Name: ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶImageJプラグインを用いた細胞計数の自動定量化手法。血球計算盤と遊走・浸潤アッセイの画像解析により、迅速かつ正確な細胞数の算出が可能となる。オープンソースツールで研究効率を向上させる。

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この作業は、カナダ衛生研究所のCP(OR 142730およびOR 89931)の支援を受けました。 ImageJでのバイナリ粒子解析の最初のアイデアを提供してくれたJelena Brkicに感謝します。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

重要なステップ、トラブルシューティング、および制限自動化された計算方法の性質上、粒子解析の特にそれらは、これらの粒子を定義するための数学的能力を必要とします。その結果、細胞濃度の計算および遊走アッセイカウンタの両方の精度が撮影した画像は、細胞試料または遊走アッセイ膜に似ているつまり、どのように密接に、画像の忠実度にすぎなかっ依存しています。したがって、可能な限り最高のような顕微鏡及び関連するソフトウェア較正プロトコルに従う最上重要です。これは、バックグラウンドノイズを制限する不要パーティクルを低減すること、明るく均一に合焦画像を撮影し、TIFFなどの非非可逆ファイル形式で保存含みます。したがって、両方のプラグインは、これらの要件が満たされていない場合、誤った結果を生成する可能性があります。彼らがDOUBにするときの視覚的期待に一致するかどうかを決定するために、常にそのため、二重チェック細胞数にお勧めしますトン。実際の結果が一致しない場合は、二値画像と元の画像を比較すると、この問題（10.4ノートを）解明に役立つことがあります。いくつかのケースでは、より暗い遊走アッセイ画像はカラーしきい値...

インビトロでの細胞計数では、組織培養実験の広い範囲の重要な基本的な技術です。正確に培養物中の細胞の数を決定する実験の再現性および標準化の1,2のために不可欠です。細胞計数は、血球計を用いて、ならびに自動化された方法の様々な独自の利点と欠点3,4,5でそれぞれを使用して手動で行うことができます。細胞計数のための自動化された方法のほとんどは、2つのクラス、コールター原理を使用するか、フローサイトメトリーもののいずれかに属しています。コールターカウンターは、細胞数およびサイズを決定するために、セルの電気抵抗を利用します。彼らは、高速で正確かつフローサイトメーターよりも安くなっています。しかし、彼らはほとんどマニュアルカウント3に比べて、それらのかなりのコストにのみ細胞計数のために使用されていません。フローサイトメーターは、一方で、高価であるが、それらは、細胞計数、細胞形状の解析、STのような多くの用途を有しますructureと内部細胞マーカーに4,5を測定します 。これら2つの原則のいずれかを使用するマシンは、多くのメーカーから入手可能です。自動化された方法は、手動計数のために必要な時間の一部が付属していますが、高価なマシン6を使用しながら手動カウントが手頃な価格が、時間がかかり、バイアスの対象となります。 他の一般的な細胞培養手順は、細胞遊走および浸潤7、すなわち、 インビトロ細胞運動性アッセイです 。遊走および浸潤アッセイは、一般的走化性応答に応答して細胞運動性および侵襲性を調査するために使用されます。さらに、それらは、広く多様な細胞型7-11の胚発生、分化、炎症反応、および転移を研究するために使用されます。遊走アッセイの多孔質膜を通って遊走または浸潤した細胞は、2つの異なる方法で定量することができます。あちこちまず、蛍​​光色素で細胞を染色することにより、解離蛍光リーダ12を用いて膜、および定量化をメートル。定量化のこの方法の制限は、レコードが膜を保持することができない、さらなる分析13のための可能性がないということです。第二の定量法は、クリスタルバイオレット、トルイジンブルー染料またはヘマトキシリンなどの細胞学的染料で、より一般的に蛍光色素またはで固定し、染色する浸潤/遊走した細胞のためのものです。次いで、細胞を、手動で、非常に時間のかかる作業12,13でこれらの膜を倒立顕微鏡画像を使用して定量します。 手動細胞計数の欠点を克服するために、細胞濃度および移動アッセイのための2つの信頼できる正確な自動細胞カウンターを開発しました。これらの自動化されたセルカウンタアルゴリズムは、OracleのJavaコンピュータ言語を使用してプラグインとしてImageJのために開発されました。 ImageJがょんの国立研究所によって開発された公開と広く使用されている画像処理ツールです。LTH（NIH）14,15;このように、ImageJのためにこれらのプラグインを書くこと生物群集への容易な統合を容易にします。 細胞計数の自動化は、手動カウントに比べて高いスループットと再現性を保証します。他の利用可能なソフトウェアやプラグインは、画像解析5,16,17、細胞濃度計算プラグインを介して細胞濃度を計算するために使用することができるが、高速であり、また、細胞および治療の希釈物を処理することができます。また、これら2つのカウンタからのすべての結果と計算が保存され、エクスポートすることができます。このホワイトペーパーで説明する2つのプラグインは、解剖スコープを使用することにより、生細胞イメージングおよび遊走アッセイ膜のための大きな視野（膜全体のキャプチャ）イメージング用の位相差顕微鏡の使用に最適化されています。 http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins：プラグインはからのインストール手順とダウンロードのために自由に利用できます。

<table><tbody><tr><td>HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Cell Cultureing Media&nbsp;</td></tr><tr><td>胎児ボビアン血清(FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>培地供給</td></tr><tr><td>HTR8/SVneo栄養膜細胞株</td><td>細胞は、チャールズ・グラハム博士(女王)から入手しました。s University, Kingston, Canada)</td><td></td><td>ソフトウェアは、あらゆる細胞株で動作するように設計されています。</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>10 & micro で 0.20% (w/v) として調製;M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>革新的な細胞技術</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>10 cm細胞培養プレート</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>任意の組織培養処理プレートが適しています</td></tr><tr><td>トランズウェルポリエステルメンブレンインサート - 8.0&nbsp;&マイクロ;m 細孔径</td><td>Costar 3422 フィッシャーサイエンティフィック7200150から注文</td><td></td><td>24ウェルプレート用;細孔径:8.0&マイクロ;m;直径6.5mm;0.33 cm2成長領域</td></tr><tr><td>HARLECO 血液学の汚れおよび試薬、EMD Millipore - Soluntions 1、2 & 3</td><td>EMD Millipore、VWR</td><td>65044A、B、&から注文C</td><td>Hemacolorの汚れセットは3つの500のmlの(16.9オンス)のポリびん及びメタノールの固定剤(解決1)、エオシンまたは酸の汚れ(解決2)、およびメチレンの青または基本的な汚れを含んでいます(解決3)</td></tr><tr><td>綿の先端を付けられたアプリケー</td><td>ターPuritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>の単一の端の産業かみそりの刃VWR</td><td></td><td>55411-055</td>厚さ<td>:0.30のmmの(0.012")</td></tr><tr><td>顕微鏡のスライド-precleaned/plain</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12550A3</td><td>寸法:25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドカバーグラス-長方形番号1</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545E</td><td>厚さ:0.13〜0.17 mm;サイズ:50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>フィッシャーケミカルパーマウント 取り付け媒体</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>ライカステレオ解剖顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td>マイクロソープにはライカ顕微鏡カメラモデルMC170 HDが搭載されており、カメラソフトウェアはライカアプリスイート(LAS E2)バージョン3.1.1 [ビルド:490]。顕微鏡部品:&nbsp;LED3000スポットライト照明モデル:MEB126、ライカM80光学キャリアモデルM80、対物レンズアクロマート1.0X、WD=90&nbsp;mmモデル:MOB306&対物レンズ アクロマート 0.32X, WD=303&nbsp;mmモデル:MOB315、ビデオ対物レンズ0.5倍モデル:MTU-293</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>アシスタントドイツ&nbsp;</td><td></td><td>0.100 mm 深さ - 0.0025 mm2</sup</td></tr><tr><td>>オリンパス倒立光学顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>CKX41SF</td><td>マイクロソープにはLumenera Infinity 1-2 2.0メガピクセルCMOSカラーカメラが装備されています。カメラソフトウェアは、Infinity analyzeバージョン6.5.2</td></tr><tr><td>層流キャビネット1300シリーズA2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>モデル:1375</td><td>細胞培養作業用の任意の層流キャビネットが適しています&nbsp;</td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>モデル:370</td><td>任意の細胞培養インキュベーターが適しています-細胞は加湿環境下で培養されました、5%CO2、37°;C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Version 1.50e</td><td>必要な最小バージョン</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Version 1.8.0_66</td><td>必要な最小バージョン</td></tr></tbody></table>

imagejのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

健康のImageJの国立研究所は、強力な、自由利用可能な画像処理ソフトウェアスイートです。 ImageJのは、様々な生物学的粒子をカウントするために有効に利用することができる総合的な粒子解析アルゴリズムを有します。セルの多数のサンプルをカウントすると、血球計数器は、時間に関してボトルネックを提示します。同様に、ImageJのプラグインセルカウンターで移行/浸潤アッセイからの膜を数え、正確なものの、非常に労働集約的主観、および手首の痛みを引き起こすための悪名高いです。このニーズに応えるために、我々は、自動血球計数器（または知られているボリューム）と移行/浸潤細胞計数の唯一のタスクのためのImageJ内の2つのプラグインを開発しました。どちらのプラグインは、最小限の背景に高品質の顕微鏡写真を取得する能力に依存します。彼らは、使いやすいとカウントのキャリブレーションを支援する組み込みの分析ツールを持つ大規模なサンプルサイズの迅速な計数および分析のために最適化されています。コア原理を組み合わせることにより自動化された計数アルゴリズムおよびポスト計数分析による細胞カウンタのsが、これは非常に遊走アッセイ精度を失うことなく処理することができる容易さを増大させます。

細胞濃度の計算 図1は、CCCのキャリブレーションと可算画像取得の全体的なプロセスを提示しています。 図1Aおよび1Bは 、ピクセル単位でP-正方形の長さのP-正方形のキャリブレーション画像や計算を示しています。 CCCは、式を使用して、指定されたボリューム内の細胞濃度を決定します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1.jpg" />血球計数器のP-四角は100 nLの（X 0.1ミリメートル1ミリメートル×1ミリメートル）の容積を有しており、この一定の与えられた、総画像ボリュームはミリメートルにピクセルを変換し...

この論文は、2つの新しいオープンソースImageJプラグイン、Cell Concentration Calculatorと遊走アッセイCounterを通じて、血球計算盤と遊走/浸潤顕微鏡写真の定量化について説明しています。 さらに、画像取得とキャリブレーションのプロトコルについて説明し、プラグインの入力要件についても詳しく説明します。

ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

このプロトコルの全体的な目標は、デジタル解析ツールを使用して、懸濁液中または浸潤アッセイメンブレン内の移動中の細胞の正確なカウントを迅速に行うことです。このプロトコールは、研究者が一般的な技術やin vitro細胞運動アッセイに必要な細胞数を定量するのに役立ちます。この方法の主な利点は、複数のフィルターと解析ツールを含めながら、高速で正確な細胞数を提供できることです。まず、顕微鏡の照明を最大に設定します。4倍対物レンズに切り替えて、位相コントラストフィルターが使用中であることを確認します。次に、顕微鏡ソフトウェア内で、画像キャプチャ設定をデフォルト値に設定します。次に、標準的な血球計算盤を顕微鏡ステージに置き、画像量キャリブレーションステップの画像をキャプチャします。必要に応じて露光時間を調整します。ImageJの細胞濃度計算機の下で、画像を開き、画像寸法を取得ボタンをクリックします。このアクションは、画像の幅と高さのテキスト ボックスに、ピクセル単位の画像解像度を入力します。次に、直線ツールを選択し、カーソルをクリックしてドラッグすることにより、血球計算盤の主p平方の全長にわたって直線を引きます。次に、Mキーを押して結果ウィンドウを表示します。次に、長さ列の値をセル濃度計算機のp二乗の長さテキストボックスに入力します。次に、をクリックします 画像ボリュームを計算する ボタンをクリックして、画像のボリュームを画像ボリュームテキストボックスに出力します。最後に、[保存]ボタンをクリックして、プラグインのキャリブレーションを完了します。サンプル分析では、10マイクロリットルの細胞を血球計算盤スライドの両チャンバーにロードし、細胞の内部が細胞膜よりも暗くなるように焦点を調整して、極ではなく細胞の中央断面内に焦点を合わせます。次に、細胞が露出オーバーにならないように、露出をさらに調整します。わずかに見える血球計算盤のラインは許容されます。次に、血球計算盤の中央領域の重なり合わない画像を5〜10枚キャプチャします。各画像の解像度と倍率は、ボリューム キャリブレーション イメージの場合と同じである必要があります。次に、細胞濃度計算機で[Count Cells]をクリックし、ポップアップウィンドウでカウントするフォルダを選択します。次に、サンプル番号の入力ボックスに、チャンバーごとに撮影された画像の数を入力し、[OK]をクリックします。プラグインはデータを収集するようになりました。詳細については、テキストを参照してください。まず、顕微鏡ソフトウェア内で、画像キャプチャ設定をデフォルト値に設定します。解剖スコープのステージには、白一色の背景を使用し、ステージ上の光源、できれば2つの柔軟なLEDライトを使用します。次に、完成したマイグレーションアッセイメンブレンスライドをステージに置きます。ソフトウェアによって表示されるリアルタイム画像を見て、単一の膜の端がカメラの視野内にちょうど来るように倍率を手動で調整します。次に、光源の位置と露光時間を調整して、理想的な画像をできるだけ忠実に再現します。背景色が最小限に抑えられ、膜が均一に照らされています。細胞計数の精度は、高品質の画像取得にかかっています。したがって、プラグインを最も効率的に使用するには、ユーザーのカメラで達成可能な最高の画像をキャプチャすることが重要です。次に、スライドを取り外し、顕微鏡ソフトウェアで画像をホワイトバランスしてキャリブレーションを完了します。イメージングの直前に、カバースリップに圧力を加えて各メンブレンを平らにし、閉じ込められた気泡をできるだけ多く取り除きます。次に、ソフトウェア内で、キャプチャフォルダの場所を設定します。次に、メンブレンごとに 1 つの画像をキャプチャし、サンプル 001 の命名規則を使用して画像ファイルを TIF として保存し、各画像の数を増やします。この命名規則は、プラグインがファイルを見つけるために必要です。フラットフィールド補正が必要な場合は、スライドごとに空白の領域を見つけて空白の画像を撮ります。ファイルをサンプル名空白として保存します。次に、ImageJでTCプラグインを開きます。TC内でFlatfieldボタンをクリックし、Choose Directoryダイアログボックスからメンブレン画像を保存したフォルダを選択します。次に、移行アッセイメンブレン画像を開き、Color Thresholdを選択します。ウィンドウで、メソッドを Shanbhag に設定します。しきい値の色を白に設定します。色空間をRGBに設定し、暗い背景オプションのチェックを外します。次に、上部のスライダーを 0 に、下部のスライダーを 255 に調整して、画像を完全に白くします。白くなったら、原子核だけが見えるまで緑と赤のスライダーを調整します。TC プラグインで、RGB スライダーの値を、関連する構成設定の RGB しきい値テキスト ボックスにコピーします。次に、[追加/変更] ボタンをクリックして、設定を上書きします。構成設定パネル内で、[保存] をクリックして設定をハード ドライブに書き込みます。次に、TCプラグインで画像をカウントするには、[Count Folder]をクリックして、カウントするフォルダを選択します。その後、プログラムは画像を処理し、データをメインテーブルに自動的に追加します。さて、メインテーブルで、キャリブレーションにチェックマークが表示されますか?画像内の列には、理想的なメトリックとの類似性に基づいてキャリブレーションのフラグが付けられます。キャリブレーションのフラグが付けられたすべてのサンプルを選択します。次に、右クリックして[再カウント]と[推奨サイズ]を選択します。これにより、推奨される最小粒子面積で画像が再カウントされます。次に、もう一度右クリックして[プロットの表示]を選択します。理想的な画像には、長い右裾正規分布に似たグラフがあります。必要に応じて、サンプルを選択して右クリックし、[再カウント]と[手動設定]を選択して、小さいサイズ範囲またはRGBしきい値の設定を調整します。次に、必要な設定を入力し、[カウント]をクリックして画像を再カウントします。カウントを手動で調整するには、サンプルを選択し、テーブルを右クリックして、[カウントで画像を開く] を選択します。元の画像は、プラグインによってカウントされた各パーティクルを表す赤いマークで開きます。さらに、[カウントされたバイナリ画像を表示]オプションを使用して、個々のセルが色のしきい値によってどの程度適切に解決されているかを確認できます。カウントを手動で追加するには、Control キーを押しながら左クリックします。これにより、カーソル位置にマーカーが追加され、合計カウントに追加されます。マーカーを手動で削除するには、画像を右クリックすると、プラグインがカーソルに最も近いマーカーを削除します。マーカーのグループを削除するには、関心のある領域を選択し、Control キーを押しながら領域を右クリックします。細胞濃度計算機のプロセスは、p-squareキャリブレーション画像とp-squareの長さとピクセルの計算に依存します。血球計算盤のp平方の体積は100ナノリットルであり、この定数を考えると、ピクセルをミリメートルに変換した後に総画像体積を計算できます。さまざまな実験や細胞タイプから採取した57枚の画像について、手動と自動のカウントを比較すると、両手法の間には非常に密接な相関関係があることがわかります。ミリリットルあたり500万から2,000個の細胞の濃度が、自動化されたプロセスを使用して正確にカウントされました。メトリック Q は、異なる粒子サイズの分布に基づく全体的な画像の鮮明さを表します。適切な Q が 0.5 より大きい。これらの修飾子を、明るさとバックグラウンドノイズに関して中程度の画像から優れた画像の選択に適用したところ、キャリブレーションされた画像カウントは、キャリブレーションされていない画像カウントよりも手動カウントに有意に近かった。このビデオを見れば、CCCおよびTC ImageJプラグインを使用して、懸濁液中の細胞および細胞運動性アッセイから細胞を正確かつ効率的にカウントする方法を十分に理解できるはずです。TCプラグインを習得すると、セルカウントの取得、定量化、調整を1時間以内に行うことができます。どちらのプラグインも ImageJ のパーティクル カウント機能に依存しており、ImageJ で使用されるマクロを編集することで変更できます。これにより、ユーザーはプラグインの範囲を他のパーティクルに拡大する柔軟性が高まります。

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Biology

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本稿では、1)焦点接着のサイズと数および2)細胞形状指標およびMCF7細胞のコンラエント単層の共焦点画像からの分布の定量化について説明する。...

MCF7細胞単層における細胞基質接着面積と細胞形状分布の定量化

我々は、細胞数を識別するために一般化可能な領域ベースの画像解析アプローチを利用する方法を提示する。異なる細胞集団の分析は、適応アルゴリズム内の異なる細胞型間の有意な細胞高さおよび構造の違いを利用した。...

マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム

Caenorhabditisエレガンスにおける自動包接計数を用いた生体内のタンパク質凝集動態のモニタリング

この方法は、96ウェルプレートフォーマットを使用してコロニー形成単位(CFU)をプレート化し、ハエホモジネートサンプル全体の ショウジョウバエ...

ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント

この記事では、さまざまな細胞密度で検証されたオープンソースの実行可能プログラムを使用して、画像ベースの核定量を自動化する方法を段階的に説明します。このプログラムは、コスト、技術的なスキルセットが限られているユーザーのアクセシビリティ、および既存のテクノロジーの有用性を制限する可能性のあるアプリケーション固有の検証に関連する障壁に対処する代替手段を提供します。...

コンピュータビジョンライブラリを使用して核の定量を効率化

学ぶImageJプラグインを用いた細胞計数の自動定量化手法。血球計算盤と遊走・浸潤アッセイの画像解析により、迅速かつ正確な細胞数の算出が可能となる。オープンソースツールで研究効率を向上させる。

ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

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