの5マイクロリットルをマスターミックスに追加します。

次に、ドロップレットジェネレーターを使用してPCRドロップレットを作成します。まず、カセットをロードし、70マイクロリットルの液滴発生油をカセットのウェルにピペットし、標識油をピペットし、ddPCR反応混合物の20マイクロリットルをウェル標識サンプルにピペットします。次に、カセットをゴム製のガスケットで覆い、液滴発生器にロードし、すべての液滴生成を進めます。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各カセットウェルから採取した45マイクロリットルの液滴を5秒以上かけてゆっくりと新しいPCRプレートにロードします。次に、PCRプレートをアルミホイルで密封します。次に、次の条件を使用して液滴内の信号を増幅します:摂氏95度で5分間、続いて摂氏95度で30秒のサイクルを40回、摂氏63度で1分間、次に反応を摂氏4度まで5分間冷却してから、摂氏90度まで5分間上げます。 そして摂氏4度で保持します。

次に、ddPCRテンプレートドロップレットリーダーマシンを準備します。絶対定量用のパラメーターを選択し、QX200 ddPCR EvaGreen Supermix を使用します。次に、反応を液滴リーダーに通します。

ddPCR解析が完了したら、各サンプルに同じ分割閾値を適用します。次に、各ライブラリを目的の分子数に正規化します。まず、25マイクロリットルのQ5マスターミックス、2マイクロリットルの1マイクロモルP5プライマー、2マイクロリットルの1マイクロモルP7プライマー、および21マイクロリットルの正規化DNAライブラリーからなる50マイクロリットルの反応を行います。

次に、摂氏98度で30秒、摂氏98度で10秒、摂氏66度で30秒、摂氏72度で30秒、摂氏72度で2分、摂氏4度で保持するパラメータを使用してPCRを実行します。次に、ライブラリ内のDNA濃度を定量し、シーケンシングのためにライブラリを等量でプールし、約4ナノモルを標的とします。次に、Illumina シーケンシングプラットフォームを使用して、プールされた ECS ライブラリのシーケンシングを、144 ペアエンドリードの 2 倍、インデックス 1 の 8 サイクル、インデックス 2 の 16 サイクル

GATA1に変異を有する患者のDNAを、市販のゲノムDNAで元のVAF0.19で希釈した。記載されたプロトコルを使用して、ECSは、単一ヌクレオチド変異体に対して1〜10,000のレベルまで定量的であることが証明されました。次に、20人の健康な個人からのバフィーコートサンプルを、568アンプリコンで構成される市販のシーケンシングパネルを使用して分析しました。

要約すると、109のクローン体細胞変異が、既知の宇宙表現を持つ突然変異の0.0003から0.1451.21の範囲の変異対立遺伝子画分を持つ少なくとも1つの収集時点の両方の反復に存在し、それぞれがデジタル液滴PCRを使用して検証されました。プロトコルのエラー訂正された発現レベルを実証するために、さまざまながんに関連することが知られている415の遺伝子からなるカスタマイズされた遺伝子パネルを使用して、各遺伝子の最も一般的に発現するエクソンから構築されたライブラリを作製しました。低存在量の転写産物の発現レベルは、反復間で非常に再現性が高かった。

次に、デジタルドロップレットPCRを使用して、発現の異なる6つの選択された遺伝子を検証しました。比較により、遺伝子の発現レベルは、正規化を必要とせずに、ECSプロトコルによって正しく捕捉されたことが示されています。一度テクニックをマスターすれば、このテクニックは1日半で快適に行うことができます。

時間の大部分はインキュベーションに費やされ、研究者が同時に処理するサンプルの数にもよりますが、手作業による処理は必要な合計時間の約30〜40%を占めます。この手順を試行する際には、同じサンプルのレプリケートシーケンシングライブラリを用意することが非常に重要です。これにより、低頻度の突然変異が真陽性であるという確信が持てるようになります。これは、突然変異自体が両方の反復で独立してコアである場合です。

この手順に続いて、ECS RNAなどの他の事項を実行して、低存在量の転写産物の検出や融合転写産物などの質問に答えることができます。開発後、この技術は主に血液悪性腫瘍の分野の研究者に道を開き、この技術を使用して健康な個人の白血病前クローンを探索し、寛解した白血病患者の微小残存病変を検出します。