Name: エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶエラー修正DNA・RNAシーケンス法で、Illumina化学と独自分子識別子を用いて変異アレル頻度0.0001の希少変異を検出する手法です。がん研究や遺伝子機能解析に有用です。

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我々 は腫瘍グループ AAML1531 子どもと看護師の保健研究患者サンプルの形で彼らの貢献のために参加者に感謝します。この仕事、国立衛生研究所 (UM1 CA186107、RO1 CA49449 RO1 CA149445)、子供の発見研究所のワシントン大学とセントルイス子供病院 (MC-II-2015-461) とイーライ セス ・ マシューズ白血病財団によって資金を供給されました。

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
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<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
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<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
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<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、さまざまな病気で低 VAFs と突然変異を研究する簡単に実装することができますシーケンスのエラー修正プロトコルのスイートを紹介します。最も重要な彼らは raw 読み取りのエラー訂正を有効にすると各分子シーケンスの前に行政の混入であります。ここで説明する方法は、市販遺伝子パネルおよび自己設計されていた遺伝子特定 oligos の両方にカスタマイズされた行政を組み込む研究者を許可します。
NGS の標準プロトコル シーケンス エラー率 2% 以下エンと遺伝子変異の検出を排除する、これは稀な変形の検出は重要な研究の NGS のアプリケーションを制限します。標準の NGS 誤り率を回避、ECS これら生の変異体の高感度検出できます。例えば、これらの突然変異は最初 (したがって、低エン) 起こるとき病原性の変異の検出は病気14,15の早期介入を通知することが不可欠。白血病研究、最小残差の検出の病 (治療後残存白血病細胞) がリスク層別化を通知し、バイナリ流れフローサイトメトリー評価できない方法で治療の選択肢が通知される可能性があります。さらに、ECS は循環腫瘍核酸を検出し、プライマリの特性は、特定の突然変異のバリアントの負担と同様に有無を評価することによって固形腫瘍患者における転移能を評価する適切です腫瘍16。
表 1に示されているように、バリアントを呼び出す位置固有のエラーの二項分布に基づくモデルを使用しての力はエラー モデルの構築に使用されるシーケンスの深さと同様に、シーケンスされたライブラリの数に大きく依存します。エラー モデルのロバスト性のサンプルと詳細シーケンス数の増加とともに増加します。各サンプルのエラー プロファイルを構築するサンプルあたり 3000 x のエラー修正リード カバレッジの平均で少なくとも 10 シーケンスされたサンプルを使用することをお勧めします。位置特定方法と同じです、MAGERI がすべての六つの異なる置換タイプの集計エラー率を使用しての代わり (A > C/T > G、A > G/T > C、A > T/T >、C > A/G > T、C > G > C、C > T/G > A)13, 我々 はすべての位置で独立して各置換モデルします。例えば、C のエラー発生率 > 所定ゲノムの位置に T は別の位置から異なる。我々 のアプローチも考慮シーケンス バッチ効果シーケンス実行の 1 つにみられる塩基置換率は別の実行から異なる場合があります。したがって異なるシーケンスの実行からのサンプルはモデルの構築にプールされる場合は特にすべての置換型のそれぞれの位置をモデル化することが重要です。
ECS 実験を設計するときの重要な考慮事項は、所望の検出のしきい値です。NGS 研究の美しさは遺伝子/ターゲットの興味、(配列の深さによって決定)、検出しきい値および照会個体数の面で、簡単に縮小できます。たとえば、研究者が 0.0001 の検出閾値を持つ 2 つの産物のまれな突然変異を見つけるに興味があるなら、MiSeq V2 化学まで 1500 万読み取りを出力を使用して実行、単一シーケンスで最大限に 75 検体をプールできる (2 amplicons * 10,000分子 * 10 読み取りエラー補正 * 75 検体 = 1500 万配列読み取り)。研究者は分子シーケンスまたは検出しきい値を調整するために実行する単一シーケンスでプールされたサンプルの数に入るの数を変更できます。私たちの研究で検出しきい値を持つ 0.0001 エン (1:10, 000) の突然変異を見つけることを目指しましたイルミナ遺伝子パネルを使用します。我々 は日常的に 250 を使用して十分な分子が前述の検出閾値を達成するためにキャプチャされるように DNA の開始の ng。研究者は、DNA の低量の開始する選ぶことができます (50 ng をお勧めします) 目的の検出限界がある場合 > 0.001 エン。
行政は、i5 のインデックスに追加されます、シーケンス設定はそれに応じて改正されるあります。たとえば、16 の N 行政を使いました、シーケンス設定された 2 x 144 対最後の読み取り、インデックス 1 の 8 サイクル、インデックス 2 の通常 8 サイクルではなくインデックス 2 の 16 のサイクル。インデックス 2 サイクルの増加は、読み取りに割り当てられた合計回数の減少によって補償されています。研究者は 12 n Umi10,17を使用することを選ぶ、設定はインデックス 2 の 12 のサイクルを変更する必要があります。
この海ベースのシーケンスのメソッドは、シーケンス エラーの修正に最適です。すべて増幅方式のための問題である PCR 表示をあつかう上で最適ではないままです。ポスト シーケンスと ddPCR を使用してポスト バイオインフォマティクス検証のラウンドを行い、我々 はほとんど PCR 表示による任意の偽陽性を検出します。それにもかかわらず、研究者が低増幅エラー高忠実度ポリメラーゼを用いた実験を行うことをお勧めします。

我々 として年齢、変異原性物質と細胞分裂結果、ゲノム、これで身体異常の蓄積で中確率のエラーへの暴露の基となる悪性転化の根本的な病因神経疾患、小児障害と正常な老化1,2。病気運転可能性と体細胞突然変異は、早期発見とリスク管理3,4、5の重要な診断と予後バイオ マーカーです。生理学的な clonogenesis が理解するために臨床通知し、意思決定、定量の正確さおよびこれらの突然変異の特性を研究する重要です。次世代シーケンス (NGS) は、異種の DNA サンプルにクローン変異の研究に現在使用されてただし、NGS は突然変異を識別する制限 > 0.02 バリアント アレル分数 (エン)-0.5-2.0 の固有の誤り率のためシーケンス プラットフォーム6,7,8%。その結果、診断と予後追跡低いエンで重要な体の亜種では得られない標準 NGS。
近年、様々 なメソッドは、NGS8,9,10,11のエラー率を回避するために開発されています。これらのメソッドは、シーケンス処理の後のエラー訂正を可能分子タギングを利用します。各分子やゲノム断片配列ライブラリでは付くと、ランダムなユニークな分子識別子 (UMI) その分子に固有です。行政は、無作為化ヌクレオチド (8-16 N) の文字列の順列を構築されています。2 番目サンプル固有のバーコードも、ワークフロー実行同じ NGS シーケンスに複数のサンプルを多重伝送が可能に統合されます。Pcr は分子タグ ライブラリで実行され、シーケンス処理用ライブラリを送信するその後。ライブラリの準備中、エラーでがゲノム フラグメントを pcr とシーケンス8中にランダムに導入されることが期待されます。ランダムなシーケンス エラーを削除するには、生配列読み取りが UMI に従ってグループ化されます。シーケンスからの人工物は真のバリアントが忠実に増幅し、同じ海を共有すべての読み取りでシーケンスに対し導入の確率論的性質同じゲノムの位置に同じ海ですべての読み取りに存在することは行われません。成果物が削除されます bioinformatically です。ここでは、3 つのメソッドのエラー修正のシーケンス (ECS) 研究所単一のヌクレオチドの亜種 (SNVs) と小さな挿入削除 (オクターリピート) を識別するために DNA および RNA 遺伝子発現下の定量化を容易にするための最適化について述べる、NGS のエラーのしきい値。
最初の方法では、研究者によって設計された遺伝子特異的プライマーを用いた珍しい体イベントを探す方法について説明します。ライブラリの準備の前に研究者は興味のかけらをターゲットにプライマーを設計する必要があります。Web アプリ Primer3 を使いました (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。200-250 bp の産物は、これらは、行政が組み込まれて一度ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に最適、ペアエンド リード 150 bp ペアエンド リードでの重複を生成します。使用する最適なプライマー設計条件: 最小プライマー サイズ = 19;最適なプライマー サイズ = 25;最大プライマー サイズ = 30;最小 Tm = 64 ° C;最適な Tm = 70 ° C;最大 Tm = 74 ° C;Tm 差の最大値 = 5 ° C;GC の最小の内容 = 45;最大 GC コンテンツ = 80。返される数 = 20;最大 3' 端安定性 = 100。
方法 2 のクローン SNVs と小さなオクターリピート 0.0001 エン amplicons の数百を含む市販遺伝子パネルを使用してのようにまれにイルミナ化学と ECS DNA のプロトコルを組み合わせる手法について述べる.TruSight 骨髄性シーケンス パネル (イルミナ) を実験に使用し、小児の骨髄性疾患のための興味の遺伝子を含むように拡張されたパネルを設計しました。これらのパネルがこれらのパネルに独自のアダプターの戦略を追加しましたので、エラー訂正を促進するようなユニークな分子識別子 (Umi) を提供していません。ECS が動作するはずです同様に他のさまざまな病気と関連付けられる遺伝子の豊かに設計のパネルのいずれかで。次の DNA の隔離および組織または目的の標本から後続の定量化、それは少なくとも 500 に勧め株 DNA 試料当りの ng。我々 は日常的に 250 を使用して単一配列ライブラリを作る ng の下流をできるだけ多くユニークなゲノム フラグメントとしてキャプチャするために DNA の重複とエン計算を読み取ります。残りの 250 とオプションの複製シーケンス ライブラリを作ることができる DNA の ng。標本あたり 2 つのライブラリのレプリケートを常に確認、真陽性として両方の複製で独立して検出されたイベントのみを考えます。4,13を呼び出すバリエーションの精度を高めるためのゲノム位置特異的二項エラー モデルを実施します。
最後に、ECS を市販の QIAseq ターゲット RNA パネル (Qiagen) を使用して転写定量化のための RNA シーケンスに結合手法について述べる。重複除外に必要な行政とエラー訂正は、キットに盛り込まれているし、研究者は、ライブラリの製造元の推奨事項に従います。Bioinformatically、研究者は、ECS-DNA のプロトコル セクションで詳細に説明するために概説パイプラインを従うことができます。

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 アダプター配列</td><td>Integrated DNA</td> <td>Technologies-NEBNext</td><td></td></tr> <tr><td>Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 液滴生成オイルEvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 カートリッジ QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight 骨髄系シーケンシングパネル</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>ジョンズホプキンス大学</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>カスタマイズされたQIAseqターゲットRNAパネル</td><td>Qiagen-Rneasy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

エラー修正 dna ・ rna シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

従来の次世代シーケンシング技術 (NGS) は、10 年以上の巨大なゲノム解析を許可しています。具体的には、NGS は悪性腫瘍にクローン変異のスペクトルを分析するために使用されています。従来サンガー、NGS 闘争その高い誤り率 ~0.5–2.0% によるまれなクローンと subclonal 突然変異を識別するよりもはるかに効率的です。したがってがある突然変異の検出限界を持つ標準的な NGS > 0.02 バリアント アレル分数 (エン)。患者のまれな突然変異の臨床的意義、知られている病気は、明白でなく残ることがなく白血病の治療を受けた患者が大幅に向上成果残存病変が < フローサイトメトリーによる 0.0001。NGS のこの artefactual 背景を軽減するために多くの方法が開発されています。ここでエラー修正 DNA および RNA シーケンス (ECS)、エラー訂正のため 16 bp ランダム インデックスと多重化のための 8 bp 患者固有のインデックスの個々 の分子のタグ付けを含むため手法について述べる。本手法は検出し、バリアント アレル分数 (VAFs) 2 桁の NGS の検出限界よりも低く、0.0001 エンのようにまれにクローン変異を追跡できます。

Targeted Error-Corrected は、DNA の配列に突然変異患者商業の genomic DNA の DNA を希釈原理検証実験の証拠を行った。患者は、GATA1 突然変異 (chrX:48650264、C &gt; G) 0.19 の元エンと。図 1に ECS が単一のヌクレオチドのバリアントのため 1: 10,000 レベルを定量的であることを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> 図 1: GATA1 SNV が ECS が 1: 10,000 レベルを定量的であることを示す希釈系列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
また、ECS DNA は確実に高齢健常者4成人急性骨髄性白血病 (AML) における反復的遺伝子のまれなクローン変異を検出.バンク約離れて 〜 10 年ナースの健康における 20 健常者からバフィー コートのサンプルを入手しました。我々 はこれらのサンプルに ECS DNA パネル プロトコルを適用されます。この実験は、我々 イルミナ TruSight 骨髄性シーケンス パネル 568 amplicons (詳細 https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html の遺伝子リスト) で構成される適応し、シーケンス20 人から 80 ライブラリ (異なる時点での 2 コレクションは、時間ごとに個別あたり 2 複製ポイント) 4770 万ペアエンド読み取りの平均と 340 万エラー修正の平均を生成するイルミナ NextSeq プラットフォームを使用してライブラリ4ごとコンセンサス配列。ライブラリあたり平均ヌクレオチド報道約 6,000 (3.4 百万 568 で割った値) x だった。各サンプルでは、同じサンプルからはシーケンスのライブラリを使用して位置固有のエラー プロファイルを構築しました。我々 は、少なくとも 1 つのコレクションの時間ポイントの両方のレプリケートに存在していた 109 のクローン体細胞の突然変異を見つけた。これらの突然変異があるエン 0.0003-0.1451 に至る。既知の宇宙の表現と 21 の突然変異を選択し、ddPCR を使用して 1 つまたは 2 つのコレクションの時間ポイントのすべての 21 の変異を検証 (n = 34、図 2、若いら20164から適応)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> 図 2: ECS によって識別される突然変異が高い一致 VAFs と ddPCR を介して確認した。(n = 34、若いら20164から変更)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
(QIAseq 人間癌トランスクリプトーム パネルから適応)、種々 の癌と関連付けられる知られていた 416 の遺伝子で構成される QIAseq 化学を用いた遺伝子パネルをカスタマイズしました ECS RNA のプロトコルを使用して表現のエラー訂正レベルに関してある特定の遺伝子 (遺伝子リスト補足資料1) の最も一般に表されたエクソンを増幅します。我々 はライブラリあたり 830 万読み取りの平均を与えたペアエンド形式でイルミナ MiSeq プラットフォームを使用してライブラリを塩基配列し、41 万 7000 エラー修正コンセンサス シーケンスの平均値を取り込むことができた。低豊富な転写産物の発現レベルを示した (&lt; 1,000 トラン スクリプト数 50 ng のトータル RNA の) 複製間再現性の高い、(データ ポイント n = 300、図 3)。DdPCR (表現の度合いの六つの選択した遺伝子) を使用した検証は、遺伝子の発現レベルが正しく正規化を必要とせず ECS プロトコルによって捕獲されていたことを示した。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> 図 3: 同じサンプルの複製の間 ECS RNA によって上部には、トラン スクリプトの相関をカウント (n = 300).下、ECS で識別されるカウントは ddPCR によって立証されたトラン スクリプト (n = 6)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々 の方法をについて説明します。

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

この方法は、前がんクローンの検出、治療後の白血病患者の予後評価、骨髄ドナーの潜在的に病原性変異の同定など、さまざまな研究分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。私と一緒にこの手順を実演するのは、研究室の技術者であるスペンサーです。このビデオでは、エラー訂正シーケンシングプロトコルをIlluminaケミストリーおよび市販の遺伝子パネルと組み合わせて、クローン性単一ヌクレオチド変異体および小さなインデルを10, 000分の1の感度で検出する方法について説明します。必要な固有の分子識別子を組み込むために、カスタマイズされた16N i5およびi7アダプターはPCRを使用します。まず、市販の代替品よりも忠実度の高いポリメラーゼを使用したQ5 Master Mixを調製します。次に、各反応について、37.5マイクロリットルのQ5マスターミックス、6マイクロリットルの5マイクロモル16N i5アダプター(一意の分子識別子)、および6マイクロリットルのi7アダプターを組み合わせます。多重化が目的である場合は、別々のサンプルで異なる i7 アダプターを使用します。次に、摂氏98度で30秒、摂氏98度で10秒、摂氏66度で30秒、摂氏72度で30秒の4〜6サイクルのパラメータを使用してPCRを実行します。摂氏72度で2分間の延長で反応を終了し、摂氏4度で保持します。次に、それらに対して行わなければならない両方のPCRサイクルは、使用する遺伝子パネルのサイズに依存する可能性が高く、私たちの経験から、遺伝子パネルに約1500の異なる遺伝子特異的オリゴのパスがある場合は4サイクルPCRで十分ですが、約5〜600ペアのオリゴを持つパネルには約6サイクルのPCRが必要です。次に、磁気ビーズを使用してPCR反応をクリーンアップし、各75マイクロリットルのPCR産物に56.25マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を加え、次に各反応を別々の1.5ミリリットルの低結合チューブに移し、少なくとも10回ピペッティングで上下させて混合し、5分間待ちます。次に、混合物を磁気ホルダーに移し、上清を2分間透明にします。次に、上清を取り除いて捨てます。次に、200マイクロリットルの70%エタノールを追加し、30秒待ってから、エタノールを取り除きます。このエタノール洗浄ステップを一度繰り返してから、ビーズを5分間自然乾燥させます。最後に、ビーズから修飾されたライブラリーを20マイクロリットルの二重蒸留水で溶出します。次に、チューブを磁気ラックに置き、磁気ビーズを溶離液から分離します。まず、前のステップのECSライブラリをPCRストリップの1,000個あたり1個まで10倍に段階希釈します。次に、1.5ミリリットルのチューブにマスターミックスを調製します。各反応について、10マイクロリットルのddPCR EvaGreen Mix、0.2マイクロリットルのP5プライマー、0.2マイクロリットルのP7プライマー、および4.6マイクロリットルの二重蒸留水を組み合わせてください。次に、EvaGreen Master Mixの15マイクロリットルを新しいチューブセットにピペットで移し、最後に1〜1,000 ECSの5マイクロリットルをマスターミックスに追加します。次に、ドロップレットジェネレーターを使用してPCRドロップレットを作成します。まず、カセットをロードし、70マイクロリットルの液滴発生油をカセットのウェルにピペットし、標識油をピペットし、ddPCR反応混合物の20マイクロリットルをウェル標識サンプルにピペットします。次に、カセットをゴム製のガスケットで覆い、液滴発生器にロードし、すべての液滴生成を進めます。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各カセットウェルから採取した45マイクロリットルの液滴を5秒以上かけてゆっくりと新しいPCRプレートにロードします。次に、PCRプレートをアルミホイルで密封します。次に、次の条件を使用して液滴内の信号を増幅します:摂氏95度で5分間、続いて摂氏95度で30秒のサイクルを40回、摂氏63度で1分間、次に反応を摂氏4度まで5分間冷却してから、摂氏90度まで5分間上げます。 そして摂氏4度で保持します。次に、ddPCRテンプレートドロップレットリーダーマシンを準備します。絶対定量用のパラメーターを選択し、QX200 ddPCR EvaGreen Supermix を使用します。次に、反応を液滴リーダーに通します。ddPCR解析が完了したら、各サンプルに同じ分割閾値を適用します。次に、各ライブラリを目的の分子数に正規化します。まず、25マイクロリットルのQ5マスターミックス、2マイクロリットルの1マイクロモルP5プライマー、2マイクロリットルの1マイクロモルP7プライマー、および21マイクロリットルの正規化DNAライブラリーからなる50マイクロリットルの反応を行います。次に、摂氏98度で30秒、摂氏98度で10秒、摂氏66度で30秒、摂氏72度で30秒、摂氏72度で2分、摂氏4度で保持するパラメータを使用してPCRを実行します。次に、ライブラリ内のDNA濃度を定量し、シーケンシングのためにライブラリを等量でプールし、約4ナノモルを標的とします。次に、Illumina シーケンシングプラットフォームを使用して、プールされた ECS ライブラリのシーケンシングを、144 ペアエンドリードの 2 倍、インデックス 1 の 8 サイクル、インデックス 2 の 16 サイクルのシーケンシング設定でシーケンシングします。GATA1に変異を有する患者のDNAを、市販のゲノムDNAで元のVAF0.19で希釈した。記載されたプロトコルを使用して、ECSは、単一ヌクレオチド変異体に対して1〜10,000のレベルまで定量的であることが証明されました。次に、20人の健康な個人からのバフィーコートサンプルを、568アンプリコンで構成される市販のシーケンシングパネルを使用して分析しました。要約すると、109のクローン体細胞変異が、既知の宇宙表現を持つ突然変異の0.0003から0.1451.21の範囲の変異対立遺伝子画分を持つ少なくとも1つの収集時点の両方の反復に存在し、それぞれがデジタル液滴PCRを使用して検証されました。プロトコルのエラー訂正された発現レベルを実証するために、さまざまながんに関連することが知られている415の遺伝子からなるカスタマイズされた遺伝子パネルを使用して、各遺伝子の最も一般的に発現するエクソンから構築されたライブラリを作製しました。低存在量の転写産物の発現レベルは、反復間で非常に再現性が高かった。次に、デジタルドロップレットPCRを使用して、発現の異なる6つの選択された遺伝子を検証しました。比較により、遺伝子の発現レベルは、正規化を必要とせずに、ECSプロトコルによって正しく捕捉されたことが示されています。一度テクニックをマスターすれば、このテクニックは1日半で快適に行うことができます。時間の大部分はインキュベーションに費やされ、研究者が同時に処理するサンプルの数にもよりますが、手作業による処理は必要な合計時間の約30〜40%を占めます。この手順を試行する際には、同じサンプルのレプリケートシーケンシングライブラリを用意することが非常に重要です。これにより、低頻度の突然変異が真陽性であるという確信が持てるようになります。これは、突然変異自体が両方の反復で独立してコアである場合です。この手順に続いて、ECS RNAなどの他の事項を実行して、低存在量の転写産物の検出や融合転写産物などの質問に答えることができます。開発後、この技術は主に血液悪性腫瘍の分野の研究者に道を開き、この技術を使用して健康な個人の白血病前クローンを探索し、寛解した白血病患者の微小残存病変を検出します。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

ゲノム規模でのRNA編集イベントの迅速な検出と信頼性の高い定量化は依然として困難であり、現在は直接RNAシーケンシング法に依存しています。ここで説明するプロトコルは、RNA編集を検出するための簡単で迅速でポータブルな方法として、微小温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)を使用しています。...

RNA編集の迅速な検出のためのノンシーケンシングアプローチ

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

単一細胞配列決定は、高解像度でゲノムの変化に対処するため、ますます人気とアクセス可能なツールです。我々は、単一の細胞内のコピー数の変化を識別するために、単一細胞の配列決定を使用するプロトコルを提供します。...

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

学ぶエラー修正DNA・RNAシーケンス法で、Illumina化学と独自分子識別子を用いて変異アレル頻度0.0001の希少変異を検出する手法です。がん研究や遺伝子機能解析に有用です。

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

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