Typha latifolia(ガマ)の培養と微生物のバイオオーグメンテーションのための最適化された方法

私たちの研究は、種子からガマを育てるためのプロトコルの欠如に対処しています。私たちは、将来の植物微生物研究を支援するために、種子発芽、初期成長、微生物の生物増強のための再現可能な手法を開発しました。種子からガマを栽培したり成熟まで追跡したりする研究はほとんどありませんが、ガマは湿地修復研究で一般的に使用されています。

ほとんどのガマ研究は、実験室でのガマの繁殖のために根茎を購入します。種子からガマを育てる研究は少なく、標準化された方法も残っていません。外来微生物の安定した発芽と持続的な定着を達成することは大きな課題でした。

私たちは種子発芽と微生物生物増強のための再現可能な方法を開発し、早期接種が長期的な定着を支援することを示しています。まず、庭の剪定ばさみを使ってTypha latifoliaの茎を花序の基部から約2センチメートルのところで切ります。花序から種を剥がし、実験室ブレンダーに移して、ブレンダーが約1/4まで満たされるまで移します。これは約250ミリリットルの未圧縮種子に相当します。

次に、500ミリリットルの水道水をブレンダーに注ぎ、10センチのヘッドスペースを保ちます。混合物を中低速で20秒間ブレンドし、すぐに粘度の高い成分を1リットルのビーカーに移します。約100ミリリットルの種子水混合物をミキサーに戻します。

次に、新鮮な水道水を400〜600ミリリットル加え、中速で20秒間ブレンドします。中身を新しい1リットルのビーカーに注ぎます。次に、最大800ミリリットルの水道水をビーカーに注ぎます。

60秒置いた後、底に沈んだ種を乱さずに上から漂っているスラッジをすくい取ります。残りの水をゆっくり注ぎ、種を100ミリリットルのビーカーに移します。残った種子水のスラッジも同じように混ぜます。次に、分離した種を入れたビーカーをかき混ぜ皿に置きます。

かき混ぜた後、ビーカーの表面から浮いている植物の残渣をすくい取ります。種をフィルターペーパーを掃除機に取り付けたブフナーの漏斗に注ぎ、一晩乾かします。乾燥種子は50ミリリットルの円錐形ポリプロピレン管で20度の温度で保存します。

半分の強度のムラシゲとスクーグのメディアプレートを1%のフィトアガーで準備します。乾燥種子の約1ミリグラムを15ミリリットルの円錐形ポリプロピレン管に移します。次に、チューブに10ミリリットルの滅菌二重蒸留水を加えます。

チューブを中高速で軌道シェーカーに10分間置きます。次にチューブから水を取り出し、滅菌された二重蒸留水で調製した0.1%ポリソルビン酸20溶液を5ミリリットル加えます。チューブを中高速で10分間振ってください。

ポリソルベート20の溶液を除去します。その後の手順はすべて炎または層流フードの前で行います。溶液を、滅菌二重蒸留水で調製した30%市販漂白剤と0.025%ポリソルビン酸20溶液を5ミリリットルに置き換えます。

上澄液を無菌の二重蒸留水に置き換えてください。その後、チューブを中高速で5分間振る。3回目のすすぎ後、チューブを低速で24時間回転させて発芽を促します。

翌日、余分な水分を取り除き、チューブ内に3ミリリットルの液体が残るようにしてください。次に無菌的に、1000マイクロリットルのプラスチックピペットの先端を切ります。切断したピペットの先端を使って、勢いよくピペットをピペットに吸い込み、先端内に種を懸浮させます。

種子と液体を半濃度のムラシゲとスクーグ寒天のプレートに盛ります。皿を優しく回して種を均等に広げます。プレートを実験室用のシーリングフィルムで包み、23度摂氏、湿度70%の16時間光と8時間暗光サイクルの成長室に入れます。

ガマの種に接種するには、示された通りポリソルベート20漂白剤と二重蒸留水で種子を滅菌してください。600ナノメートルで一晩培養したルテイモナス分離株の光学密度を測定してください。培養培地で希釈して吸収度1.0に正規化します。

次に、培養液1ミリリットルを9、300Gで2分間遠心分離します。上澄液を取り除き、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸浮させます。遠心分離して再び上澄液を除去した後、細菌ペレットを1ミリリットルの無菌二重蒸留水に再懸浮させます。

滅菌種子を使用し、同じチューブ内で0.025%の有機シリコーン界面活性剤で1〜10希釈します。種が発芽する前に、低速で24時間懸濁液を振ってください。まず、水道水で湿らせた選んだ土壌を無菌植物成長室に充填します。

ルアーロックの先端をアルミホイルで覆い、液体サイクルで20分間オートクレーブ処理します。次に、無菌条件下で0.2マイクロメートルのフィルターユニットを成長チャンバーのルアーロックコネクタに接続します。チャンバーを開けて、土壌に1%×20×20の滅菌済み肥料を500マイクロリットル追加します。

土を無菌ヘラで混ぜながら、同時に無菌の二重蒸留水を加えて、土壌が過剰に飽和しないように水分を保ちます。次に、滅菌カミソリの刃で、弱い古い苗が一つ入ったプレートからムラシゲとスクーグ寒天を四分割します。無菌ヘラを使って、苗を含む寒天の断片を成長室の準備土壌に移します。

成長室ユニットを植物成長インキュベーターに移し、16時間の光と8時間の暗いサイクルで、23度C、70%湿度で設定します。Typhaの種子を完全に傷つけると種子成分が目に見えて分離され、不完全な瘢痕化はくちばしが付着したまま残り、傷が取られていない種子はそのまま残りました。無菌水耕栽培システムは、ガマやJuncus種(ここではJuncusとして画像化)の成長を支え、最大1年間無菌システム内で維持されました。

30%漂白剤およびポリソルベート20法を用いて、20.8%の最高種子発芽率が観察され、これは1時間塩素ガス法を除くすべての他の殺菌処理よりも有意に高かったもので、1時間塩素ガス法は完全な種子滅菌を達成できませんでした。瘢痕化から7日後、発芽中のTyphaの苗は非無菌のペトリプレート環境で目に見えるラジカルと芽組織を発達させました。土への移植後、タイファの苗の一部は1〜2週間以内に無事に定着し、新しい芽組織を産生しました。

DsRedプラスミドを携帯したルテイモナ属への接種後、接種後16日目にTyphaの苗の根全体に赤色蛍光細菌の定着が観察されました。