Name: TACI: 3D カルシウムイメージング解析のための ImageJ プラグイン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶTACIによる3Dカルシウムイメージング解析法。ImageJプラグインを用いてZ軸方向の細胞運動を補正し、重複する神経細胞の蛍光強度を正確に測定する。神経活動の時系列解析に有用です。

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フラリンイメージングセンターのツァイスLSM 880を使用して、カルシウムイメージングデータを収集しました。ミシェル・L・オルセン博士とユハン・パン博士のIMARISソフトウェアの支援に感謝します。原稿に対する建設的なコメントをしてくれたLenwood S. Heath博士と、GitHub READMEファイルへのコメントをくださったSteven Giavasisに感謝します。この作業は、NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) および NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) から L.N. までサポートされました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。

1. カルシウムイメージング
<ol><li>ハエ幼虫の準備 注:ハエと幼虫は、12時間:12時間の明暗サイクルの下で25°Cに維持されます。<ol><li>ハエをCO2で麻酔する。20〜45人の男性と20〜45人の女性を各フライバイアルに分類し、CO2 曝露から回復するために少なくとも24時間〜48時間与えます。 注:CO2 へのハエの暴露は、可能な限り短い時間続く必要があります。</li>
		<li>幼虫の年齢を同期させるには、ハエを酵母顆粒を含む新しいバイアルにタップし、4〜8時間産卵させます。ハエを新しいバイアルに入れて取り除きます。</li>
		<li>10 mLの20%w / vショ糖溶液を使用して72時間で幼虫を収集します。</li>
	</ol></li>
	<li>顕微鏡と温度制御のセットアップ<ol><li>次の設定を使用して、共焦点顕微鏡( 材料表を参照)とステージインサート付きのz軸ピエゾステージでイメージングを実行します: レーザー、アルゴン; スキャンモード、フレーム; フレームサイズ、512 x 512、速度、最大、チャンネル/ビット深度、1/8ビット、ズーム、1.5、zスタック、スライス=15、保持=スライス、フォーカスデバイスと戦略、明確なフォーカス、フォーカス、 明確な焦点。</li>
		<li>ペルチェ冷却モジュールを熱伝達コンパウンドによってヒートシンクに取り付けて、熱電冷却器を構築します。ペルチェは2Aの電源で駆動されます。</li>
		<li>熱電対マイクロプローブをデータ収集デバイスに取り付けて、温度を記録します。</li>
	</ol></li>
	<li>カルシウムイメージング<ol><li>幼虫を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回すすぎます。</li>
		<li>75 μLの1x PBSをスライドガラスの中央にピペットで貼り付けます。</li>
		<li>1匹または2匹の幼虫を1x PBSに入れ、熱電対マイクロプローブを幼虫の近くに置きます。 注:幼虫とマイクロプローブの間の距離は~5mmでなければなりません。マイクロプローブがそれらに近すぎる位置にある場合、幼虫は動くかもしれません。距離が長いと、温度測定値が不正確になる可能性があります。</li>
		<li>幼虫と熱電対のマイクロプローブをガラスカバーガラスで覆います。カバーガラスをマニキュアで密封します。</li>
		<li>スライドを顕微鏡ステージに置き、25倍の対物レンズを使用して焦点を見つけ、熱電冷却器をスライドに配置します。 注:ペルチェは、幼虫が温度刺激を届けるスライドに直接配置されます。</li>
		<li>共焦点ソフトウェアでは、目的の蛍光細胞に焦点を合わせます。過飽和を避けるためにレーザー出力を調整します。Z スタック設定で最初と最後のスライス位置を設定します。 注意: 光退色を防ぐために、記録する前に可能な限り低いレーザー出力を使用してください。</li>
		<li>Zスタックスキャンと温度記録を同時に開始します。</li>
		<li>ペルチェに電力を供給する電源を制御して、ペルチェ表面温度を変更します。電源をオンにして温度を下げ、電源をオフにして温度を上げます。</li>
		<li>Zスタックスキャンと温度記録を停止します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 3次元カルシウムイメージングデータの解析
<ol><li>カルシウムイメージングデータをTIFFファイルにエクスポートし、内部のTIFFファイルのベース名と同じ名前のフォルダーに保存します。 注: ファイル名に カンマを含めることはできません。<ol><li>ZEN(ブラックエディション)からカルシウムイメージングデータをエクスポートするには、次のパラメータを使用します: ファイルタイプ、TIFF; 圧縮、LZW、チャンネル、2;Zポジション、すべて。時間、すべて。フェーズ、1;地域、いっぱい。</li>
	</ol></li>
	<li>取り付け<ol><li>Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases) から TACI-Calcium_Imaging.jar をダウンロードします。</li>
		<li>メニューバーのプラグインをクリックし、ドロップダウンメニューの[インストール]をクリックして、FIJIにプラグインをインストールします(プラグイン|インストール)。その後、FIJIを再起動します。 注:プラグインを使用しないでください|プラグインをインストールします。</li>
		<li>プラグインをクリックし、TACI-カルシウムイメージングを選択してプラグインを実行します(プラグイン|TACI-カルシウムイメージング)。</li>
	</ol></li>
	<li>RENAME 関数を使用して、TIFF ファイル名を必要な構造に変換します。 注: このツールは、既定の構造として filename_h#t#z#c#.tif を使用します (h# と c# は省略可能で、#: 正の整数)。イメージ ファイル名が既定の構造にない場合は、 RENAME 関数を実行する必要があります。<ol><li>TIFF イメージの名前を変更する必要があるフォルダを選択するには、[ フォルダの参照] をクリックします。</li>
		<li>パラメータ情報を入力します。ファイル名、フェーズ、最大T位置、最大Z位置、チャネルを含む5つのパラメータがリストされています。各パラメーターには、[先行するテキスト]、[パラメーター値]、および [順序] の 3 つの値があります。 注: 情報では大文字と小文字が区別されます。画像ファイル名にパラメータの前にフレーズが含まれている場合は、対応するパラメータの先行テキストとしてフレーズを入力します。画像ファイル名にすべてのパラメータの後にフレーズが含まれている場合は、そのフレーズを投稿テキストとして入力します。<ol><li>ファイル名、最大T位置、最大Z位置を入力し、最大T位置と最大Z位置のパラメータ値にすべての桁が含まれていることを確認してください。</li>
			<li>ファイル名がフォルダ名を使用して自動的に入力されるのを待ちます。</li>
			<li>TIFF ファイル名にフェーズとチャンネルが含まれていない場合は、対応するパラメータ値を空白のままにして、「順番に Na」を選択します。</li>
		</ol></li>
		<li>[ 名前の変更 ] をクリックして、同じ名前と_rのフォルダーを作成します。フォルダー内の TIFF ファイル名が 、ORGANIZE 関数と互換性があるように再構築されていることに注意してください。 注: TIFF イメージのファイル名に_rが追加されました。</li>
	</ol></li>
	<li>ORGANIZE 関数を使用して、同じ Z 位置の TIFF イメージを 1 つのフォルダーに保存します。 注: フォルダ名は、内部の TIFF ファイルの基本名と同じ名前で、コンマは使用できません。<ol><li>TIFF イメージを整理する必要があるフォルダを選択するには、[ フォルダの参照] をクリックします。</li>
		<li>パラメーター CSV ファイル (param.csv) が存在する場合は、パラメーター値が自動的に入力されるのを待ちます。 注: param.csv ファイルには必要な形式があります。ファイル名、フェーズ、position_t、position_z、チャネル、is_grayなどのパラメーターは、列 A から左から右に行 1 に入力する必要があります。各パラメーターに対応する値を行 2 に入力する必要があります。</li>
		<li>パラメーター CSV ファイル (param.csv) が存在しない場合は、パラメーター値を手動で入力します。[位相]と[チャネル]のパラメータ値に文字が含まれ、[T 位置]と[Z 位置]のパラメータ値が T 位置と Z 位置の最大数であることを確認します。イメージ ファイル名にフェーズまたはチャネルが含まれていない場合は、Na と入力します。</li>
		<li>必要に応じてグレースケールの TIFF 画像を作成します。[ 画像は灰色ですか? ] のボックスをオフのままにしておくと、画像がグレースケールされます。</li>
		<li>[ 整理 ] をクリックして、同じ名前と_gray_stacksのフォルダーを作成し、フォルダー内に同じ名前と _# (#: z 位置) のフォルダーを生成します。TIFF ファイルが z 位置で対応するフォルダーに並べ替えられ、パラメーターとその値が見つかる param.csv という名前のファイルが生成されることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>フィジーのTrackMateを使用して、各z位置から目的の細胞の蛍光強度を抽出します。 注意: この手順は、他のイメージングソフトウェアでも実行できます。<ol><li>FIJIのz位置フォルダーにあるTIFF画像を開きます。</li>
		<li>プラグインをクリックしてトラックメイトを実行する |トラッキング |TrackMateをクリックし、必要に応じて次のパラメータを調整します。<ol><li>DoGまたはLoG検出器を使用してください。</li>
			<li>BLOB の直径、しきい値、および中央値フィルターを変更します。ブロブの直径をセルの直径に似るように調整します。セルが楕円形の場合は、短軸に似たブロブの直径を調整します。 メモ: しきい値 を大きくすると、信号強度に影響を与えずにバックグラウンドノイズが信号として拾われるのを防ぐことができます(補足図1)。ただし、 しきい値 を上げると、真の信号を見逃す可能性があります(補足図1)。信号が強い場合は、 メディアンフィルター を使用して塩とコショウのノイズを減らします。</li>
			<li>フィルターを設定して、すべてではないにしても、無関係な信号の一部を削除します。 フィルター X と Y は空間フィルターです。 フィルターX と Y を使用して、実際の信号から離れた無関係な信号を削除します。 注意: 1つの画像にフィルターが設定されている場合は、他のすべての画像をチェックして、実際の信号が削除されていないことを確認することが重要です。</li>
			<li>リンクの最大距離、ギャップを閉じる最大距離、およびギャップを閉じる最大フレームギャップを設定します。リンクの最大距離とギャップを閉じる最大距離をブロブ直径の3倍から5倍に設定し、特にサンプルが時間の経過とともに大幅に移動する場合は、トラックの数を減らすのに役立ちます。ギャップを閉じる最大フレームギャップをスタック内の画像数に設定します。</li>
			<li>関心領域(ROI)の蛍光強度をCSVファイルにエクスポートします。古いバージョンの TrackMate を使用している場合は、[アクションの選択] ウィンドウで [すべてのスポット統計をエクスポート] を選択します。TrackMate バージョンが 7.6.1 以降の場合は、[表示オプション] ウィンドウで [スポット] を選択します。インタラクティブファイルとしてCSVファイルにエクスポートまたは保存します。 注:どちらのファイルもイメージウィンドウとインタラクティブです。ROI を強調表示すると、対応する ROI が画像ウィンドウに表示されます。これらのファイルには、対応する時点 (POSITION_T) における対象のセルの平均強度 (MEAN_INTENSITY または MEAN_INTENSITY_CH1) が含まれています。同じTRACK_IDsは、異なる時点で同じROIを表す必要があります。ただし、これは常に当てはまるとは限らず、必要に応じて手動で修正する必要がある場合があります。TrackMateが一部の時点でROIを認識しない場合、それらの時点は表示されません。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>バックグラウンド蛍光強度を抽出し、Background_list.csvファイルを作成します。 注:この研究では、各z位置のバックグラウンド強度は、蛍光シグナルを含まず、異なる時点からの3〜5つの隣接する同じサイズのブロブの平均値を使用して推定されました。<ol><li>Background_list.csv ファイルには必要な形式があり、各列には Neuron 0 から始まる 1 つのニューロンの情報が含まれています。ニューロン 0 などのニューロン番号を行 1 に入力します。そして、分析された各z位置についてバックグラウンド強度を提供し、ニューロン0について5つのz位置が分析された場合、ニューロン0の下に5つのバックグラウンド強度値を入力する。 注: Background_list.csv ファイルは、TACI 抽出 機能に必要です。バックグラウンドが無視できる場合は、すべてのニューロンのバックグラウンド強度がゼロのBackground_list.csvを提供する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>EXTRACT 関数を使用して、各 t 位置の最大蛍光強度を特定し、式 (1) に示すように ΔF/F0 を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64953/64953eq02.jpg" style="margin: auto;">(1)<ol><li>フォルダーを作成し、ニューロン番号を使用して Neuron 0 から始まる名前を付けます。対応するニューロンの蛍光情報を含むCSVファイルをフォルダに保存します。各 CSV ファイルには 1 つの Z 位置の情報が含まれているため、CSV ファイルの数は分析された Z 位置の数と等しくなります。CSV ファイルに Mean_Intensity#.csv (# は Z 位置を表す) という名前を付けると、各 CSV ファイルには少なくとも 2 つの列 (POSITION_T と MEAN_INTENSITY または MEAN_INTENSITY_CH1) が含まれます。 注: 目的のセルごとにフォルダを作成します。</li>
		<li>手順2.7.1で作成したBackground_list.csvファイルとフォルダーを1つのフォルダーに保存します。[ ファイルの参照]をクリックして、このフォルダを選択します。 注: Background_list.csv ファイル内の背景値の数は、各ニューロンの Mean_Intensity#.csv ファイルの数と一致する必要があります。</li>
		<li>バックグラウンドファイルは自動的に入力されます。[T 位置の数] に T 位置の最大数を入力します。</li>
		<li>[抽出] をクリックして、各ニューロンの CSV ファイルとプロットを含む結果フォルダーを作成します。CSVファイルには、各t位置での最大蛍光強度とΔF/F0に関する情報が含まれています。プロットは、t位置に対するΔF/F0の折れ線グラフです。 注:この研究では、ΔF / F0は式(1)を使用して計算されました。各z位置の第1の値をF0とした。このF0が適切でない場合20、プラグインは、python_filesフォルダ内の各ニューロンの生データを含むファイルを提供する。</li>
	</ol></li>
	<li>MERGE関数を使用して、各ニューロンのΔF / F 0を平均し、SEMを計算し、t位置の平均ΔF / F0をプロットします。<ol><li>[ファイルの参照]をクリックして、EXTRACT関数によって作成された結果フォルダーを選択します。</li>
		<li>Tポジションの数を Tポジション の最大数で入力します。</li>
		<li>マージをクリックして、merged_data.csvファイルとAverage_dF_F0.pngプロットを含むmerged_dataフォルダを作成します。CSVファイルには、各t位置の平均とSEM ΔF / F0に関する情報が含まれています。プロットは、t位置の平均ΔF/F0の折れ線グラフです。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Omelchenko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cool+and+warm+ionotropic+receptors+control+multiple+thermotaxes+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).</li>
<li>Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expression+atlas+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+identifies+a+molecular+basis+of+carbonation+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4252(2018).</li>
<li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+opponent+thermosensors+use+flexible+cross-inhibition+to+orchestrate+thermal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis.</a> Science Advances. 7 (35), (2021).</li>
<li>Klein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+determinants+of+behavioral+dynamics+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

本研究では、新しいImageJプラグインTACIを開発し、3Dカルシウムイメージングを解析するワークフローを記述した。現在利用可能な多くのツールは、x / yモーションの補正に重点を置いていますが、z軸の動きも明示的に診断または修正する必要があります6。生きている生物の画像取得中、生物が固定化されていてもz軸上の動きは避けられず、温度変化などの何らかの刺激が大きなzドリフトを引き起こすことがよくあります。zスタックの高さを上げると、イメージングプロセス全体で目的のセルを記録できます。ただし、特に個々のセルが複数のZ位置に現れる場合は、Z軸上の動きを分析することは簡単ではありません。そのような動きを無視すると、研究者はこれらの細胞の正確なカルシウム応答を得ることができません。TACIは、すべてのz位置から蛍光シグナルを抽出することにより、zドリフトを補正します。TACI の重要なステップは、各時点で最大値をソートし、それを使用してセルの強度を表すことです。したがって、イメージングプロセス中に関心のある細胞のすべてのz位置を含めることが重要です。さらに、Z 距離と Z 位置が最大値に影響しない...

細胞内カルシウムのレベルは、ニューロンの興奮性の正確なマーカーです。カルシウムイメージングは、細胞内カルシウムの変化を測定して神経活動を理解する1。神経科学の研究は、遺伝的アプローチを通じて特定のニューロンセットで非侵襲的に発現することができるGCaMP 2,3などの遺伝的にコードされたカルシウム指示薬(GECI)を含む細胞内カルシウム濃度を測定するための技術の開発により、この方法をますます使用しています。レーザーと顕微鏡コンポーネントの低コスト化により、カルシウムイメージングの使用も増加しています4。重要なことに、カルシウムイメージングは、自由に動く動物において、単一のニューロンと大きなニューロン集団を同時に記録および研究することを可能にする5。
それにもかかわらず、カルシウム画像化データの分析は、(1)個々の細胞の蛍光の経時的な変化を追跡することを含み、(2)蛍光シグナルが断続的に消失するか、またはニューロン応答とともに再び現れること、および(3)ニューロンがあらゆる方向、特に焦点面に出入りするか、または複数の平面上に現れることがあるため、困難である4、6.手動分析は時間がかかり、記録の長さとニューロンの数が増えるにつれて実用的ではなくなります。カルシウムイメージングの分析プロセスを加速するために、さまざまなソフトウェアプログラムが開発されています。以前は、ソフトウェアは限られた実験コンテキストで設計されていたため、他の研究室がそれを採用することは困難でした。ソフトウェア共有に関する最新の基準を満たすための最近の取り組みにより、異なるグループ間でカルシウムイメージングデータを一貫して分析できるいくつかのツールが開発されました7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .ただし、これらのツールのほとんどはプログラミングの知識を必要とするか、商用ソフトウェアに依存しています。プログラミングの知識とソフトウェアのペイウォールが不足しているため、研究者はこれらの方法を採用することを思いとどまらせています。さらに、これらのツールの多くはx/yモーションの補正に重点を置いていますが、z軸の動きも明示的に診断して修正する必要があります6。zドリフトを示し、複数のz平面に現れるニューロンに焦点を当てた3Dカルシウムイメージングを分析するための計算ツールが必要です。理想的には、このツールはオープンソースソフトウェアを使用し、他のラボが簡単に採用できるようにプログラミングの知識を必要としない必要があります。
ここでは、3Dカルシウムイメージングデータを解析するための新しいImageJプラグインTACIを開発しました。まず、ソフトウェアは必要に応じて名前を変更し、3Dカルシウムイメージングデータをz位置ごとに整理します。目的の細胞は各z位置で追跡され、その蛍光強度はTrackMateまたは他の計算ツールによって抽出されます。次に、TACIを適用してz軸上の動きを調べます。Z スタックの最大値を識別し、それを使用して、対応する時点でのセルの強度を表します。このワークフローは、すべての方向の動きや、横方向(x / y)方向に重なり合っているが異なるz位置に現れるニューロンを持つ3Dカルシウムイメージングの分析に適しています。このワークフローを検証するために、ハエの幼虫の熱感受性ニューロンと脳内のキノコニューロンからの3Dカルシウムイメージングデータセットを使用しました。注目すべきことに、TACIはオープンソースのImageJプラグインであり、プログラミングの知識は必要ありません。

<table><tbody><tr><td>ブラントフィルニーデル</td><td>BD</td><td>303129</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>10035-04-8</td><td>フライ食品成分</td></tr><tr><td>二酸化炭素</td><td>エアガス</td><td>UN1013</td><td>サイズ 200 高圧スチールシリンダー</td></tr><tr><td>CO2 バブラーキット</td><td>ジェネシー</td><td>59-180</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡 LSM880</td><td>ツァイス</td><td>4109002107876000</td><td>5 つのレーザー、2 つの標準 PMT 検出器、32 チャネル GaAsP デクテクター、Airyscan 検出器、およびデフィニストを装備した倒立 Axio Observer Z1フォーカス.2.</td></tr><tr><td>DAQamiソフトウェア</td><td>Measurement Computing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Genesee</td><td>62-113</td><td>フライ食品成分</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ寒天</td><td>Genesee</td><td>66-111</td><td>フライ食品成分</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>64-17-5</td><td>フライ食品成分</td></tr><tr><td>フライライン: Ir21a-Gal4</td><td>Dr. Paul Garrity lab</td><td></td><td>親切な贈り物</td></tr><tr><td>フライライン: Ir21a-Gal80</td><td>Dr. Lina Ni lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フライライン: Ir68a-Gal4</td><td>Dr. Aravinthan DT Samuel lab</td><td></td><td>親切な贈り物</td></tr><tr><td>フライライン: Ir93a-Gal4</td><td>Dr. Paul Garrity lab</td><td></td><td>親切な贈り物</td></tr><tr><td>フライライン:UAS-GCaMP6</td><td>ブルーミントンショウジョウバエストックセンター42750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フライパッド</td><td>ジェネシー59-114</td><td></td><td></td></tr><tr><td>汎用鍛造真鍮レギュレータ</td><td>ーGentec</td><td>G152</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS pH 7.4(1x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>グリーンショウジョウバエチューブ</td><td>ジェネゼー</td><td>59-124</td><td></td></tr><tr><td>熱伝達化合物</td><td>MG Chemicals</td><td>860-60G</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシンク</td><td>Digi-Key Electronics</td><td>ATS2193-ND</td><td>12.9 x 5.5 cm</td></tr><tr><td>イルミネーター</td><td>AmScope</td><td>LED-6W</td><td></td></tr><tr><td>不活性ドライイースト</td><td>ジェネシー</td><td>62-108</td><td>フライフード成分</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Pervical</td><td>DR-41VL</td><td>ライト:ダークサイクル:12h:12h;温度:25度;C;湿度:40-50%RH。</td></tr><tr><td>メチル-4-ヒドロキシ安息香酸</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>126965000</td><td>フライフードingrediete</td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス</td><td>VWR</td><td>&nbsp;48382-126</td><td>22 x 40 mm</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>12-544-2</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>Kleancolor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナローショウジョウバエバイアルGenesee</td><td></td><td>32-113RL</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>420852-9871-000</td><td>LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27</td></tr><tr><td>ペルチェ冷却モジュール</td><td>TE テクノロジー</td><td>TE-127-1.0-0.8</td><td>30 x 30 mm</td></tr><tr><td>プラグ</td><td>Genesee</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>電源</td><td>回路スペシャリスト</td><td></td><td>CSI1802X 10 ボルト DC 2.0 アンペア リニア ベンチ電源</td></tr><tr><td>プリンストン アーティスト ブラシ Nepture</td><td>プリンストン アーティスト ブラシ株式会社</td><td></td><td>シリーズ4750、サイズ2</td></tr><tr><td>酒石酸カリウムナトリウム四水和物</td><td>Thermo Scientific</td><td>033241-36</td><td>フライ食品成分</td></tr><tr><td>ステージインサート&nbsp;</td><td>Wienecke and Sinske</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ61</td><td>任意の実体顕微鏡が機能します</td></tr><tr><td>T-Fitting</td><td>Genesee</td><td>59-123</td><td></td></tr><tr><td>熱電対データ収集装置</td><td>測定コンピューティング</td><td>USB-2001-TC</td><td>シングルチャネル</td></tr><tr><td>熱電対マイクロプローブ</td><td>Physitemp</td><td>IT-24P&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>黄色いコーンミール</td><td>ジェネ</td><td>ゼー62-101</td><td>フライ食品成分</td></tr><tr><td>Z軸ピエゾステージ</td><td>Wieneckeと</td>Sinske432339-9000-000 <td></td><td></td></tr></tbody></table>

taci: 3d カルシウムイメージング解析のための imagej プラグイン

TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis

神経科学の研究は、データセットから包括的な情報を抽出するために複雑なイメージングおよび計算ツールを使用するように進化しました。カルシウムイメージングは、信頼性の高い結果を得るために高度なソフトウェアを必要とする広く使用されている技術ですが、多くのラボは、最新の基準を満たすようにプロトコルを更新する際に計算方法を採用するのに苦労しています。プログラミングの知識とソフトウェアのペイウォールが不足しているために問題が発生します。さらに、目的の細胞は、カルシウムイメージング中にあらゆる方向の動きを示します。横方向(x / y)方向の動きを補正するために、多くのアプローチが開発されています。
この論文では、新しいImageJプラグインであるTrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI)を使用して、3Dカルシウムイメージングのz軸上の動きを調べるワークフローについて説明します。このソフトウェアは、ニューロンが現れるすべてのz位置から最大蛍光値を識別し、それを使用して対応するt位置でのニューロンの強度を表します。したがって、このツールは、横方向(x / y)方向に重なり合っているが、異なるz平面に現れるニューロンを分離できます。ImageJプラグインとして、TACIは3Dカルシウムイメージング分析のためのユーザーフレンドリーなオープンソースの計算ツールです。このワークフローは、温度変動時にあらゆる方向の動きを表示するハエの幼虫の熱感受性ニューロンと、ハエの脳から取得した3Dカルシウムイメージングデータセットを使用して検証しました。

3Dカルシウムイメージング解析のワークフロー 本研究では、新しいImageJプラグインTACIを開発し、zドリフトを追跡し、複数のz位置に現れる個々の細胞の応答を特定する3Dカルシウムイメージングを解析するワークフローについて説明しました(図1)。このツールには、名前の変更、整理、抽出、マージの 4 つの機能があります。まず、イメージ名が ORGANIZE 関数と互換性がない場合、RENAME 関数はイメージ名を必要な構造に変換できます。次に、ORGANIZE 関数は(必要に応じて)グレースケールを作成し、3DカルシウムイメージングTIFFデータをz位置ごとに整理します。同じ Z 位置の画像は 1 つのフォルダーに保存されます。次に、さまざまな画像解析ツールを使用してROIを検出および追跡し、z位置ごとに...

TrackMate カルシウムイメージング分析(TACI)は、z軸の動きを調べ、各zスタックの最大値を特定して、対応する時点での細胞の強度を表す、3Dカルシウムイメージング分析用のオープンソースのImageJプラグインです。横方向(x / y)方向に重なり合うが、異なるz平面上にあるニューロンを分離できます。

TACI: 3D カルシウムイメージング解析のための ImageJ プラグイン

Research in neuroscience has evolved to use complex imaging and computational tools to extract comprehensive information from data sets. Calcium imaging ...

カルシウムイメージングの記録中、細胞はあらゆる方向に移動します。XとYの動きを補正するために多くのツールが開発されていますが、Z軸の動きも明示的に診断して修正する必要があります。TACIは、ユーザーフレンドリーなオープンソースの画像Jプラグインです。Zドリフトをチェックし、全方向の動きで3Dカルシウムイメージングを分析します。ハエの幼虫を準備した後、PBSで3回すすいでください。75マイクロリットルのPBSをスライドガラスの中央にピペットで貼り付けます。1つまたは2つの幼虫をPBSに入れ、熱電対マイクロプローブを幼虫の近くに置きます。幼虫と熱電対のマイクロプローブをガラスカバースリップで覆い、マニキュアで密封します。スライドを顕微鏡ステージに置きます。25倍の対物レンズを使用して焦点を見つけ、熱電冷却器をスライドに配置します。共焦点ソフトウェアでは、目的の蛍光細胞に焦点を合わせます。過飽和を避けるためにレーザー出力を調整し、Zスタック設定で最初と最後のスライス位置を設定します。同時に、Zスタックスキャンと温度記録を開始します。ペルチェに電力を供給する電源を制御して、ペルチェの表面温度を変更します。その後、Zスタックスキャンと温度記録を停止します。TACIカルシウムイメージングドットジャーをダウンロードした後、メニューバーのプラグインをクリックしてフィジーにプラグインをインストールし、ドロップダウンメニューでインストールします。次に、フィジーを再起動し、プラグインをクリックしてTACIカルシウムイメージングを選択してプラグインを実行します。名前変更機能を選択して、TIFF ファイル名を必要な構造に変換します。[フォルダの参照]をクリックしてTIFF画像の名前を変更する必要があるフォルダを選択し、ファイル名が自動的に入力されるのを待ちます フォルダ名を使用.最大T位置と最大Z位置を確認してください。最大T位置と最大Z位置のパラメーター値にすべての桁が含まれていることを確認してください。各パラメータの位置を順番に入力します。TIFF ファイル名にフレーズとチャネルが含まれていない場合は、対応するパラメーター値を空白のままにして、順番に NA を選択します。ポストテキストがある場合は、posttext パラメーターに追加します。[名前の変更] をクリックして同じ名前のフォルダーを作成し、その後に下線を付けます。 R.TIFFファイル名が整理機能と互換性があるようにフォルダー内で再構築されていることを確認してください。次に、整理機能を使用して、TIFF画像を1つのフォルダーの同じZ位置に保存します。[フォルダーの参照] をクリックして、T イメージを整理する必要があるフォルダーを選択します。パラメーター CSV ファイルが存在する場合は、パラメーター値が自動的に入力されるのを待ちます。パラメーター CSV ファイルが存在しない場合は、パラメーター値を手動で入力します。位相とチャネルのパラメーター値に文字が含まれている場合は文字が含まれていることを確認し、T 位置と Z 位置のパラメーター値は T 位置と Z 位置の最大数である必要があります。イメージ ファイル名に位相またはチャネルが含まれていない場合は、NA と入力します。次に、必要に応じて、ボックスRの画像グレーがオフになっていることを確認して、グレースケールTIFF画像を作成します。[整理] をクリックして、同じ名前の後にアンダースコアのグレーの下線スタックが付いたフォルダーを作成し、同じ名前の後にアンダースコアとフォルダー内の Z 位置番号が続くフォルダーを生成します。次に、TIFF ファイルが Z 位置で対応するフォルダーに並べ替えられ、パラメーターとその値が見つかる param dot CSV という名前のファイルが生成されることを確認します。次に、フィジーのトラックメイトを使用して、各Z位置から目的の細胞の蛍光強度を抽出します。フィジーのZポジションフォルダにあるTIFF画像を開き、プラグインをクリックしてトラッキングを選択し、続いてトラックメイトを選択してTRACKMATEを実行します。DOGまたはLOG検出器を使用してパラメータを調整します。BLOB の直径のしきい値と中央値フィルターを変更します。無関係な信号を削除するようにフィルターを設定します。リンクの最大距離、ギャップを閉じる最大距離、およびギャップを閉じる最大フレームギャップを設定します。関心領域の蛍光強度をCSVファイルにエクスポートします。ニューロンごとにフォルダーを作成し、ニューロン番号を使用して名前を付けます。ニューロンゼロから始まります。対応するニューロンの蛍光情報を含むCSVファイルをフォルダに保存します。CSV ファイルに平均強度 Z 位置番号ドット CSV という名前を付け、少なくとも 2 つの列、位置 T と平均強度、または平均強度チャネル 1 を含めます。ニューロンゼロから始まる特定の形式ですべてのニューロンの情報を含む背景アンダースコアリストドットCSVファイルを作成します。ニューロン 0 などのニューロン番号を 1 行目に入力します。次に、分析された各Z位置のバックグラウンド強度を提供します。ニューロン 0 について 4 つの Z 位置を分析する場合は、ニューロン 0 より下の 4 つのバックグラウンド強度値を入力します。作成したバックグラウンドリストドットCSVファイルと蛍光情報のCSVファイルを含むフォルダを1つのフォルダに保存します。TACI を開き、抽出機能を選択します。次に、ファイルの参照をクリックしてフォルダを選択します。バックグラウンドファイルは自動的に入力されます。T 位置の数に対して、T 位置の最大数を入力します。抽出をクリックして、各ニューロンのCSVファイルとプロットを含む結果フォルダーを作成します。CSVファイルには、最大蛍光強度と、各T位置でのデルタゼロに対するデルタFが含まれています。プロットは、Fゼロ対T位置に対するデルタFの折れ線グラフです。マージ関数を使用して、すべてのニューロンからのFゼロに対するデルタFを平均します。SEMを計算し、T位置に対するFゼロに対する平均デルタFをプロットします。ファイルの参照をクリックして、抽出機能によって作成された結果フォルダーを選択します。T位置の数をT位置の最大数で入力します。マージをクリックして、マージされたアンダースコア付きデータCSVファイルと平均アンダースコアDFアンダースコアFゼロドットPNGプロットを含むマージデータフォルダーを作成します。CSV ファイルには、各 T 位置の平均および SEM デルタ F オーバー F ゼロの情報が含まれています。プロットは、T位置上のFゼロに対する平均デルタFの折れ線グラフです。GCaMP six Mを発現するハエ幼生クール細胞のカルシウムイメージングでは、摂氏27度で不活性状態ではほとんど蛍光が見られませんでした。しかし、細胞内のカルシウムレベルは摂氏10度で急速に増加しました。温度を上げるとカルシウムレベルは急速に低下しました。時間0.1でGCaMP six Fを発現するハエ脳ニューロンのカルシウムイメージングは、7つのニューロンのうち4つで蛍光を示し、これらのニューロンの強度は時間とともに減少しました。オクチナールの存在下では、複数のニューロンが明るくなった。10個のニューロンの蛍光は時点92で同時に増加し、これらのキノコニューロンがオクチン臭に応答することを示唆しています。TACI は、重なり合うセルを分離できます。この最大投影画像では、2つの重なり合うニューロンが同定された。これらのニューロンはオルスロビューで分離され、これらのニューロンが異なるZ位置に現れたことを示しています。オレンジ色のセルはZ 7で最も強い信号を示し、青いセルはZ 10で最も強い信号を示しました。これら2つの細胞の蛍光の変化は、オレンジ色の細胞の遅延しているが強い活性化を明らかにした。抽出中、ニューロンが出現するすべてのZ位置からの最大蛍光値を使用して、対応する沈着におけるニューロンの強度を表す。TACIを使用して多数のニューロンを分析する場合、Z位置にわたるいくつかの登録は、蛍光情報で編成されて開発される新しい機能に含まれる必要があります。TACIは、個々の細胞が複数のZ位置に現れるときにZ軸上の細胞の動きをチェックするための、3Dカプセルイメージング分析のためのユーザーフレンドリーなオープンソースの計算アプローチを提供します。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

出典: Lukasz, D., et al.ゼブラフィッシュ幼生における側線有毛細胞のin vivoカルシウムイメージングJ. Vis.

ゼブラフィッシュ幼生の側線有毛細胞におけるカルシウム動態のイメージング

ここでは2次元のタイムラプス画像シーケンス内で正の信号の領域に割り当てられたベストフィット楕円を分類に基づいて、関心の分析プロトコルの新規領域が示されている。このアルゴリズムは、包括的に、最小限のユーザ入力及びバイアスが生理のCa 2 +シグナルを分析するために研究者を可能にすることができる。...

ダイナミックカルシウムの自動分析<sup&gt; 2 +</supイメージシーケンス内の&gt;の信号

ここでは、Ca2+インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP3媒介Ca2+イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。...

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

この論文は、2つの新しいオープンソースImageJプラグイン、Cell Concentration Calculatorと遊走アッセイCounterを通じて、血球計算盤と遊走/浸潤顕微鏡写真の定量化について説明しています。...

ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

本稿では、「クロックスキャン」画像解析用の2つの新しいImageJプラグインについて説明します。これらのプラグインは、オリジナルのビジュアルベーシック6プログラムの機能を拡張し、ImageJフリー画像解析ソフトウェアパッケージにバンドルすることで、大規模な研究コミュニティでプログラムを利用できるようにします。...

画像解析のためのクロックスキャンプロトコル：ImageJ Plugins

このプロトコルでは、線虫みみずの動作における神経活動の変更を記録する遺伝子にエンコードされた Ca2...

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

セグメント化および定量化 ImageJ プラグインを使用して骨の外側の境界に基づく 2 D と 3 D...

外側境界セグメンテーションと Imagej のプラグインで海綿骨の定量化を支援

ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECIs) がどのようにその場で Ca2 +イメージングの実行と根本的に変更されました。そのような録音からのデータ回復を最大限に Ca2 +シグナルの適切な分析が必要です。本プロトコルは、Ca2...

その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

このプロトコルは、麻酔薬を使用したマウスの近くの血管から脳を包み込む周囲細胞からの蛍光カルシウム画像と血流データを取得して分析するステップを提示する。これらの技術は、壁画細胞生理学の研究に有用であり、任意の細胞型のカルシウム過渡症を調査するために適応することができる。...

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

学ぶTACIによる3Dカルシウムイメージング解析法。ImageJプラグインを用いてZ軸方向の細胞運動を補正し、重複する神経細胞の蛍光強度を正確に測定する。神経活動の時系列解析に有用です。

TACI: 3D カルシウムイメージング解析のための ImageJ プラグイン

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