サッカロマイセス・セレビジアにおける新生および成熟転写産物のRNA構造比較解析
2026年2月27日
RNAの二次構造は主に成熟RNAで構造プローブ法を用いて観察されています。共転写構造追跡シーケンシング(CoSTseq)は、新生RNA上のポリメラーゼ位置の研究に用いられてきた核ランオンと構造プロービングを統合します。これにより、活性転写下のRNAのRNA二次構造の観察が可能になります。
共転写RNA処理を研究し、それにはRNAポリメラーゼから生還するRNAの折りたたみ方も含まれます。この方法以前は、合成中のRNAの折りたたみを監視できず、これが研究の妨げとなっていました。この新しい方法はそのギャップを克服しています。
CoSTseqは酵母における新生RNA折りたたみを調査するために開発されました。特に大量のRNAの解析に効果的です。まず、サッカロマイセス・セレビシエ株BY4741を50ミリリットルのYPAD培地に接種し、30度の温度で200回転毎分の振動で培養し、培養が中期ログ段階に達するまで培養します。
約3ミリリットルの酵母培養を採取し、1.8光密度単位に相当し、2,500 x gの遠心分離機を4度の環境で3分間、4度の環境で遠心分離機に置きます。上澄液を廃棄物容器に捨てます。ペレットを冷たいPBS10ミリリットルに再懸浮させ、再び2,500 x gで遠心分離機で4度Cの温度で3分間加熱します。
上清液を取り除き、酵母ペレットは氷の上に保管してください。酵母ペレットを10ミリリットルの冷たい0.5%サルコシルに慎重に再懸浮させ、泡を作らないようにしてください。再懸濁酵母を氷上で20分間培養して浸透させ、その後400 x gで4度の温度で5分間ペレットし、P-1000ピペットを使ってヌクレアーゼフリー水100マイクロリットルに再懸浮させます。
2.5倍の転写バッファーと新たに追加された5ミリモラのジチオスレイトールの作業液を準備し、2.5倍の構造プロービングバッファーを30度Cに予熱します。きれいな2ミリリットルのチューブに必要な反応成分をすべて加え、十分に混ぜます。次に、準備済みの酵母細胞100マイクロリットルを反応管に加え、サーモミキサーで30度に設定し、毎分500回転で2分間振る。
その後、予温された2.5倍構造プロービングバッファーを200マイクロリットルと、同時に硫酸ジメチル試薬25マイクロリットルを加えます。チューブを2回のパルスで優しく渦巻き、インキュベーターに戻す。温度は30度、回転は毎分500回転。サーモミキサーで4分間、サンプルごとに30秒間隔で孵化を続けます。
脱水後は、上澄液を適切な廃棄容器に捨てます。ペレットに冷却したウォッシュバッファーを1ミリリットル加え、再懸浮します。遠心分離を3,500 x gで5分間繰り返します。
すぐにRNA抽出に進み、酵母ペレットは冷凍しないでください。ジメチル硫酸塩標識された酵母ペレットを600マイクロリットルのRNA溶解バッファーに再懸濁させ、その後懸浮液を20%ドデシル硫酸ナトリウム40マイクロリットルのチューブに移します。サンプルを65度Cで30秒間培養し、毎分950回転で振る。
次に、標準手順に従ってRNAのフェノール・クロロホルム抽出を行います。ボルテックスはストレプタビジンの磁性ビーズを形成し、44マイクロリットルのビーズを新しいチューブに移し、1サンプルあたり80マイクログラムの総RNAを含みます。磁気ビーズを磁気ラックに置き、ビーズが落ち着くまで待ってください。
貯蔵バッファーを除去した後、ビーズを1ミリリットルのプリウォッシュバッファーAに再懸濁させます。次に、懸濁液を室温で2分間培養し、その後磁化して上清液を除去します。洗浄後、ビーズを2倍結合バッファーの88マイクロリットルに再懸浮させます。80マイクロリットルの懸濁液を、80マイクロリットルのビオチニル化RNAサンプルを含む無菌1.5ミリリットル管に移します。
ビーズサンプル混合物を室温で回転させて20分間回転させます。その後、チューブを磁気ラックに置き、成熟RNAを含む流れを採取し、沈殿のために保存してDMS-MaPseqワークフローで成熟RNAのポリA選択を行います。次に、ビーズ発生RNA複合体を高塩緩衝液500マイクロリットルで2回洗い流します。
その後、1X結合バッファー500マイクロリットルで一度洗浄し、最後に500マイクロリットルの低塩バッファーで洗浄します。次にビーズ=新生RNA複合体に300マイクロリットルのRNA試薬を加え、十分に再懸濁させて60度のサーモミキサーで5分間培養します。次にクロロホルム60マイクロリットルを加え、ボルテックスして室温で3分間培養します。
サンプルを14,000 x gで5分間、予冷遠心分離機で遠心分離します。最後に、約180マイクロリットルの上部水相を新しい集水管に移します。残った有機相を捨て、ビーズと残留水溶液を残します。
新生RNAを精製した後、テンプレートスイッチング逆転写を行い、5'アダプターを結紮し、シーケンス用のライブラリを選択します。1%アガロースゲル上のテストPCR産物の可視化では、プライマー二量体の形成が最小限で、共転写構造トラッキングシーケンス(CoSTseqおよびDMS-MaPseqライブラリ)で約300塩基対の特徴的なスメアが見られました。CoSTseqサンプル1の電気泳法検査では、約285塩基対のピークでライブラリーサイズ分布が確認されました。
ASC1 mRNAのリードアラインメントにより、CoSTseqライブラリーがイントロン全体にカバレッジを含み、RNAが未成熟であることが確認されました。一方、DMS-MaPseqライブラリはイントロンカバレッジが不足しており、RNAが成熟していることを示しています。18Sのpre-rRNAのcot転写折りたたみ行列は、RNAポリメラーゼがrDNA遺伝子座の位置790から811位に進行する際にDMS反応性が急激に変化することを明らかにしました。
ADH1 mRNAのDMS反応性解析では、新生型と成熟型の間で類似したプロファイルが見られ、構造的安定性領域が示唆されました。対照的に、SSA2 mRNAは新生型と成熟型間で異なるDMS反応性領域を示し、成熟期の構造変化を示唆しました。CoSTseqを用いることで、研究者はin vivoで生前RNAの二次構造やRNA転写物上に位置するRNAポリメラーゼの位置を特定できます。
CoSTseqは時間制限のある手順があり、有害な化学物質を使用しています。一度に2つのサンプルまで処理するのが望ましいです。CoSTseqから生成される総RNAから、非ビオチニル化RNAを従来のDMS-MaPseqを用いた同時成熟構造プローブに利用できます。
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Overview
This article presents Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq), a method for probing the secondary structure of nascent RNA as it emerges from RNA polymerase in Saccharomyces cerevisiae. CoSTseq enables simultaneous mapping of RNA polymerase position and RNA base pairing status, overcoming previous limitations in studying transient, low-abundance nascent transcripts. The protocol also allows parallel analysis of mature RNA structures using DMS-MaPseq.
Key Study Components
Area of Science
- RNA biology
- Structural genomics
- Molecular genetics
Background
- RNA secondary structures formed during transcription influence gene expression, RNA processing, translation, and stability.
- Traditional methods primarily analyze mature RNA, leaving nascent RNA folding poorly understood.
- Nascent RNAs are rare and transient, making their isolation and structural characterization challenging.
- Understanding cotranscriptional folding is critical for elucidating RNA function and regulation.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a protocol for capturing the structure of nascent RNA in vivo.
- To simultaneously determine RNA polymerase position and RNA base pairing status during transcription.
- To compare nascent and mature RNA structures within the same experimental framework.
Methods Used
- Growth and preparation of S. cerevisiae cultures.
- Transcriptional run-on with biotin-NTP incorporation to stall RNA polymerase at active sites.
- DMS (dimethyl sulfate) treatment to methylate unpaired A, C, and U nucleotides in RNA.
- Biotin-based enrichment of nascent RNA using streptavidin magnetic beads.
- RNA extraction, reverse transcription with template switching, and library preparation for sequencing.
- Parallel DMS-MaPseq workflow for mature RNA structure analysis.
Main Results
- CoSTseq libraries showed coverage across introns, confirming capture of nascent RNA, while DMS-MaPseq libraries lacked intron coverage, indicating mature RNA.
- DMS reactivity profiles revealed abrupt structural changes in 18S pre-rRNA as RNA polymerase progressed along the gene.
- ADH1 mRNA displayed similar DMS reactivity in nascent and mature forms, suggesting structural stability.
- SSA2 mRNA exhibited differences in DMS reactivity between nascent and mature forms, indicating structural remodeling during maturation.
Conclusions
- CoSTseq enables in vivo mapping of nascent RNA secondary structures and RNA polymerase positions.
- The method provides insights into cotranscriptional RNA folding and structural transitions during RNA maturation.
- CoSTseq can be performed alongside DMS-MaPseq for comprehensive analysis of RNA structure dynamics.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq) enables direct analysis of nascent RNA folding and polymerase position in vivo, addressing a critical gap in understanding RNA structure dynamics during transcription. This capability enhances predictive confidence in gene regulation studies and supports mechanistic de-risking at the target validation stage. Integrating nascent and mature RNA structure analysis informs early discovery decisions and portfolio triage in RNA-targeted drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA folding states as transcripts emerge from RNA polymerase.
- Supports functional target validation by mapping structural transitions relevant to gene regulation.
- Improves predictive confidence in RNA-targeted therapeutic hypotheses.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing stable versus dynamic RNA regions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNA structure datasets for downstream screening workflows.
- Enables assay standardization by providing quantitative DMS reactivity profiles.
- Supports reproducibility through parallel analysis of nascent and mature transcripts.
- Facilitates reliable evaluation of compound effects on RNA structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns RNA structure analysis with disease-relevant gene expression systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of RNA-targeted mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement by revealing structural remodeling during RNA maturation.
- Supports mechanistic de-risking for RNA-based therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
CoSTseq integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling comprehensive RNA structure analysis at multiple pipeline stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nascent RNA folding in vivo.
- Screening: Provides quantitative, reproducible DMS reactivity outputs for assay readiness.
- Analytics: Delivers paired-end sequencing data to compare structural states across transcript maturation.
- Translational Research: Connects RNA structure dynamics to disease-relevant gene expression and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA structure analysis across diverse targets and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes RNA structure probing with scalable, parallelizable workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying RNA structural transitions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biology, sequencing, and chemical probing techniques.
- Needs access to paired-end sequencing platforms and analytical infrastructure for DMS reactivity analysis.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or RNA abundance levels.
- Throughput is limited by time-sensitive steps and handling of toxic chemicals.
